紫花苜蓿MsNST的克隆及對木質(zhì)素與纖維素合成的功能分析

蔣旭，崔會婷，王珍，張鐵軍，龍瑞才，楊青川，康俊梅

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)一直是苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展所關(guān)注的熱點。影響苜蓿品質(zhì)的主要因素有纖維素、木質(zhì)素和粗蛋白含量以及能量等，其中木質(zhì)素和纖維素含量是影響苜蓿消化率和營養(yǎng)價值的重要因素之一。木質(zhì)素和纖維素是組成植物細胞壁的主要成分，占植物總生物量的絕大部分，對植物正常生長發(fā)育非常重要。對牧草而言，纖維素與木質(zhì)素含量的多少決定牧草消化率和營養(yǎng)價值的高低，牧草木質(zhì)化程度越高，其消化率越低，營養(yǎng)價值也越低[1-2]。因此，研究苜蓿細胞壁生物合成途徑中關(guān)鍵基因的生物學功能，為揭示苜蓿纖維素與木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，并為利用基因工程的方法改善紫花苜蓿品質(zhì)提供參考?！厩叭搜芯窟M展】纖維素與木質(zhì)素是由單體聚合而成的大分子有機物質(zhì)，從單體的合成到聚合均有一系列基因參與完成，從而使植物細胞壁物質(zhì)合成通路具有多基因調(diào)控的特性（圖1）。通過對擬南芥等植物木質(zhì)素、纖維素生物合成機制的研究表明，植物NST轉(zhuǎn)錄因子是次生細胞壁物質(zhì)合成的總開關(guān)，對細胞壁生物合成起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[3-5]。擬南芥中存在3個NST同源基因，NST1和NST2、NST3之間功能存在冗余，共同調(diào)控次生壁發(fā)育，NST1和NST2基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥內(nèi)壁細胞次生壁發(fā)育，并對花藥正常開裂起到關(guān)鍵作用[6]；NST1、NST3調(diào)控木質(zhì)部與束間纖維細胞次生壁的合成[4-5]；ZHONG等研究擬南芥三突變體nst1nst2nst3，結(jié)果表明突變體莖木質(zhì)部與纖維細胞次生壁完全缺失，造成植株倒伏[7]，暗示NST對木質(zhì)素和纖維素合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，NST轉(zhuǎn)錄因子主要通過激活靶基因啟動子區(qū) SNBE元件（Secondary wall NAC binding element）調(diào)控基因表達[8]。降低擬南芥NST1和NST3表達量，次生壁物質(zhì)合成關(guān)鍵基因的表達量受到了不同程度的下調(diào)[4-5]。例如，nst1nst3雙突變體中4-香豆酸輔酶A連接酶基因（4CL1），咖啡酰輔酶連接酶基因（COMT1），纖維素合酶亞基基因（CesA7, CesA8）等參與次生壁木質(zhì)素與纖維素物質(zhì)合成基因表達量顯著下調(diào)[5]。單子葉植物玉米中過表達ZmNST3/4后能夠激活一系列纖維素與木質(zhì)素相關(guān)合成基因CesA4、CesA9、4CL、HCT的表達，從而調(diào)控玉米次生壁纖維素與木質(zhì)素合成[9]。植物次生細胞壁物質(zhì)合成也會受到激素信號的誘導[10]。赤霉素（gibberellin，GA）是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要激素之一，GA通過誘導植物體內(nèi)酚類化合物等次生代謝來調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成[11]。研究表明，GA信號通路的主要調(diào)控方式是通過誘導DELLA蛋白降解完成的[12]。水稻中GA通過解除DELLA蛋白OsSLR1對NAC29/31、MYB103L等次生壁轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的抑制作用，從而激活NAC-MYB次生壁合成通路，促進纖維素合成[13-14]。水楊酸（salicylicacid，SA）是植物內(nèi)源激素，對長春花幼苗外源施加水楊酸能夠增加PAL、POD酶活性，導致細胞壁木質(zhì)化程度提高，增強植物的抗逆性，以抵御不良環(huán)境脅迫[15]。生產(chǎn)實踐中用多效唑（paclobutrazol，PCB）作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑來增加莖稈木質(zhì)素含量，增強機械強度，防止倒伏[16]。小麥苗期用PCB處理，小麥株高降低，基部莖稈細胞壁加厚，木質(zhì)素與纖維含量上升，增強了小麥的抗逆性[17]。由此可見，外源激素和植物生長調(diào)節(jié)劑可誘導木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達，對促進植物細胞壁合成有重要的調(diào)節(jié)作用?！颈狙芯壳腥朦c】NST轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥、玉米和楊樹等植物中開展大量研究，結(jié)果表明NST通過激活植物次生壁木質(zhì)素和纖維素合成途徑中一系列相關(guān)基因的表達，從而對木質(zhì)素和纖維素合成起重要的調(diào)節(jié)作用。紫花苜蓿是優(yōu)質(zhì)飼草，木質(zhì)素和纖維素含量是影響苜蓿消化率和營養(yǎng)價值的主要因素之一，然而苜蓿中關(guān)于NST轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控木質(zhì)素與纖維素合成的分子機制鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以紫花苜蓿為研究對象，克隆了MsNST轉(zhuǎn)錄因子，分析了其在外源激素誘導下的表達模式；通過在擬南芥和苜蓿中超表達MsNST，解析了該基因?qū)俎＜毎谥欣w維素和木質(zhì)素合成以及總糖含量的影響，為揭示細胞壁物質(zhì)合成的分子機制奠定基礎(chǔ)。

圖1 纖維素與木質(zhì)素合成途徑示意圖Fig. 1 Cellulose and lignin biosynthesis pathway

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)

紫花苜蓿中苜1號（Medicago sativaL. Zhongmu No.1）、擬南芥（Col生態(tài)型）由中國農(nóng)業(yè)科學北京畜牧獸醫(yī)研究所飼草遺傳育種實驗室保存。紫花苜蓿種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽3d，移栽到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中置于植物生長間培養(yǎng)（16 h光照 / 8 h黑暗，溫度25℃，濕度60%—70%）。培養(yǎng)30d進行脅迫處理，分別以 20 μmol GA3、250 μmol SA、10 μmol PCB處理12 h，每隔4 h取全部莖段，立即投入液氮冷凍，保存在-80℃冰箱，不處理為對照，每個處理 3個生物學重復。擬南芥種子經(jīng)過1%升汞消毒，滅菌水清洗7次，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周（16 h光照 / 8 h黑暗，22℃，濕度60%—70%），然后移栽到土壤（營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1）中生長7周用于后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿通過扦插擴繁觀察表型并進行指標測定。本研究始于2018年開始，所有試驗均在中國農(nóng)業(yè)科學北京畜牧獸醫(yī)研究所飼草遺傳育種實驗室完成。

1.2 MsNST的克隆

紫花苜?？俁NA提取參考植物總RNA提取試劑盒說明書操作（Promega，上海普洛麥格生物技術(shù)有限公司）。取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，北京六合通生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。由蒺藜苜蓿MtNST1全長CDS序列（GenBank: GU144511.1）為參考，分別在 5′UTR 與 3′UTR 區(qū)設(shè)計一對引物MsNST-f/r （表1），以紫花苜蓿cDNA為模板克隆MsNST，通過測序獲取MsNST全長CDs序列（北京天一輝遠生物技術(shù)有限公司）。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI的ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測最大開放閱讀框；利用ExASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/computepi）預測MsNST蛋白分子量大小、理論等電點和親水性；利用Protscale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；通過Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）以擬南芥NAC1為模板預測MsNST蛋白的三級結(jié)構(gòu)；通過Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行蛋白亞細胞定位分析；利用DNAMAN軟件（version 7.0.2）對MsNST序列與擬南芥NST1-3序列進行相似性比對；利用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 GA3、SA、PCB誘導下MsNST表達分析

分別取 GA3、SA、PCB誘導下各處理的樣品提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)基因的序列設(shè)計1對引物qNST-f/r（表1），以紫花苜蓿β-Actin 2為內(nèi)參，通過qRT-PCR檢測各個時間點MsNST基因的表達水平。

1.5 過表達載體PBI121-MsNST的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

利用W-NST-F/R為上下游引物擴增帶有特殊同源臂的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與PBI121過表達載體連接，并轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，采用花序浸染法對擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化。另外，將PBI121-MsNST質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，以紫花苜蓿葉片為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌侵染法進行轉(zhuǎn)化[22]。

1.6 擬南芥中過表達MsNST轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

為了篩選陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，將 T0代擬南芥種子用1%升汞消毒后種在含kan（50 mg·L-1）的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，篩選kan抗性擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，設(shè)計一對引物Ntest-f/r（表1）進行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。為了探索過表達MsNST對擬南芥下胚軸發(fā)育的影響，將T2代擬南芥種子消毒后，播種在1/2 MS固體平板上，分別在避光和正常光照條件下生長，挑選20株長勢一致的擬南芥株系，其中10株置于同一個平板上，每隔1d統(tǒng)計每株下胚軸長度，共統(tǒng)計5d；另外10株置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到7周齡，分別對株高、鮮重進行統(tǒng)計。同時，將7周齡擬南芥莖基部第一節(jié)用刀片截成0.5cm的莖段，放入75%酒精中真空抽氣10min，室溫放置5 h固定，將材料轉(zhuǎn)入包埋劑中室溫放置過夜。用冷凍切片機（萊卡Y470）將莖部橫切，切片厚度為50μm，置于載玻片上，加一滴1%間苯三酚于切片上室溫染色2min，然后再加一滴40%濃鹽酸進行顯色，甘油封片后在光學顯微鏡（Olympus FV500，日本）下觀察拍照。

1.7 纖維素與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達分析

分別取過表達MsNST的紫花苜蓿與擬南芥轉(zhuǎn)基因植株莖組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)基因序列設(shè)計1對引物qNST-f/r（表1），以β-Actin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因株系中MsNST的相對表達水平。選取表達量最高的株系檢測與纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)合成基因的表達量變化，其中紫花苜蓿分別為MsCesA3，MsCesA6，MsCesA7，MsPAL，Ms4CL，MsCoMT，擬南芥為AtPAL1、At4CL1、AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8（引物見表1），每個反應(yīng)3個生物學重復。

1.8 總糖、結(jié)晶纖維素和木質(zhì)素含量測定

取生長7周齡轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥各10株，分別置于牛皮紙袋放入鼓風干燥箱烘干至恒重（80℃），利用組織研磨儀將樣品粉碎（振動頻率為70Hz）。分別稱取約300 mg粉末，參考Foster方法進行粗細胞壁分離（cell wall resider，CWR），測定木質(zhì)素含量[23]。稱取100 mg CWR置于試管中，加入72 % 濃硫酸，冰浴30 min，12 000 r/min離心，將上清液稀釋10倍，采用植物結(jié)晶纖維素檢測試劑盒（Solarbio, 北京索萊寶科技有限公司）測定纖維素的含量。分別稱取5 mg CWR，用72 %濃硫酸室溫水解20 min，用蒸餾水將硫酸濃度稀釋到4 %，加熱到121℃水解1 h，利用蒽酮比色法測定總糖含量，以上試驗均為3個生物學重復。

2 結(jié)果

2.1 MsNST的克隆及生物信息學分析

同源克隆獲得MsNST的cDNA序列為1 121bp，最大開放閱讀框為945bp，編碼314個氨基酸（圖2）；Blast結(jié)果表明，該基因與其它物種的NST同源，故將該基因命名為MsNST；ExASy在線預測MsNST蛋白分子量為36.25 kD，理論等電點為6.84；MsNST全部氨基酸的平均親水系數(shù)為-0.986，表明其為親水性蛋白質(zhì)（圖3-A）；TMHMM預測該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖 3-B）。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，占總體的60.83 %，α螺旋占17.52 %，β折疊占4.14 %，轉(zhuǎn)角為17.52 %（圖3-C）。以擬南芥NAC1蛋白為模板模擬蛋白三維結(jié)構(gòu)并建模，結(jié)果表明 MsNST可能是通過形成中心對稱的二聚體結(jié)構(gòu)行使功能（圖3-D）；通過Cell-PLoc 2.0軟件預測，該蛋白定位在細胞核上（圖3-E）。

MsNST與擬南芥3個NST氨基酸序列進行多重比對表明，MsNST與擬南芥AtNST1的相似性較高為55.9%，與AtNST2和AtNST3的相似性分別為51.6%、49%。MsNST的N端序列保守，具有NAC 類轉(zhuǎn)錄因子特有的5個保守亞結(jié)構(gòu)域[24]，而C端序列不保守（圖4）。進化樹分析表明，MsNST與豆科模式植物蒺藜苜蓿MtNST1的親緣關(guān)系最近，不同物種進化樹分為單子葉與雙子葉2大類，MsNST分布在雙子葉植物分支中，表明NST轉(zhuǎn)錄因子在雙子葉和單子葉植物中存在進化差異（圖5）。

圖2 紫花苜蓿MsNST的克隆Fig. 2 Cloning of MsNST from alfalfa

圖3 MsNST生物信息學分析Fig. 3 Bioinformatics analysis of MsNST

圖4 MsNST和AtNST1,2,3的氨基酸序列比對Fig. 4 Amino acid alignment of MsNST and AtNST1, 2, and 3

圖5 不同植物NST基因的系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Phylogenetic analysis of NSTs from different plant species

2.2 不同誘導條件下MsNST的表達分析

植物激素對植物生長發(fā)育和形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了揭示施加外源激素對MsNST表達的調(diào)控作用，本研究分別用赤霉素、多效唑和水楊酸處理紫花苜蓿，分析MsNST受激素誘導后的表達特性，結(jié)果表明，GA3處理會誘導MsNST表達量上調(diào)，在誘導12h時表達量達到最高水平，為對照的2.19倍（圖6-A）。施加PCB誘導結(jié)果表明，在PCB誘導初期，MsNST基因表達量下調(diào)在4h時達到最低水平，是未處理的0.72倍，隨后表達量上調(diào)，在誘導12h達到最高表達水平，為對照的3.65倍（圖6-B）。施加SA誘導初期，在4h時表達量顯著降低為對照的0.49倍，隨后表達量上調(diào)，在 12h時達到最高水平是對照的3.67倍（圖6-C）。

圖6 利用qRT-PCR檢測不同激素處理對苜蓿莖MsNST表達的影響Fig. 6 Effects of various treatments on MsNST expression in alfalfa stems using qRT-PCR

2.3 擬南芥中過表達MsNST的功能分析

為驗證MsNST的功能，通過 kan抗性篩選與PCR鑒定過表達MsNST擬南芥陽性株系（圖7-B）。隨機挑選 6個過表達的轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比株高出現(xiàn)不同程度的矮化（圖 7-A），其中35S::MsNST-Line4中MsNST表達量最高，是對照的3.47倍(圖 7-C)。觀測Line4和WT植株下胚軸的生長情況發(fā)現(xiàn)，光照條件下35S::MsNST-Line4與 WT的下胚軸長度變化不明顯；黑暗條件下，35S::MsNST-Line4下胚軸生長受到抑制，萌發(fā) 5天時35S::MsNST-Line4下胚軸長度為9.02 mm，顯著短于對照組（11.39mm）（圖7-D）。對生長7周齡的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥株高等指標進行測定，轉(zhuǎn)基因擬南芥株高平均值為27.62cm，與對照相比株高降低了 10.4%；轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮重降低（1.12g），比對照降低了20%（圖7-E）。

2.4 過表達MsNST對木質(zhì)素、纖維素及總糖含量的影響

通過對過表達擬南芥35S::MsNST-Line4和WT植株從下數(shù)第一節(jié)莖段橫切，利用間苯三酚-鹽酸對細胞壁中木質(zhì)素染色，顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)35S::MsNST-Line4的束間纖維（interfascicular fiber，IF）細胞壁厚度增加（圖8-A），統(tǒng)計分析表明Line4束間纖維細胞壁平均厚度為 1.58μm，WT細胞壁厚度為 0.92μm，與WT相比過表達MsNST纖維細胞壁厚度增加了71.7%（圖8-B），暗示MsNST對束間纖維細胞壁的合成具有一定調(diào)節(jié)作用。對過表達 Line4株系的木質(zhì)素和纖維素含量測定表明，轉(zhuǎn)基因植株細胞壁木質(zhì)素含量相比WT提高了11.7%（圖8-C）；Line4株系結(jié)晶纖維素含量為 239.15 mg·g-1，是 WT的 1.13倍（圖8-D）；總糖含量為355.55mg·g-1，比WT提高了7%（圖8-E）。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定與表型分析Fig. 7 Identification and phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

圖8 過表達MsNST對細胞壁厚度及木質(zhì)素、纖維素和總糖含量的影響Fig. 8 Effects of overexpression MsNST on cell wall thickness, lignin, cellulose and total sugar content in transgenic Arabidopsis thaliana

2.5 過表達 MsNST擬南芥中纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的表達分析

為了揭示MsNST對次生壁纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的調(diào)控作用，利用qRT-PCR檢測Line4株系中次生壁纖維素合成關(guān)鍵基因AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8和木質(zhì)素合成相關(guān)基因AtPAL1、At4CL1和AtCOMT的表達量水平，結(jié)果顯示過表達MsNST提高了次生壁纖維素合酶亞基基因AtCesA4，7，8的表達水平，其中AtCesA7表達量上調(diào)最為明顯，是野生型的2.81倍；木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因AtPAL1, At4CL1和AtCOMT的表達水平也提高，分別是對照的1.64倍，1.77倍和2.28倍（圖9）。

2.6 過表達 MsNST紫花苜蓿的鑒定與木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達分析

經(jīng)抗性篩選獲得抗kan的紫花苜蓿株系，經(jīng)鑒定獲得的4株過表達轉(zhuǎn)基因株系，其中OE1表達量最高，是對照的2.7倍（圖10-A, B）。生長1個月的OE1植株高度為23.45cm，低于對照組26.32cm（圖10-C）。從頂端往下測定6個節(jié)間長度的結(jié)果表明，從第二個節(jié)間開始明顯短于對照組（圖 10-D）。qRT-PCR分別檢測各轉(zhuǎn)基因株系中MsNST的表達量，結(jié)果表明過表達株系OE1中MsNST表達量顯著上調(diào)，是對照組的2.74倍。對纖維素與木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的表達分析表明，纖維素合成關(guān)鍵基因MsCesA6和MsCesA7表達量上調(diào)表達，分別為對照的1.45倍和1.43倍（圖10-E）。木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因MsPAL、Ms4CL和MsCOMT也得到不同程度上調(diào)，其中MsPAL表達量最大，是對照的1.5倍（圖10-E）。

圖9 過表達MsNST基因擬南芥中纖維素與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達分析Fig. 9 Expression analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis in overexpression MsNST transgenic Arabidopsis thaliana

圖10 過表達MsNST紫花苜蓿的獲取及其木質(zhì)素和纖維素合成相關(guān)基因的表達分析Fig. 10 Identification of transgenic alfalfa and analysis of genes related to cellulose and lignin synthesis of transgenic lines

3 討論

NAC家族的NST轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物次生壁物質(zhì)合成[3-5,7,9,25]。OOKA在分析擬南芥和水稻 NAC轉(zhuǎn)錄因子的保守性時，發(fā)現(xiàn) N端含有A、B、C、D、E 5個保守的結(jié)構(gòu)域[24]。本研究將MsNST氨基酸序列與擬南芥3個同源基因進行相似性比對，結(jié)果表明在N端也具有5個典型的NAC保守結(jié)構(gòu)域，與Ooka的分析結(jié)果一致；然而MsNST氨基酸序列的C端不保守，可能是導致該基因的功能具有多樣性的主要原因（圖 3）。系統(tǒng)進化樹分析顯示，不同植物的NST分為單子葉和雙子葉兩個分枝，暗示不同物種之間存在一定程度的進化；但是MsNST與豆科模式植物蒺藜苜蓿NST1的同源性最近，表明其可能與MtNST1具有相似的功能。前人研究表明NAC類轉(zhuǎn)錄因子大都通過兩個反向平行的β折疊片和2個鹽橋作用形成同源或異源二聚體，起到轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用，其中N端保守的精氨酸（R）和谷氨酸（E）位點對鹽橋形成起到關(guān)鍵作用[26]。對MsNST蛋白序列分析表明，N端保守序列中具有參與鹽橋形成的精氨酸和谷氨酸保守位點，三級結(jié)構(gòu)預測也表明其能夠通過兩個β折疊形成同源二聚體結(jié)構(gòu)，表明MsNST很可能通過形成同源二聚體結(jié)構(gòu)對靶基因起作用。

GA是植物內(nèi)源激素，在植物次生壁發(fā)育中起到重要作用。研究表明，煙草內(nèi)源GA3含量增加會提高莖的木質(zhì)化程度[27]。擬南芥和白樺外源施加 GA也顯著增加莖中木質(zhì)部的面積占比[28-29]。此外，水稻OsSLR1是一種受GA信號誘導裂解的DELLA阻遏蛋白，可以直接與 OsNAC相互作用，抑制NAC-MYB級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控次生壁合成基因表達[13]。以上研究結(jié)果與本研究中GA3誘導MsNST表達水平升高相符合（圖5-A），表明在紫花苜蓿中GA3具有激活MsNST表達的作用。生產(chǎn)中常用植物生長調(diào)節(jié)劑多效唑（PCB）降低頂端優(yōu)勢，增加壁厚，提高植株耐逆性。施加PCB能夠顯著提高莖稈中PAL和 CAD等酶活性，增加植物次生壁厚度，促進莖稈木質(zhì)素積累，增強植物莖稈的抗倒伏能力[17,30-31]。研究表明PCB抑制植物體內(nèi)GA的生物合成[32]，本研究施加PCB短期內(nèi)（0—4h），MsNST表達量受到PCB影響而降低，可能是 PCB抑制了植物體內(nèi)的GA合成，降低MsNST表達。PCB處理 4—8h時MsNST表達量顯著提高，這與施加PCB能夠提高植株莖中細胞壁厚度與積累木質(zhì)素相符合。然而，PCB導致次生壁NST類轉(zhuǎn)錄因子激活的分子調(diào)控機制還未見報道，筆者猜想PCB可能還存在其他途徑直接或間接影響MsNST表達，具體分子調(diào)控機制還需要進一步的研究。SA是植物響應(yīng)生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)激素，由苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）催化合成的肉桂酸鹽經(jīng)苯甲酸鹽合成[33]。外施SA 12h提高了MsNST的表達水平，表明 SA能夠通過誘導MsNST表達促進細胞壁積累木質(zhì)素和纖維素，增加植物對病原菌的抵抗能力[15,34-35]，但是SA誘導初期MsNST表達量出現(xiàn)明顯下調(diào)的現(xiàn)象還沒有明確的研究結(jié)果。

擬南芥、玉米和楊樹等植物中，過表達NST會造成纖維細胞次生壁增厚，細胞壁中纖維素與木質(zhì)素含量顯著增加[5,9,25,36]。此外，擬南芥nst1nst3和截形苜蓿mtnst1突變體中，由于NST的突變，造成植物莖纖維細胞次生壁缺失，木質(zhì)素與纖維素含量顯著降低[4-5,37]。本研究在擬南芥與紫花苜蓿過表達MsNST，導致轉(zhuǎn)基因植株矮化，各節(jié)間高度受到抑制。此外，擬南芥花序莖束間纖維細胞壁增厚，細胞壁結(jié)晶纖維素與木質(zhì)素含量顯著增加，表明MsNST與其它植物中NST轉(zhuǎn)錄因子的功能相似，在調(diào)控纖維素與木質(zhì)素生物合成過程中起到重要作用。筆者還發(fā)現(xiàn)MsNST影響黑暗條件下擬南芥下胚軸發(fā)育，暗示MsNST可能在擬南芥下胚軸發(fā)育時參與細胞壁物質(zhì)合成。研究表明，許多纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達受到NST的影響，從而影響次生壁纖維素與木質(zhì)素合成，例如AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8是組裝擬南芥次生壁CSC必須的亞基，對植物次生壁纖維素合成起到關(guān)鍵作用[38-41]。研究表明，擬南芥MYB46及其同源基因MYB83是SND1/NST3轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因，MYB46通過反應(yīng)順式調(diào)控元件（SMRE）直接結(jié)合CesAs的啟動子，形成保守的 NACs-MYBs-CesAs纖維素合成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[42]。木質(zhì)素合成調(diào)控機制還未明確，但是擬南芥PAL1、4CL1、COMT等木質(zhì)素合成過程中重要酶基因表達都受到 NST轉(zhuǎn)錄因子的影響[3-5]。豆科模式植物蒺藜苜蓿與單子葉玉米中NST突變導致纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因表達量下調(diào)[9,37]。本研究對過表達MsNST擬南芥和紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因株系的纖維素與木質(zhì)素合成基因定量分析表明，MsNST對纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達具有一定的調(diào)節(jié)作用，從而促進纖維素與木質(zhì)素合成。本研究初步揭示了紫花苜蓿MsNST轉(zhuǎn)錄因子在細胞壁纖維素和木質(zhì)素合成中的正調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究克隆了紫花苜蓿木質(zhì)素和纖維素合成過程中的關(guān)鍵基因（MsNST），該基因在細胞壁木質(zhì)素和纖維素合成中起到正向調(diào)控作用，激活下游基因表達。MsNST基因隸屬NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，并具有該家族的特有的 NAC保守結(jié)構(gòu)域。MsNST受到外源激素GA3、PCB和SA誘導表達。