姜黃素對MRL/lpr狼瘡性腎炎小鼠的作用及機(jī)制研究*

劉 謂， 戴 暉， 安樂美， 閻 磊， 邵鳳民△

（1河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南鄭州450003；2新疆哈密紅星醫(yī)院腎內(nèi)科，新疆哈密839000；3河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州450003）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以淋巴細(xì)胞異?；罨a(chǎn)生大量自身抗體并累及多系統(tǒng)、多器官的慢性自身免疫性疾?。?］。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是造成SLE患者死亡的主要原因［2-3］。目前臨床上常采用激素和免疫抑制劑治療LN，改善患者預(yù)后，但仍有部分患者最終進(jìn)展為終末期腎病［4］。目前研究認(rèn)為，免疫調(diào)節(jié)失衡和、炎癥等是LN的重要發(fā)病機(jī)制［5］，因此尋找新的、有效的治療方法調(diào)節(jié)免疫功能并控制炎癥反應(yīng)，對治療LN、改善病情及預(yù)后具有重要意義。姜黃素（curcumin，Cur）是一種多酚類中藥單體，具有抗炎、抗氧化、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，已被廣泛用于治療各種疾?。?-8］。本研究擬觀察Cur對MRL/lpr小鼠的影響及其可能機(jī)制，為臨床治療LN提供新的思路。

材料與方法

1 試劑

姜黃素純度為99%，購自Sigma；血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）檢測試劑盒及炎癥因子ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；抗p-IκB、NF-κB、NLRP3、caspase-1、核仁纖維蛋白（fibrillarin）和GAPDH抗體購于Abcam。

2 方法

2.1 動物分組與處理 10只C57BL/6小鼠及30只MRL/lpr小鼠，雌性，體重（20±2）g，10周齡，購于上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司。所有動物實(shí)驗均經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。將MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為MRL/lpr組（灌胃等體積生理鹽水）及Cur低、高劑量組（Cur-L和Cur-H組，分別給予100和200 mg/kg Cur灌胃處理），每組10只；C57BL/6小鼠為正常對照（normal control，NC）組（灌胃等體積生理鹽水）。灌胃均每天1次，連續(xù)12周。

2.2 尿蛋白檢測 分別于處理前及處理后每2周留取各組小鼠的尿液進(jìn)行尿蛋白檢測。將尿液稀釋10倍后，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測尿液中的蛋白含量，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀（波長562 nm）測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計算樣品的蛋白濃度。

2.3 SCr及BUN水平的測定 最后一次給藥2 h后，麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠，而后眼球取血，離心后取血清，-80℃凍存。采用全三硝基苯酚比色法和脲酶法分別測定SCr和BUN水平，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠取血完成后迅速于冰臺上解剖取腎組織，部分腎組織于4%的甲醛溶液固定，乙醇洗脫后進(jìn)行石蠟包埋，制備成2μm左右的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織的形態(tài)學(xué)變化。按照Austin等［9］的方法，隨機(jī)選取50個腎小球，對其進(jìn)行腎小球增生和中性粒細(xì)胞浸潤分析。

2.5 ELISA檢測炎癥因子及抗dsDNA水平 取部分新鮮腎組織，制成勻漿，4℃離心15 min，取上清液進(jìn)行炎癥因子檢測。ELISA試劑盒檢測血清和腎臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平及血清中抗dsDNA的含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。

2.6 Western blot實(shí)驗 取部分腎組織，采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，然后再分別采用細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取腎組織核蛋白和胞漿蛋白，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。其中總蛋白用于檢測NLRP3和caspase-1蛋白水平，胞漿蛋白用于檢測p-IκB蛋白水平，胞核蛋白用于檢測胞核NF-κB蛋白表達(dá)。BCA法測定蛋白濃度后，取40μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)到PVDF膜，采用脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加I抗［抗p-IκB、NLRP3、caspase-1、NF-κB、GAPDH（胞漿蛋白內(nèi)參照）和fibrillarin（胞核蛋白內(nèi)參照）抗體，均1∶1 000稀釋］4℃孵育過夜。然后加入HRP標(biāo)記的II抗IgG（1∶2 000），室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯影后采用ImageJ計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素對MRL/lpr小鼠尿蛋白含量的影響

各組小鼠各時點(diǎn)尿蛋白含量比較結(jié)果顯示，MRL/lpr組小鼠尿蛋白含量顯著高于NC組，且隨時間延長而升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組在處理后10和12周時的尿蛋白含量顯著降低，且Cur-H組在12周時顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of urine protein content in each group at different time points.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖1 各組小鼠不同時點(diǎn)尿蛋白含量的比較

2 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

各組小鼠腎組織HE染色結(jié)果顯示，NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，未見增生和炎癥細(xì)胞浸潤；MRL/lpr組出現(xiàn)明顯的腎小球系膜細(xì)胞增生，伴有炎癥細(xì)胞浸潤；與MRL/lpr組相比，Cur組系膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤得到不同程度的緩解，見圖2A。同時，與NC組比較，MRL/lpr組腎小球增生比例和中性粒細(xì)胞浸潤比例顯著升高（P＜0.05）；Cur組腎小球增生比例和中性粒細(xì)胞浸潤比例顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖2B、C。

Figure 2.The effect of Cur on pathological changes of renal tissues in MRL/lpr mice.A：HE staining of the renal tissues（scale bar=50μm）；B：the percentages of glomerular proliferation；C：the percentages of neutrophil infiltration.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖2 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

3 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎功能指標(biāo)及抗dsDNA的影響

與NC組相比，MRL/lpr組SCr、BUN及血清抗dsDNA水平顯著增加（P＜0.05）；與MRL/lpr組相比，Cur組SCr、BUN及血清抗dsDNA水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠SCr、BUN及血清抗dsDNA水平的比較Table 1.Comparison of SCr，BUN and serum anti-dsDNA level in each group（Mean±SD.n=10）

4 姜黃素對MRL/lpr小鼠炎癥因子水平的影響

與NC組比較，MRL/lpr組血清和腎組織中IL-1β、IL-6及 TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組血清和腎組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清及腎組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的比較Table 2.Comparison of serum and kidney levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the mice of each group（ng/L.Mean±SD.n=10）

5 姜黃素對NF-κB信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC組比較，MRL/lpr組小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB蛋白水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The effect of Cur on expression of NF-κB signaling pathway-related proteins.Mean±SD.n=10.*P＜0.05vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖3 Cur對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響

6 姜黃素對NLRP3炎癥信號通路表達(dá)的影響

與NC組相比，MRL/lpr組小鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組小鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖4。

討 論

Figure 4.The effect of Cur on the protein expression of NLRP3 and caspase-1.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖4 Cur對NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響

LN是造成SLE患者死亡的主要原因之一，其治療效果與SLE患者的遠(yuǎn)期預(yù)后及生存率密切相關(guān)［3，10］。目前臨床上常用激素和免疫抑制劑治療LN，以提高患者的生存率，但仍有部分患者的效果不佳或無效［4］，臨床仍迫切需要尋找新的治療LN的有效藥物。Cur是一種植物多酚，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化等廣泛的生物學(xué)活性，且被證實(shí)對腎損傷具有一定的保護(hù)作用［11-13］。Fan等［14］研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過抑制Akt磷酸化，上調(diào)APPL1表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)缺血再灌注引起的急性腎損傷。本研究以MRL/lpr小鼠作為LN動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur灌胃處理后MRL/lpr小鼠的尿蛋白、腎功能指標(biāo)SCr和BUN水平均顯著降低，且血清中SLE標(biāo)志物抗dsDNA抗體顯著減少，說明Cur能改善MRL/lpr小鼠的腎損傷。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)及機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［15］。多項研究表明NF-κB信號通路在感染、損傷或自身免疫等因素引起的腎炎中發(fā)揮重要作用［16］。研究顯示MRL/lpr小鼠腎組織中NF-κB被激活，并伴隨大量炎癥因子的產(chǎn)生，而抑制NF-κB的激活能夠改善MRL/lpr小鼠的腎損傷［17-18］。因此，NF-κB信號通路可作為治療LN的潛在靶點(diǎn)。肇寅輝等［19］研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過抑制NF-κB的表達(dá)，降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕大鼠干熱環(huán)境下的腎損傷。本研究結(jié)果顯示，Cur處理后MRL/lpr小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB的蛋白表達(dá)水平及血清和腎組織中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，同樣表明Cur可通過抑制NF-κB的活化，減少其下游炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮對LN的保護(hù)作用。此外，研究表明由NLRP3、ASC和caspase-1組成NLRP3炎癥小體復(fù)合物也參與了LN的發(fā)生、發(fā)展［20］。多項研究表明NLRP3炎癥小體復(fù)合物在MRL/lpr小鼠腎組織中表達(dá)上調(diào)，阻斷NLRP3炎癥小體，能降低蛋白尿水平、抑制自身抗體的產(chǎn)生、減少促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放，減弱MRL/lpr小鼠LN發(fā)病的嚴(yán)重程度［21-22］。因此，抑制NLRP3炎癥體的活化可能是治療LN的新靶點(diǎn)。Lu等［23］研究發(fā)現(xiàn)Cur可以通過抑制NLRP3炎癥小體活性來改善糖尿病腎病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur處理能顯著抑制MRL/lpr鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白表達(dá)量，說明Cur處理能顯著抑制抑制腎組織中NLRP3炎癥小體的活化，抑制炎癥反應(yīng)，從而在LN中發(fā)揮保護(hù)作用。此外，還有研究表明抑制NF-κB的活化能抑制NLRP3的表達(dá)［24］，但在MRL/lpr小鼠腎組織中NLRP3活化是否由NF-κB信號通路調(diào)控還需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，Cur對MRL/lpr小鼠具有顯著的腎保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是與抑制NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)。本研究為LN的治療提供了新的思路，初步揭示了Cur的作用機(jī)制，也為Cur的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。