RXRα激動(dòng)劑貝薩羅汀通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad2通路抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成*

許昌聲， 張美金， 練桂麗， 彭 峰， 王華軍， 林金秀， 柴大軍

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建高血壓研究所，福建福州350005）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）已成為危及人類健康的全球性疾病之一，血管中膜平滑肌細(xì)胞增殖在其形成和發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色［1-3］。前期研究結(jié)果證實(shí)，血脂代謝異常、血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積和血管中膜平滑肌細(xì)胞增生是載脂蛋白E缺陷（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠AS斑塊形成與發(fā)展的病理基礎(chǔ)，且轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad2信號(hào)通路參與 AS斑塊內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增生過(guò)程［4-6］，抑制TGF-β1/Smad2通路可減輕血管中膜肥厚，減少平滑肌層細(xì)胞增生，抑制動(dòng)脈硬化斑塊發(fā)展［7］。

類 視 黃 醇 X 受 體 α（retinoid X receptor α，RXRα）是核受體超家族的成員，可與其他核受體形成異二聚體，參與抗炎、抗氧化等多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)［8］。我們前期觀察發(fā)現(xiàn)RXRα在逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚、抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷及糖尿病心肌纖維化等方面具有重要的作用［9-10］，也證實(shí)了RXRα激動(dòng)劑可通過(guò)改善糖脂代謝抑制動(dòng)脈硬化的形成，但其分子機(jī)制尚不清楚。

本項(xiàng)工作應(yīng)用小鼠模型，觀察RXRα受體激動(dòng)劑貝薩羅?。╞exarotene，Bex）對(duì)ApoE-/-小鼠AS斑塊形成和VSMCs增生的作用，探討RXRα受體對(duì)TGF-β1/Smad2通路的調(diào)控作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)ApoE-/-小鼠和C57BL/6小鼠，體重18～20 g，許可證號(hào)為SCXK（京）2011-0012，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。Bex（Eisai）；A83-01（Smad2磷酸化抑制劑）和TGF-β1（Sigma）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）細(xì)胞增殖試劑盒（Roche）；核蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司）；Smad2和p-Smad2抗體（CST）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（北京中杉公司）；丙烯酰胺和Tris-base（Ameresco）；PVDF膜（Millipore）；β-actin單克隆抗體和免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（Santa Cruz）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 根據(jù)文獻(xiàn)［11］我們選用10只8周齡雄性C57BL/6小鼠為正常對(duì)照，30只8周齡雄性ApoE-/-小鼠為AS動(dòng)物模型并隨機(jī)分為3組：ApoE-/-組 、ApoE-/-+Bex5 （5 mg·kg-1·d-1Bex）組 、ApoE-/-+Bex10（10 mg·kg-1·d-1Bex）組。給藥劑量參照祝江等［7］在糖尿病ApoE-/-小鼠AS研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度（55±5）%，人工光照明暗各12 h/d，自由取食飲水，飼料由上海斯萊克公司提供。將Bex溶于生理鹽水中，灌胃法給藥，每天1次，連續(xù)8周，C57BL/6和ApoE-/-組小鼠均予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 HE染色 取小鼠胸主動(dòng)脈弓下0.5 cm血管段，PBS洗滌1～2次，4%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下拍照，采用自動(dòng)成像分析軟件系統(tǒng)（Image 5.0）計(jì)算胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積。

2.3 組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs 取ApoE-/-小鼠（8周齡）胸主動(dòng)脈，置于盛有M199液的培養(yǎng)皿中，去除血管外膜后剪碎（1 mm×1 mm×1 mm），M199液沖洗2～3次，將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，平鋪，吸棄培養(yǎng)液，于組織塊對(duì)側(cè)加入4～5 mL含10%FBS的M199培養(yǎng)液，傾斜45°于培養(yǎng)箱靜置2～3 h，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶平放，3～4 d更換2/3培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿70%～80%瓶底，采用0.25%胰酶消化傳代，傳3～6代細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 蛋白提取和Western blot實(shí)驗(yàn) 取ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈（隔肌上）長(zhǎng)約1 cm，剝?nèi)パ芡饽そM織，PBS漂洗1～2次，加0.5 mL RIPA裂解緩沖液勻漿，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，震蕩15 s，100℃水浴煮10 min，12 000×g、4℃離心10 min，取上清-80℃保存?zhèn)溆?。依?jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，采用核蛋白提取試劑盒提取VSMCs總蛋白、胞漿及胞核蛋白。蛋白經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加Smad2和p-Smad2抗體（1∶1 000），Ⅱ抗（1∶5 000）孵育、顯影，以β-actin（1∶2 000）為內(nèi)參照，以目的蛋白/β-actin比值作為蛋白表達(dá)水平。

2.5 BrdU摻入法檢測(cè)VSMCs增殖水平 選取3～6代VSMCs接種于96孔培養(yǎng)板（每孔2×103個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%匯合時(shí)棄培養(yǎng)基，用無(wú)血清M199培養(yǎng)液洗滌2次，加入0.9 mL含0.5%FBS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，在干預(yù)的同時(shí)加每孔10μL 10×BrdU原液孵育24 h。棄上清，PBS漂洗1次，4%甲醛固定30 min，棄固定液，PBS漂洗3次，加HRP標(biāo)記的BrdU抗體（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每孔加反應(yīng)液100 μL，37℃孵育10～20 min，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A）值（波長(zhǎng)450 nm），以A值表示細(xì)胞增殖水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較使用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Bex對(duì)ApoE-/-小鼠生化指標(biāo)的影響

與C57BL/6組相比，ApoE-/-組小鼠空腹血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平均顯著增加（P＜0.01），但ApoE-/-組、ApoE-/-+Bex5組和ApoE-/-+Bex10組之間TG、TC和LDL-C水平均無(wú)顯著差異（P＜0.05）；各組間高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及血清肌酐（serum creatin，SCr）水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 Bex對(duì)ApoE-/-小鼠生化指標(biāo)的影響Table 1.Effects of Bex on blood biochemical parameters of ApoE-/-mice（Mean±SD.n=10）

2 Bex抑制ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊的形成

C57BL/6組小鼠的血管內(nèi)膜光滑，未見(jiàn)脂質(zhì)斑塊形成；ApoE-/-小鼠血管內(nèi)膜可見(jiàn)巨大硬化斑塊突起，中膜厚薄不均，斑塊內(nèi)及底部可見(jiàn)大量組織增生；ApoE-/-+Bex5組和ApoE-/-+Bex10組小鼠血管壁中膜較為規(guī)則，內(nèi)膜斑塊較小，斑塊周圍及底部只見(jiàn)少量組織增生。斑塊面積分析：與C57BL/6組相比，ApoE-/-組血管內(nèi)膜斑塊面積顯著增大（P＜0.01）；與ApoE-/-組相比，ApoE-/-+Bex5組及ApoE-/-+Bex10組斑塊面積顯著減?。≒＜0.01）；ApoE-/-+Bex10組與ApoE-/-+Bex5組相比斑塊面積顯著減小（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

3 Bex對(duì) ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈 TGF-β1、p-Smad2及Smad2蛋白水平的影響

與C57BL/6組相比，ApoE-/-組小鼠胸主動(dòng)脈的TGF-β1和p-Smad2水平均顯著增加（P＜0.01）；Bex可增加胸主動(dòng)脈p-Smad2水平，表現(xiàn)為ApoE-/-+Bex5和ApoE-/-+Bex10組小鼠胸主動(dòng)脈的p-Smad2水平較ApoE-/-組顯著增加（P＜0.01），且ApoE-/-+Bex10組p-Smad2水平顯著高于ApoE-/-+Bex5組（P＜0.01）；但ApoE-/-組、ApoE-/-+Bex5組和ApoE-/-+Bex10組之間TGF-β1和Smad2的表達(dá)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 1.Bex treatment decreased plaque size in the thoracic aorta of ApoE-/-mice（HE staining，scale bar=200μm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs C57BL/6 group；##P＜0.01 vs ApoE-/-group；&P＜0.05 vs ApoE-/-+Bex5 group.圖1 Bex抑制ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊的形成

4 Bex和Smad2磷酸化抑制劑A83-01均可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs增殖

BrdU摻入率檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1（0.1～10μg/L）呈濃度依賴性促進(jìn)VSMCs增殖，當(dāng)TGF-β1干預(yù)濃度達(dá)到5μg/L時(shí)，BrdU摻入率達(dá)到高峰，見(jiàn)圖3A。Bex則呈濃度依賴性抑制TGF-β1（5μg/L）誘導(dǎo)的VSMCs增殖，與TGF-β1組相比，Bex（10-7mol/L）+TGF-β1組VSMCs的BrdU摻入率顯著降低（P＜0.01）；當(dāng)用Smad2磷酸化抑制劑A83-01（20 nmol/L）預(yù)處理VSMCs后，TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs增殖效應(yīng)亦被顯著抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

5 Bex促進(jìn)VSMCs中TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2磷酸化

Figure 2.Effects of Bex on the protein levels of TGF-β1，p-Smad2 and Smad2 in thoracic aorta tissues of ApoE-/-mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs C57BL/6 group；##P＜0.01 vs ApoE-/-group.圖2 Bex對(duì) ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈 TGF-β1、p-Smad2及Smad2表達(dá)的影響

當(dāng)用 TGF-β1（5 μg/L）干預(yù) VSMCs 60～90 min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)p-Smad2蛋白水平顯著增加（P＜0.01），但未對(duì)Smad2總蛋白水平產(chǎn)生影響，見(jiàn)圖4A。當(dāng)用Bex（10-7mol/L）預(yù)處理VSMCs后，再予TGF-β1誘導(dǎo)VSMCs 60 min，p-Smad2蛋白水平則顯著增加（P＜0.01），但各組間Smad2總蛋白水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4B。

6 Bex抑制VSMCs中TGF-β1誘導(dǎo)的p-Smad2核轉(zhuǎn)位

提取各組細(xì)胞總蛋白并分離和純化胞質(zhì)和胞核蛋白，Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1（5μg/L）組VSMCs胞質(zhì)及胞核的p-Smad2水平均顯著升高（P＜0.01）；但與 TGF-β1（5 μg/L）組相比，TGF-β1（5 μg/L）+Bex（10-7mmol/L）組 VSMCs胞質(zhì)的p-Smad2水平顯著升高（P＜0.01），胞核的p-Smad2水平卻顯著降低（P＜0.01）；各組細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核Smad2水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 3.Bex and Smad2 phosphorylation inhibitor A83-01 inhibited TGF-β1-induced proliferation of VSMCs.A：the VSMCs were incubated with TGF-β1（0～10 μg/L）and BrdU（1 mg/L）for 24 h，and the proliferation activity was determined；B：the VSMCs were pretreated with the indicated concentration of Bex for 30 minutes and then exposed to TGF-β1（5 μg/L）and Brdu（1 mg/L）for 24 h.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs control（0 μg/L TGF-β1）group；▲P＜0.05 vs TGF-β1（5 μg/L）group.圖3 Bex及Smad2磷酸化抑制劑A83-01抑制TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs增殖

ApoE-/-小鼠已被廣泛應(yīng)用于高脂血癥和AS及其并發(fā)癥的研究。本研究結(jié)果顯示，與C57BL/6組相比，ApoE-/-小鼠的血清TG、TC和LDL-C水平均顯著增高，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜有巨大的粥樣斑塊形成及中膜平滑肌層大量增生。ApoE-/-小鼠AS的發(fā)生除與血脂異常有關(guān)外，血管中膜平滑肌層細(xì)胞增生在其形成和發(fā)展過(guò)程中也起重要作用［1-3］。血脂異常升高，血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，血管中膜平滑肌層細(xì)胞增生是AS發(fā)生和發(fā)展共同的病理基礎(chǔ)［13］。在本研究中，當(dāng)ApoE-/-小鼠給予RXRα激動(dòng)劑Bex治療時(shí)，Bex可呈劑量依賴性的抑制ApoE-/-胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊的形成，減少動(dòng)脈硬化斑塊面積，抑制斑塊周圍及底部中膜平滑肌層增生。由于Bex治療未對(duì)ApoE-/-小鼠血脂產(chǎn)生顯著影響，我們推測(cè)RXRa激動(dòng)劑Bex改善ApoE-/-小鼠AS機(jī)制可能與降脂效應(yīng)無(wú)關(guān)。

我們前期觀察到阿托伐他汀可通過(guò)RXRα抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈AS斑塊面積，這一結(jié)果表明RXRα參與該過(guò)程并發(fā)揮介導(dǎo)作用，且可能是機(jī)體AS形成的內(nèi)源性保護(hù)因素［10］。已有研究顯示，動(dòng)脈內(nèi)膜損傷可觸發(fā)組織炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)激活TGF-β1/Smad2信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs增殖與基質(zhì)合成，抑制TGF-β1/Smad2活性可削弱上述效應(yīng)，改善血管重構(gòu)，減少動(dòng)脈硬化的發(fā)生，因此，TGF-β1/Smad2是VSMCs增殖和基質(zhì)合成的重要調(diào)控通路［2，14-15］。我們也觀察到 ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈的TGF-β1和p-Smad2蛋白水平均顯著增加，同時(shí)也觀察到胸主動(dòng)脈平滑肌層不規(guī)則增厚，斑塊周圍及底部有大量細(xì)胞增生，再次證明了VSMCs增殖是ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊形成的重要機(jī)制之一，且VSMCs增生與TGF-β1/Smad2信號(hào)通路活化有關(guān)。既往研究已證實(shí)TGF-β1增加p-Smad2水平促進(jìn)VSMCs細(xì)胞增生。在實(shí)驗(yàn)中，Bex治療未改變ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈的TGF-β1含量，但p-Smad2磷酸化水平顯著增高，同時(shí)動(dòng)脈中膜變薄，斑塊內(nèi)增生組織減少，斑塊面積縮小，我們?cè)隗w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也觀察到Bex可增加VSMCs中TGF-β1誘導(dǎo)的p-Smad2水平，卻使其增殖水平降低，這結(jié)果與既往認(rèn)為的p-Smad2水平增加促進(jìn)細(xì)胞增殖不一致，我們推測(cè)Bex發(fā)揮上述細(xì)胞學(xué)效應(yīng)還可能存在其他重要機(jī)制。有研究者在TGF-β1/Smad2信號(hào)通路與細(xì)胞增殖研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖不僅與Smad2磷酸化水平有關(guān)，還與p-Smad2細(xì)胞核轉(zhuǎn)位有關(guān)［15-16］。我們推測(cè)核受體RXRα可能通過(guò)抑制p-Smad核轉(zhuǎn)位從而抑制TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)。也有研究RXRα受體激動(dòng)后能增加TGF-β1上調(diào)p-Smad2的水平，但抑制p-Smad2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，抑制TGF-β1/Smad2通路的促細(xì)胞增殖活性［17-18］。我們?cè)赗XRα調(diào)控大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的相關(guān)研究中也檢測(cè)到RXRα活化顯著增加TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞胞漿p-Smad2水平，但抑制p-Smad2核轉(zhuǎn)位進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞膠原合成［19］。因此，我們推測(cè)Bex增加ApoE-/-小鼠胸動(dòng)脈p-Smad2水平卻抑制動(dòng)脈中膜VSMCs增生可能與RXRα抑制p-Smad2核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

Figure 4.Effects of Bex on TGF-β1-induced Smad2 phosphorylation in VSMCs.A：TGF-β1（5 μg/L）induced Smad2 phosphorylation in the VSMCs；B：the VSMCs were treated with Bex（10-7mmol/L）for 30 min and then exposed to TGF-β1（5 μg/L）for 60 min.Mean±SD.n=4.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs TGF-β1（5 μg/L）group.圖4 Bex對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs中Smad2磷酸化的影響

Figure 5.Bex inhibited nuclear translocation of p-Smad2 induced by TGF-β1 in VSMCs.The VSMCs were treated with Bex（10-7mmol/L）or TGF-β1（5 μg/L）for 60 min，or pretreated with Bex（10-7mmol/L）followed by exposure to TGF-β1（5 μg/L）for 60 min.Nuclear，cytosolic（Cyto）and total extracts were prepared and analyzed by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vscontrolgroup；▲▲P＜0.01vsTGF-β1（5μg/L）group.圖5 Bex抑制VSMCs中TGF-β1誘導(dǎo)的p-Smad2核轉(zhuǎn)位

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RXRa激動(dòng)劑Bex可抑制 TGF-β1誘導(dǎo) VSMCs增殖，并協(xié)同 TGF-β1增加VSMCs胞漿p-Smad2水平，而VSMCs胞核內(nèi)p-Smad2水平顯著降低；另外p-Smad2抑制劑A83-01也能顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖水平，這一結(jié)果也證實(shí)了TGF-β1誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞增殖水平與VSMCs的p-Smad2總水平有關(guān)，也說(shuō)明p-Smad2只有在細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用。既往研究已顯示，細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，Smad2蛋白主要位于細(xì)胞胞漿中，但當(dāng)Smad2被外來(lái)信號(hào)刺激后，Smad2蛋白迅速磷酸化并向胞核內(nèi)聚集從而介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性［18-20］。Cao等［18］在體外培養(yǎng)的NIH-3T2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)RXRa受體激動(dòng)后可與Smad2結(jié)合形成二聚體，可協(xié)同TGF-β1誘導(dǎo)增加p-Smad2水平，但p-Smad2未能與RXRa分離，限制p-Smad2從胞質(zhì)向胞核內(nèi)聚集，導(dǎo)致p-Smad2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄作用失活，這進(jìn)一步說(shuō)明Smad2活性不但與其磷酸化水平有關(guān)，而且與p-Smad2是否在胞核內(nèi)集聚有關(guān)。因而B(niǎo)ex雖增加TGF-β1誘導(dǎo)的VSMCs胞漿p-Smad2水平，但可抑制p-Smad2核轉(zhuǎn)位，從而消除TGF-β1誘導(dǎo)VSMCs增殖的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示RXRα受體激動(dòng)劑Bex具有抗AS作用，且通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad2通路p-Smad2核轉(zhuǎn)位抑制胸主動(dòng)脈VSMCs增生可能是其重要機(jī)制。