miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷和炎癥反應(yīng)*

龐 欣， 王曉蒙， 龐欣欣， 張建偉， 王學(xué)敏

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病科，河南鄭州450002）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的臨床微血管并發(fā)癥之一，是慢性腎臟病的常見病因，占終末期腎臟病的45%［1］。DN的病理特征涉及腎臟功能和結(jié)構(gòu)的各種變化，包括巨噬細(xì)胞浸潤、腎小球和腎小管肥大、腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚等［2］。此外，持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而炎癥加劇能夠直接破壞腎臟結(jié)構(gòu)，這與DN的發(fā)展密切相關(guān)［3］。盡管在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)方面取得了巨大進(jìn)步，但仍然有必要深入了解DN的病因和發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在廣泛的生理和病理過程中的關(guān)鍵功能，包括細(xì)胞存活、增殖、分化、凋亡以及免疫反應(yīng)［4］。已證明miRNA的失調(diào)與DN病理事件密切相關(guān)，說明miRNA有作為DN診斷性生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的可能性。例如，miR-203低表達(dá)通過增加Toll樣受體4促進(jìn)DN［5］。已有研究表明，DN小鼠腎細(xì)胞中miR-92b表達(dá)水平降低，且過表達(dá)miR-92b可減輕腎纖維化［6］。但miR-92b對DN大鼠的作用和機(jī)制尚不清楚。于是，本研究將主要探討miR-92b過表達(dá)對DN大鼠的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及細(xì)胞 SPF級的雄性SD大鼠90只，6周齡，體重（200±20）g，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號為SYXK（川）2017-203。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)室溫度控制在（21±2）℃，濕度控制在（55±2）%，光照/黑暗周期為12 h。大鼠在實(shí)驗(yàn)前均予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。大鼠腎細(xì)胞NRK-52E購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自上海艾研生物科技有限公司；檸檬酸鹽緩沖液購自北京諾博菜德科技有限公司；慢病毒陰性對照（lentiviral negative control，LV-NC）、LV-miR-92b、高遷移率族蛋白B1慢病毒（LV-high mobility group protein B1，LV-HMGB1）和引物均購自上海生工生物工程有限公司；RIPA裂解緩沖液和BCA試劑盒購自上海易色醫(yī)療科技有限公司；HMGB1抗體購自Abcam；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司。

1.3 儀器 HCC400全自動生化分析儀購自山東國康生物科技有限公司；Multiskan GO型全自動酶標(biāo)儀購自Thermo；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購自Proteinsimple；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自BD。

2 方法

2.1 模型的構(gòu)建及處理 將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對照（control）組、模型（DN）組、LV-NC組、miR-92b過表達(dá)（LV-miR-92b）組、HMGB1過表達(dá)（LV-HMGB1）組及miR-92b和HMGB1均過表達(dá)（miR-92b+HMGB1）組，每組15只。禁食12 h后，DN組大鼠腹腔注射60 mg/kg STZ（溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.5）［7］；control組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 72 h后測量血糖水平，血糖水平高于16.7 mmol/L即認(rèn)為造模成功。各處理組大鼠分別或聯(lián)合靜脈注射100μL LV-NC、LV-miR-92b和LV-HMGB1（1×1011U/L），每周2次［8］。8周后將大鼠處死，并收集腎臟組織進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.2 全自動生化分析儀檢測尿蛋白、血糖、血尿素氮和血清肌酐 實(shí)驗(yàn)結(jié)束最后一天，使用代謝籠收集尿液樣本，采用全自動生化分析儀測定尿蛋白濃度；從腹主動脈中采集血樣，離心，留取血清，用全自動生化分析儀檢測血糖、血尿素氮和血清肌酐含量。

2.3 RT-qPCR檢測miR-92b-5p和HMGB1 mRNA表達(dá) 將腎組織剪碎并研磨，采用Trizol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行。miR-92b-5p（用U6標(biāo)準(zhǔn)化）的循環(huán)條件為：94℃ 20 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)。HMGB1（用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化）的循環(huán)條件為：94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。miR-92b-5p的上游引物序列為5′-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；U6的上游引物序列為 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；HMGB1的上游引物序列為 5′-TCATCTGCTGCAGTGTTGTT-3′，下游引物序列為5′-CTCAGAGAGGTGGAAGA-3′；β-actin的上游引物序列為 5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游引物序列為5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。使用2-ΔΔCt方法計算。

2.4 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系 將1μg螢火蟲螢光素酶報告基因構(gòu)建體pGL3-HMGB1-WT（HMGB1野生型）或pGL3-HMGB1-MUT（HMGB1突變型），以及miR-92b-5p mimic或mimic-NC和pRL-CMV海腎螢光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠腎細(xì)胞NRK-52E。轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量螢光素酶的相對活性，用螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對活性。

2.5 Western blot檢測腎組織中HMGB1表達(dá) 用RIPA裂解緩沖液從腎組織中提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度；總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入對應(yīng)Ⅰ抗（均1∶1 000稀釋），在4℃下過夜；用TBST沖洗后，在37℃條件下，加入Ⅱ抗（1∶2 000稀釋）孵育60 min；用TBST沖洗后，加入ECL曝光。以β-actin為內(nèi)參照，使用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

2.6 HE染色觀察腎損傷 將腎臟用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水并制成石蠟切片；然后經(jīng)脫蠟、蘇木精液染色、1%鹽酸乙醇分化、0.6%氨水返藍(lán)、0.5%伊紅液染色后，再常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍顯微鏡觀察腎損傷情況。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎細(xì)胞凋亡 將腎組織剪碎，用胰酶消化細(xì)胞，4 000×g離心，按1×109/L的密度重懸。細(xì)胞懸液中加入5μL annexin V-FITC和5μL PI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率（%）=（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）/全部細(xì)胞×100%。

2.8 ELISA檢測腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平 將腎組織在冰上研磨，并制成10%組織勻漿，按照IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒說明檢測腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0處理，使用Graph-Pad Prism 6.0制圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)均呈正態(tài)分布。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DN大鼠腎組織中miR-92b-5p低表達(dá)，HMGB1 mRNA高表達(dá)

與control組相比，DN組大鼠血糖水平顯著升高（P＜0.01），腎組織中miR-92b-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），而HMGB1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The blood glucose levels in diabetic nephropathy（DN）rats and the expression levels of miR-92b-5p and HMGB1 mRNA in kidney tissues.A：blood glucose level was detected by automatic biochemical analyzer；B：miR-92b-5p expression in kidney was detected by RT-qPCR；C：mRNA expression of HMGB1 in kidney was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group.圖1DN大鼠血糖水平及腎組織中miR-92b-5p和HMGB1 mRNA表達(dá)

2miR-92b-5p靶向下調(diào)HMGB1

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，miR-92b-5p與HMGB1的3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-92b-5p高表達(dá)顯著抑制了含有野生型HMGB1質(zhì)粒的螢光素酶活性（P＜0.01），但對突變型HMGB1質(zhì)粒的螢光素酶活性無影響，見圖2B。與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織中miR-92b-5p和HMGB1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LV-miR-92b組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達(dá)顯著上調(diào)，HMGB1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），LVHMGB1組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達(dá)顯著下調(diào)，HMGB1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達(dá)顯著下調(diào)，HMGB1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2C、D。

Figure 2.miR-92b-5p targeted HMGB1 and down-regulated its expression.A：the binding site between miR-92b-5p and HMGB1 was predicted by TargetScan；B：the targeting relationship was verified by dual-luciferase reporter assay；C：miR-92b-5p expression was detected by RT-qPCR；D：the protein expression level of HMGB1 was detected by Western blot.Mean±SD.n=15.△△P＜0.01 vs HMGB1 MUT group；**P＜0.01 vs DN group；##P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖2 miR-92b-5p靶向下調(diào)HMGB1

3 miR-92b-5p通過靶向HMGB1改善DN模型大鼠的生化改變

與control組大鼠相比，DN組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均無顯著變化，LV-miR-92b組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著降低（P＜0.01），LV-HMGB1組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與 LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The 24-hour urine protein，blood glucose，serum creatinine and blood urea nitrogen levels in rats were by automatic biochemical analyzer.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DN group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖3 大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平

4 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎損傷

在control組小鼠中，腎小球形狀規(guī)則，細(xì)胞排列整齊、輪廓清晰，未觀察到增生性腎小球基底膜及炎性細(xì)胞的浸潤；在DN組可見腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹并伴有大量炎性細(xì)胞的浸潤；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織無變化，LV-miR-92b組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細(xì)胞的浸潤程度顯著減輕，LV-HMGB1組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細(xì)胞的浸潤程度顯著加重；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細(xì)胞的浸潤程度顯著加重，見圖4。

5 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎組織細(xì)胞凋亡

與control組大鼠相比，DN組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率無顯著差異，LV-miR-92b組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），LV-HMGB1組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 4.Renal tissue damage observed by HE staining.The scale bar=50μm.圖4 HE染色觀察腎組織損傷

Figure 5.Apoptosis rate was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

6 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎炎癥反應(yīng)

與control組大鼠相比，DN組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均增加（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均無顯著差異，LV-miR-92b組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著減少（P＜0.01），LVHMGB1組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加（P＜0.01）；與 LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加（P＜0.01），見圖6。

討 論

DN是糖尿病的致命性微血管并發(fā)癥之一，具有多種致病因素，但治療選擇有限［9］，因此，探討新的DN診斷性生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)具有至關(guān)重要的意義。STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型已被廣泛用于研究DN的發(fā)病機(jī)理。DN的主要致病因素包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥因子的異常表達(dá)及腎細(xì)胞異常凋亡等。miRNA的異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。已有報道表明miR-92b在腎臟病理生理中具有重要作用，如miR-92b通過靶向調(diào)控水通道蛋白2來減輕阿霉素腎病患者的腎水腫［10］。因此，本項(xiàng)工作選取STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型，來研究miR-92b對DN腎損傷、腎細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)作用和機(jī)制。

Figure 6.The content of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat kidney tissues.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DN group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖6 大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量

與文獻(xiàn)報道［6］一致，本研究證實(shí)了miR-92b在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟組織中表達(dá)下調(diào)，故miR-92b過表達(dá)有望抑制DN的發(fā)展。已有眾多研究證明，STZ誘導(dǎo)的DN大鼠的血糖、血清肌酐和血尿氮水平顯著上調(diào)，腎組織細(xì)胞凋亡加重，腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著增多，這與本研究的結(jié)果相一致［11-12］。本研究結(jié)果表明，miR-92b過表達(dá)可降低DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和尿素氮水平，減輕腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細(xì)胞的浸潤程度，降低腎組織細(xì)胞凋亡率，減少腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量，這些結(jié)果證實(shí)了miR-92b過表達(dá)減輕DN腎損傷及炎癥反應(yīng)，抑制了DN的體內(nèi)進(jìn)展。

為了進(jìn)一步研究miR-92b參與DN進(jìn)程的分子機(jī)制，我們尋找了miR-92b的潛在靶標(biāo)。生物信息學(xué)和螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)表明，HMGB1是miR-92b的潛在靶標(biāo)。本研究表明HMGB1在DN大鼠中高表達(dá)，這與Chen等［13］的研究結(jié)果相一致。HMGB1屬于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)化最保守的蛋白，是高遷移率族核蛋白家族的成員之一，以其雙重DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而聞名［14］。在正常情況下，HMGB1參與包括轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、分化和發(fā)育等各種生物過程。但從壞死或激活的細(xì)胞釋放時，它是一種有效的促炎細(xì)胞介質(zhì)［15］。研究表明，包括巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)的先天免疫細(xì)胞會主動分泌HMGB1［16］。已經(jīng)證明HMGB1不僅誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，例如IL-1β、IL-6和IL-8，而且還刺激壞死性炎癥［17］。糖基化終末產(chǎn)物受體是激活HMGB1的主要途徑［18］。已有研究表明，高血糖誘導(dǎo)的HMGB1釋放會導(dǎo)致腎損傷，從而導(dǎo)致DN期間腎小管間質(zhì)發(fā)炎［19］。本研究表明，過表達(dá)HMGB1可升高DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平，加重腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細(xì)胞的浸潤程度，升高腎組織細(xì)胞凋亡率，增加腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量；HMGB1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-92b對DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平的降低，腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎癥細(xì)胞浸潤程度的減輕，腎組織細(xì)胞凋亡率的降低及腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的減少。已有研究表明阻斷HMGB1可減輕小鼠DN［20］。因此，本研究結(jié)果提示miR-92b-5p通過靶向下調(diào)HMGB1來減輕DN大鼠腎損傷和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，miR-92b-5p通過靶向下調(diào)HMGB1來減輕DN腎損傷和炎癥反應(yīng)，但miR-92b-5p對DN腎損傷和炎癥反應(yīng)作用的分子機(jī)制及信號通路還需深入研究。