CYP450表氧化酶/EET代謝途徑通過HIF-1α減輕肥胖小鼠脂肪炎癥*

焉曉乘， 牟維娜， 強 曄， 趙蕙琛， 孫 琦，2， 姚曉敏，3， 張玉超， 劉元濤△

（1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東青島266011；2青島市膠州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東青島266300；3日照市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東日照276826）

目前糖尿病及肥胖呈全球流行趨勢。肥胖與糖尿病密切相關(guān)，其病理生理機制尚不清楚，因此，脂肪組織生物學(xué)的研究引起廣泛關(guān)注。研究證實脂肪組織不僅是惰性的脂肪儲存庫，還是重要的內(nèi)分泌器官［1］，可通過自分泌及旁分泌的方式釋放多種細胞因子［2］，參與局部和系統(tǒng)的代謝及炎癥過程，調(diào)節(jié)外周組織對胰島素的敏感性，參與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的發(fā)生發(fā)展［3］。同時，脂肪細胞過度膨脹，導(dǎo)致脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)脂肪細胞與巨噬細胞表達促炎癥因子、巨噬細胞浸潤、脂肪細胞壞死等，進一步加重脂肪組織的炎癥程度。

環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）為花生四烯酸（arachidonic acid，AA）經(jīng)細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）表氧化酶催化生成的代謝產(chǎn)物［4-5］，其中 11，12-EET 和 14，15-EET是多數(shù)細胞和血管中EETs的主要存在形式，具廣泛的生物效應(yīng)，如抗炎及促進血管再生［6-7］。我們的前期研究證實，糖尿病小鼠組織中CYP450表氧化酶CYP2J2表達顯著降低，EETs可顯著促進糖尿病小鼠血管再生，抑制組織炎癥反應(yīng)［8］。還有研究提示EETs在肥胖和IR等方面發(fā)揮重要作用［9］。CYP2J2/EET途徑在IR中的作用日益受到關(guān)注［10］，但是相關(guān)機制目前國內(nèi)研究較少。根據(jù)已有研究，我們推測CYP450/EET代謝通路可能通過促進血管生成作用減輕肥胖誘導(dǎo)的慢性炎癥及IR，并通過設(shè)計動物實驗進行驗證。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠40只，3周齡，體重（19±1）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。每籠5只飼養(yǎng)在SPF級動物房中，每日光照12 h。自由飲食飲水。

2 主要試劑

11，12-EET 和 14，15-環(huán)氧二十碳-5（Z）-烯酸［epoxyeicosa-5（Z）-enoic acid，EEZE］購于 Cayman；兔抗 CD31（1∶300）購于 Abcam；兔抗 CYP2J2（1∶1 000）、鼠抗GAPDH（1∶5 000）及小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 ELISA試劑盒購于Proteintech；鼠抗低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α；1∶500）購于EMD Millipore；Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×）購于 Cell Signaling Technology；小鼠胰島素高敏ELISA試劑盒購于Arigo Biolaboratories。

3 主要方法

3.1 肥胖模型構(gòu)建及分組 將小鼠分為普通飼料組和高脂飼料組，分別喂飼普通飼料和高脂飼料（脂肪提供熱量的40%）。每7 d測定小鼠體重，當(dāng)高脂飼料組小鼠體重超過普通飼料組小鼠30%，確定為肥胖小鼠成功建模。將肥胖小鼠又隨機分為：肥胖（obesity，OB）組（生理鹽水腹腔注射，n=10）、EET組（0.1 g·kg-1·d-111，12-EET 腹 腔 注 射 ，n=10）［11］和EEZE組（0.1 g·kg-1·d-114，15-EEZE腹腔注射，n=10）［12］。普通飼料組小鼠腹腔注射等量生理鹽水作為正常對照（normal control，NC）組（n=10）。干預(yù)第7天禁食8 h后于眼眶靜脈叢取血，靜置30 min后分離血清。最后處死小鼠，取附睪和腎周脂肪置于4%組織細胞固定液固定或液氮內(nèi)保存。

3.2 ELISA實驗測定小鼠血清炎癥因子水平 參照ELISA試劑盒說明書，按順序加入小鼠血清和試劑盒試劑孵育，洗板后加入檢測抗體孵育1 h，加入鏈霉素親和的辣根過氧化物酶抗體孵育，最后加顯色底物。加入終止溶液終止反應(yīng)后立即使用酶標(biāo)儀讀取波長450 nm的吸光度（A）。用ELISA Calc軟件擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品的A值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)?；貧w分析求出最好的擬合曲線，濃度和A值取對數(shù)擬合。依照擬合的回歸曲線來求出小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

3.3 胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）的測定 根據(jù)ELISA試劑盒說明書對血清樣品進行處理，計算小鼠血清胰島素水平。HOMA-IR=空腹血糖水平（mmol/L）×空腹胰島素水平（mU/L）/22.5。

3.4 Western blot實驗 用預(yù)冷的RIPA裂解液提取附睪脂肪組織蛋白。應(yīng)用10%SDS-PEAG后，轉(zhuǎn)模1.5 h，室溫脫脂牛奶封閉1 h，4℃I抗孵育過夜，室溫II抗孵育1 h，充分洗膜后ECL顯像。ImageJ 1.42定量分析結(jié)果。

3.5 免疫組化分析 脂肪組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（組織厚度為5μm）、脫蠟和水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后，加入I抗4℃孵育過夜，室溫II抗孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢拍照并掃描圖片，DAB標(biāo)記陽性結(jié)果顯示棕黃色。用QuantCenter 2.1軟件（3DHISTECH）分析抗體陽性表達程度，使用組織化學(xué)評分（histochemistry score，H-SCORE）對組織染色進行半定量分析。組織學(xué)評分方法：將每張切片內(nèi)陽性的細胞數(shù)量及其染色強度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值。H-SCORE=（percentage of cells of weak intensity×1）+（percentage of cells of moderate intensity × 2）+（percentage of cells of strong intensity× 3）。

3.6 RT-qPCR檢測脂肪組織HIF-1α的mRNA水平 取10 mg附睪脂肪組織，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作提取總RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入擴增反應(yīng)體系運用RT-qPCR法擴增，40個循環(huán)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測目的基因的mRNA相對表達水平。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR相關(guān)引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 1.0.0.1246軟件統(tǒng)計分析，各測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EET可以降低肥胖小鼠胰島素抵抗水平

與NC組相比，OB組HOMA-IR顯著升高（P＜0.05）；與OB組相比，EET組HOMA-IR顯著降低（P＜0.01），EEZE組HOMA-IR無顯著差異；EEZE組HOMA-IR顯著高于EET組（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Treatment with EET attenuated insulin resistance in obese mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.圖1 EET可以降低肥胖小鼠胰島素抵抗水平

2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表達水平顯著降低

Western blot結(jié)果顯示，OB、EET和EEZE組小鼠附睪脂肪組織CYP2J2蛋白表達水平均較NC組顯著降低（P＜0.01），其余組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

Figure 2 The protein expression levels of CYP2J2 in epididymal adipose tissues of obese mice were significantly reduced compared with normal C57BL/6JCnc mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group.圖2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表達水平顯著降低

3 EET可以減輕肥胖小鼠脂肪組織缺氧程度

為評估各組小鼠組織缺氧程度，我們檢測了小鼠附睪脂肪組織中HIF-1α蛋白的水平。與NC組相比，OB組HIF-1α表達水平顯著升高（P＜0.01）；與OB組相比，EET組HIF-1α蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與EET組相比，EEZE組HIF-1α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖3A。但4組小鼠附睪脂肪組織HIF-1α mRNA水平無顯著差異，見圖3B。

Figure 3.Treatment with EET attenuated the anoxic conditions in epididymal adipose tissues of obese mice.A：Western blot for determining the protein level of HIF-1α；B：real-time PCR for determining the mRNA level of HIF-1α.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.圖3 EET可以減輕肥胖小鼠脂肪組織缺氧程度

4 EET可降低肥胖小鼠體內(nèi)炎癥因子水平

檢測小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β水平，結(jié)果顯示，OB組小鼠血清炎癥因子水平顯著高于NC組（P＜0.05）；EET干預(yù)7 d后，小鼠血清中4種炎癥因子水平與OB組相比顯著下降（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Administration of exogenous EET resulted in reduced production of inflammatory cytokines in the serum of obese mice.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.圖4 EET可以降低肥胖小鼠體內(nèi)炎癥因子水平

5 EET可以促進肥胖小鼠脂肪組織血管生成

使用CD31標(biāo)記附睪脂肪組織中血管樣組織以檢測EET干預(yù)后小鼠附睪脂肪組織的血管生成情況。CD31染色如圖5箭頭所示，與NC組比較，OB組CD31蛋白量減少，EET組CD31染色水平接近NC組。圖像統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在藥物干預(yù)第7天，與NC組相比，OB組小鼠的H-SCORE顯著降低（P＜0.05），EET組H-SCORE值與NC組持平；與OB組相比，EET組H-SCORE顯著升高（P＜0.05）。

Figure 5.EET promoted angiogenesis in epididymal adipose tissues of obese mice.At day 7 after drug treatment，vessel-like structures（CD31-positive）in epididymal adipose tissues were observed by immunohistochemistry（left：scale bar=500 μm；right：scale bar=50 μm），and histochemistry score（H-SCORE）of CD31 was calculated.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.圖5 EET可以促進肥胖小鼠脂肪組織血管生成

討 論

既往研究表明CYP450/EET途徑對胰腺細胞功能及外周組織對胰島素的敏感性有重要影響。5，6-EET可刺激大鼠離體胰島分泌胰島素，過表達CYP2J2或可溶性環(huán)氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）抑制劑可顯著減輕小鼠外周IR及代謝功能障礙［13-15］。臨床研究顯示，2型糖尿病患者循環(huán)EET代謝產(chǎn)物的血漿濃度是降低的［16］；大鼠實驗研究顯示，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠腎臟CYP450表達降低［17］，提示CYP450/EET途徑障礙可能與糖尿病的發(fā)生及進展有關(guān)。肥胖（尤其是向心性肥胖）是糖尿病發(fā)生的重要危險因素之一。目前研究認為肥胖狀態(tài)下，脂肪炎癥可能是導(dǎo)致IR的重要原因，但具體機制尚不明確。本研究旨在探索CYP450/EET通路與肥胖誘導(dǎo)的脂肪炎癥及IR的關(guān)系并探討其機制。

大量證據(jù)表明，炎癥是IR的重要原因。炎癥因子通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）系統(tǒng)，抑制胰島素的磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）通路，干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR［18］。巨噬細胞和白細胞代謝生成的細胞因子（如TNF-α等）可激活內(nèi)皮細胞，促進細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）的表達，而CAMs是一類位于細胞膜表面的糖蛋白，是炎癥的誘導(dǎo)劑［19］。有研究報道，11，12-EET是對血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達最強的抑制劑［20］。NF-κB是一種廣泛存在于各種細胞中的轉(zhuǎn)錄因子，因其能與免疫球蛋白κ鏈基因增強子結(jié)合而得名。激活的NF-κB可促進許多致炎因子的轉(zhuǎn)錄和表達，被作為炎癥治療的“靶點”。另有研究表明，sEH抑制劑可抑制NF-κB活性，減少炎癥細胞浸潤［21］。注射外源性EETs可抑制NF-κB的活化和轉(zhuǎn)位，從而顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠頸動脈內(nèi)皮細胞VCAM-1的表達，減少單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附［20］。缺氧條件下，CYP2J3/EETs可能通過抑制caspase-3蛋白表達及活性調(diào)節(jié)心肌細胞活力［22］，而11，12-EET可激活肝臟細胞與動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)缺氧反應(yīng)元件的啟動子活性，誘導(dǎo)HIF-1α穩(wěn)定表達?？梢姡珻YP450/EET通路與缺氧導(dǎo)致炎癥反應(yīng)有關(guān)［23］。

為探討CYP450/EET代謝通路與肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥的關(guān)系，我們首先檢測了CYP450表氧化酶在肥胖小鼠脂肪組織中的表達，其中CYP2J2蛋白表達水平顯著降低。為明確CYP2J2下調(diào)與脂肪炎癥的相關(guān)性，我們觀察了外源性EET對脂肪炎癥的影響，結(jié)果顯示肥胖小鼠脂肪組織中炎癥因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-β表達顯著增多，外源性11，12-EET治療可以顯著降低脂肪組織中炎癥因子的表達水平，而EET拮抗劑14，15-EEZE則導(dǎo)致各種炎癥因子顯著增加。以上結(jié)果提示CYP450表氧化酶表達減少可能是肥胖狀態(tài)下脂肪炎癥的重要因素之一。

缺氧是導(dǎo)致炎癥的重要因素之一。本研究觀察到，與正常小鼠相比，肥胖小鼠附睪脂肪組織中HIF-1α蛋白表達水平升高，提示肥胖誘導(dǎo)的脂肪炎癥可能與缺氧有關(guān)。為探討CYP450/EET對炎癥的影響機制，我們觀察了外源性EET對血管形成及缺氧的影響。結(jié)果顯示，EET干預(yù)的肥胖小鼠脂肪組織中CD31陽性率顯著增增加，而HIF-1α蛋白表達顯著下降。上述結(jié)果提示，EET可通過促進脂肪組織血管生成，緩解缺氧，從而抑制組織炎癥。

綜上所述，本研究提示CYP450表氧化酶低表達可能是肥胖誘導(dǎo)IR的重要原因，外源性EET可顯著減輕肥胖導(dǎo)致的IR，其作用機制可能與促進血管生成、緩解缺氧、減輕炎癥有關(guān)。