PDK4異常表達對前列腺癌細胞糖酵解和生長的影響*

李 駿， 張 倩， 馬 赫， 陳楚杰， 楊祥偉， 龐 俊， 江東根△

（中山大學附屬第七醫(yī)院1泌尿外科，2康復醫(yī)學科，廣東深圳518107）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是危害老年男性健康的一個主要疾病，也是美國男性腫瘤相關死亡的第二大原因［1］。早期局限性前列腺癌可行根治性前列腺切除術，預后良好。晚期前列腺癌患者多采用雄激素剝奪治療，然而最終失敗逐漸進展為不可治愈致命性的去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）［2］。因此，進一步闡明前列腺癌進展的分子機制對于尋求有效的CRPC治療方法具有重要意義。

惡性腫瘤細胞的主要代謝特征之一是高水平的糖酵解，如氧氣充足，這種現(xiàn)象則被稱為有氧糖酵解或Warburg效應［3］。糖酵解為腫瘤的快速生長提供了大量能量和底物。因此，抑制腫瘤有氧糖酵解阻斷能量供應已被證實是克服腫瘤治療困難的有效策略［4］。糖代謝途徑由多種酶類進行催化調控，其中線粒體丙酮酸脫氫酶復合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）不可逆催化丙酮酸脫羧為乙酰輔酶A，是控制糖酵解走向氧化磷酸化的關鍵調控點［5］。PDC的活性取決于它的磷酸化狀態(tài)，丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinases，PDKs）與丙酮酸脫氫酶磷酸酶（pyruvate dehydrogenase phosphatases，PDPs）在調節(jié)PDC的磷酸化水平及活性過程中起著重要作用［6］。人類有4種不同的PDK同工酶（PDK1～4），其中PDK4已被證實是PDC調控物質代謝的中心［7-8］。PDK4通過抑制PDC活性，將丙酮酸代謝從線粒體氧化磷酸化轉移到細胞質進行糖酵解，為細胞生長提供能量來源。因此，PDK4的調控可直接影響糖酵解的效率。目前國內(nèi)外研究顯示PDK4在膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，并與其惡性程度及不良預后有關［9-12］。但暫無文獻報道PDK4在前列腺癌中發(fā)揮的作用，故本研究重點探討糖代謝過程中的關鍵酶PDK4在前列腺癌組織中的表達及其對前列腺癌細胞糖酵解和增殖的影響，以期從能量代謝方面為前列腺癌的診療提供新的分子靶點。

材料和方法

1 材料和試劑

1.1 細胞和質粒 前列腺癌細胞PC3、LNCaP、DU145和C4-2由中科院典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫提供；正常前列腺上皮細胞RWPE-1由ATCC提供。PDK4-shRNA質粒由上海吉瑪公司設計并構建。

1.2 主要試劑 細胞培養(yǎng)液RPMI-1640和胎牛血清（Gibco）；Defined KSFM、RNA提取試劑盒、CCK-8試劑盒、蛋白提取試劑盒和細胞周期試劑盒均由凱基生物公司提供；兔抗人PDK4單克隆抗體及Ⅱ抗購自Abcam；Lipofectamine 3000購自Life Technology。

1.3 標本 良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）組織和前列腺癌標本蠟塊由我院病理科提供，其中15例良性前列腺增生電切組織和32例前列腺癌組織（包含Gleason≤6的前列腺癌組織11例、Gleason=7的前列腺癌組織13例和Gleason≥8的前列腺癌組織8例）。本研究已通過中山大學附屬第七醫(yī)院倫理委員會批準。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 用含10%胎牛血清和青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)前列腺癌細胞株（PC3、LNCaP、DU145及C4-2）；前列腺正常上皮細胞RWPE-1采用含有5μg/L表皮生長因子、50 g/L牛腦垂體萃取液和1×抗菌素的Defined KSFM細胞培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期、細胞密度約70%～80%的PC3細胞進行轉染，參考Lipofectamine 3000方法進行轉染，實驗組轉染PDK4-shRNA質粒，對照組轉染空白質粒。

2.2 RT-qPCR實驗 細胞總RNA采用Trizol法抽提，通過紫外分光光度計檢測RNA純度與濃度，參照試劑盒說明書行RNA逆轉錄，再以逆轉錄合成的cDNA為模板繼續(xù)行熒光定量PCR。內(nèi)參照為β-actin，mRNA相對表達量計算采用2-ΔΔCt法。PDK4的正向引物序列為5'-GGAGCATTTCTCGCGCTACA-3'，反向引物序列為5'-ACAGGCAATTCTTGTCGCAA-3'；β-actin的正向引物序列為5'-AAGACCTGTACGCCAACACAGT-3'，反向引物序列為5'-AGAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。

2.3 免疫組化觀察 標本石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2溶液中浸泡，修復抗原，滴加按1∶500稀釋的抗PDK4抗體，4℃孵育過夜，PBS漂洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗工作液，37℃孵育20 min，PBS漂洗，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，孵育漂洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察統(tǒng)計染色結果，PDK4蛋白主要在細胞漿中表達。按顯色強度，無陽性染色記0分，較弱棕色記1分，中度棕色記2分，較強棕色記3分。按陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)＜5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，＞50%記3分。將兩項結果相乘得到總分。每張玻片染色評分按雙盲原則，由2名高年資病理科醫(yī)生進行閱片判斷，取平均值匯總結果。

2.4 Western blot實驗 常規(guī)提取細胞總蛋白，檢測其濃度，加樣后行SDS-PAGE，轉PVDF膜，封閉液室溫孵育2 h，加Ⅰ抗（1∶1 500）于4℃孵育過夜，相應Ⅱ抗室溫孵育2 h后進行顯色成像。

2.5 糖攝取和乳酸分泌實驗 參考已發(fā)表文獻中所述方法［13］，細胞轉染后收集培養(yǎng)液，離心棄去細胞碎片，采用試劑盒分別檢測培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸的水平，配合細胞計數(shù)，將得到的葡萄糖及乳酸含量減去培養(yǎng)液本底值后除以相應細胞數(shù)，得到每個細胞的糖消耗量及乳酸生成量，結果以相對倍數(shù)表示，以對照組細胞為標準。

2.6 CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期預處理的細胞，置于96孔板中培養(yǎng)，分別于轉染后1、2、3和4 d檢測細胞活力。按說明書加入CCK-8試劑后孵育3 h，酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度（A）值。

2.7 流式細胞術分析細胞周期分布 參考已發(fā)表文獻所述方法［14］，轉染質粒48 h后，取預處理的對數(shù)生長期細胞，置于70%乙醇中4℃過夜固定。次日重懸細胞并用PBS漂洗，加入PI溶液，冰上放置30 min。上流式細胞儀行細胞周期檢測分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩獨立樣本間比較采用Student's t檢驗，多組間計量資料比較應用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PDK4在前列腺癌組織中的表達

通過免疫組化檢測臨床15例良性前列腺增生組織和32例前列腺癌組織標本的PDK4表達水平，其中在前列腺癌組織中，Gleason≤6的前列腺癌組織11例，Gleason=7的前列腺癌組織13例，Gleason≥8的前列腺癌組織8例，典型染色圖片如圖1A所示。良性前列腺增生和前列腺癌組織的PDK4免疫組化IHC評分分別為3.33±0.19和5.96±0.26，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。進一步分析前列腺癌組織PDK4表達與病理Gleason評分的關系，結果顯示Gleason≤6的前列腺癌組織IHC評分為4.73±0.26，Gleason=7的前列腺癌IHC評分為5.22±0.21，Gleason≥8的前列腺癌IHC評分為7.33±0.28，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1C。

2 PDK4在前列腺癌細胞株中的表達

通過RT-qPCR和Western blot方法檢測正常前列腺上皮細胞（RWPE-1）和4種前列腺癌細胞株（PC3、LNCaP、DU145和C4-2）中PDK4的mRNA和蛋白表達水平。結果表明PDK4在前列腺癌細胞株中的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于正常前列腺上皮細胞（P＜0.05），其中PC3細胞中PDK4的表達豐度最高，故后續(xù)體外實驗均采用PC3細胞株，見圖2。

3 PC3細胞轉染PDK4-shRNA后PDK4表達水平的變化

PC3細胞轉染PDK4-shRNA重組質粒后，通過RT-qPCR檢測到PDK4的mRNA表達量明顯減低，同時Western blot結果也呈現(xiàn)一致性改變，轉染后的PDK4蛋白表達水平顯著下降，從而證實了基因沉默的有效性（P＜0.05），見圖3。

4 敲減PDK4的表達對PC3細胞糖酵解的影響

PC3細胞轉染PDK4-shRNA重組質粒抑制PDK4基因表達后，通過試劑盒檢測細胞的葡萄糖攝取和乳酸分泌量來反應糖酵解水平。結果表明，相對于對照NC組，PDK4-shRNA組的葡萄糖消耗量顯著減少，同時乳酸生成量亦顯著減少（P＜0.05），見圖4。

5 敲減PDK4對PC3細胞活力和周期分布的影響

PC3細胞轉染PDK4-shRNA重組質粒敲減PDK4的表達后，通過CCK-8法和流式細胞術分析細胞活力和周期分布的改變。結果顯示，PDK4-shRNA轉染組的PC3細胞自轉染后2 d開始細胞活力下降，并隨著時間推移差異趨勢逐漸增大（P＜0.05），見圖5A。流式細胞術證實，與對照組相比，PDK4-shRNA組停留在G0/G1期的細胞數(shù)量顯著增加，出現(xiàn)G0/G1期阻滯（P＜0.05），見圖5B。

Figure 1.The expression of PDK4 in prostate cancer（PCa）tissues.A：representative images of immunohistochemical（IHC）staining of PDK4 protein in benign prostatic hyperplasia（BPH）tissues and PCa tissues；B：IHC scores of PDK4 protein in BPH tissues and PCa tissues；C：IHC scores of PDK4 protein in PCa tissues with different Gleason scores.Mean±SD.*P＜0.05 vs BPH group；#P＜0.05 vs Gleason≤6 group.圖1 PDK4蛋白在前列腺癌組織中的表達及其與病理Gleason評分的關系

Figure 2.The mRNA（A）and protein（B）levels of PDK4 in prostate cancer cell lines（PC3，LNCaP，DU145 and C4-2）and normal prostate epithelial cells（RWPE-1）were determined by RT-qPCR and Western blot，respectively.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs RWPE-1 group.圖2 PDK4 mRNA和蛋白在前列腺癌細胞株中的表達

Figure 3.After PDK4-shRNA transfection，RT-qPCR and Western blot were used to confirm the down-regulation of PDK4 mRNA（A）and protein（B）in the PC3 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NC group.圖3 PC3細胞轉染PDK4-shRNA后PDK4表達水平的變化

Figure 4.After PDK4-shRNA transfection，glucose consumption（A）and lactate release（B）in the PC3 cells were measured by glycolysis kit.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NC group.圖4 敲減PDK4對PC3細胞糖酵解的影響

討 論

Warburg效應代表著腫瘤細胞對葡萄糖的利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的轉變，被認為是惡性腫瘤的一大特征，這種能量代謝改變受很多復雜因素調控，包括腫瘤微環(huán)境的壓力和基因的改變等［15］。腫瘤細胞糖酵解增強主要是由于糖酵解關鍵酶的表達或活性增強。近年來，國內(nèi)外學者不斷探索通過抑制腫瘤細胞糖酵解通路關鍵酶的活性來靶向治療惡性腫瘤。一些研究顯示，抑制腫瘤糖酵解途徑能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖甚至可以起到殺傷腫瘤細胞的作用，比如己糖激酶2、磷酸果糖酶和M2型丙酮酸激酶等糖酵解關鍵酶已經(jīng)成為腫瘤標志物，它們的表達與活性可以影響腫瘤的糖酵解，進而影響腫瘤的增殖［16］。

PDK4作為4種丙酮酸脫氫酶激酶亞型之一，在葡萄糖三羧酸循環(huán)/氧化磷酸化調控中起重要作用。PDK4使PDC亞基磷酸化，從而抑制丙酮酸生成乙酰輔酶A，使代謝通量流向糖酵解。PDK4作為PDC活性抑制劑的關鍵作用使其基因成為許多腫瘤和代謝疾病的重要靶基因［5］。目前的觀點普遍認為PDK4在惡性腫瘤發(fā)生進展過程中發(fā)揮促癌作用，例如：在某些病理條件下，PDK4持續(xù)激活，可引起機體內(nèi)細胞代謝途徑的變化，誘導細胞惡變［17］；PDK4在肺癌中可以通過活化mTOR信號通路和增強有氧糖酵解加速腫瘤生長［18］；PDK4在高級別膀胱癌中表達上調，并與膀胱癌細胞順鉑耐藥有關［9］；高水平PDK4與乳腺癌不良預后有關［11］；利用小分子抑制劑下調PDK4的活性，可以顯著抑制糖酵解通量及腫瘤生長［19］。

Figure 5.After PDK4-shRNA transfection，the viability of PC3 cells was measured by CCK-8 assay（A），and the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry（B）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NC group.圖5 抑制PDK4對PC3細胞活力和細胞周期分布的影響

但是也有少部分文獻報道PDK4同樣可以扮演抑癌基因的角色，其中一項研究表明，在肝癌細胞中，下調PDK4可通過抑制PDC活性促進脂肪從頭合成，進而加速細胞增殖和腫瘤生長。這可能是因為PDK4減少乙酰輔酶A的生成，而乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量生產(chǎn)的前體物質［20］。鑒于以上觀點存在的爭議性，我們提出合理解釋：一方面組織或細胞特異性可能影響PDK4在不同腫瘤類型中的獨特功能；另一方面，由于不同器官的代謝微環(huán)境和癌細胞的代謝需求不同，可能導致PDK4功能的多樣性。但PDK4在不同腫瘤和疾病中發(fā)揮何種作用，具體作用機制如何，仍有待于進一步研究去探索證實。

迄今為止，尚未見文獻報道PDK4在前列腺癌中的表達情況及其作用機制。本次研究通過檢測臨床標本顯示，PDK4在前列腺癌中的表達水平顯著高于前列腺增生組織，且Gleason評分越高，PDK4的表達水平也顯著增高，提示PDK4與前列腺癌的惡性程度有關。進一步，本實驗在細胞株中也證實了在前列腺癌細胞中PDK4的表達量顯著高于前列腺正常上皮細胞。細胞實驗證實，敲減PDK4的表達可顯著抑制前列腺癌細胞的有氧糖酵解和細胞生長。本研究表明，PDK4在前列腺癌的發(fā)生進展過程中發(fā)揮不可忽視的促癌作用，這與國內(nèi)外主流觀點一致。但是PDK4調控前列腺癌生長的具體分子機制及其臨床應用，需要更加深入的基礎和臨床研究來闡明。