胺碘酮與決奈達隆誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂的機制研究

趙圣剛 許建江 孫鳳娟 張祥宇 張冉 江力勤

胺碘酮是廣泛應(yīng)用于臨床的抗心律失常藥物，但該藥可造成肝臟、甲狀腺、肺等器官組織損傷，最終導(dǎo)致非酒精脂肪性肝病、肝損傷、肺纖維化和甲狀腺功能障礙等[1-3]，決奈達隆和胺碘酮可導(dǎo)致總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平升高等為主要表現(xiàn)的血脂紊亂[1，4-12]。目前研究認為胺碘酮分子結(jié)構(gòu)類似甲狀腺激素，可與甲狀腺激素競爭性結(jié)合肝臟甲狀腺受體β1（thyroid receptor β1，TRβ1），進而誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂。此外決奈達隆作為胺碘酮的替代藥物，在胺碘酮分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上去除碘，降低了胺碘酮由于高碘導(dǎo)致的甲狀腺功能損害的發(fā)生率。本研究旨在探討胺碘酮和決奈達隆誘發(fā)血脂代謝紊亂的初步機制，評價藥物的安全性，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠30只由浙江省實驗動物中心供應(yīng)[合格證：SCXK（浙）2008-0033號]，清潔級，體重180～220 g。經(jīng)常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)表法分為胺碘酮（AM）組、決奈達隆（DR）組、對照組，每組10只。根據(jù)人和動物間體表面積折算系數(shù)計算等效劑量和課題組前期試驗確定，胺碘酮和決奈達隆藥物劑量均為120mg·kg-1·d-1。動物實驗條件：SPF級大鼠飼養(yǎng)室、SPF級大鼠實驗室，溫度（22±2）℃，濕度 50%～70%，光照 150～200 Lx，12 h明暗交替，噪音＜50 dB，屏障系統(tǒng)溫度、濕度、光照、壓力梯度等設(shè)有自動控制和顯示系統(tǒng)，每籠5只，飼養(yǎng)于不銹鋼籠具中。采用不同濃度等容積灌胃給藥，給藥體積為2 ml/100 g，每天上午給藥1次，對照組喂等量的自來水，連續(xù)15周。

1.2 藥物及試劑儀器 胺碘酮：類白色片，批號：175；決奈達?。侯惏咨?，批號：HK-59499，由賽諾菲安萬特制藥有限公司生產(chǎn)。TRβ1、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated potein kinase，AMPK）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）、低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R）免疫組化采用美國R＆D公司試劑盒（批號：AF3059）。LIBOR AEL200型電子分析天平為日本島津產(chǎn)品，Motic生物顯微圖像采集分析系統(tǒng)為廈門麥迪奧克儀器公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 臟器分離 大鼠喂養(yǎng)至滿13周，7%水合氯醛1 ml/100g腹腔麻醉后，分離肝臟。

1.3.2 免 疫 組 化 檢 測 TRβ1、AMPK、PPARα、LDL-R的表達 肝臟組織切片樣本以含H2O2的甲醇溶液（1∶50）滅活過氧化物酶，PBS液充分淋洗，1.5%封閉血清孵育0.5h后，滴加一抗鼠抗TRβ1、AMPK、PPARα（1∶100）孵育過夜，次日 PBS液充分淋洗，二抗孵育0.5 h，PBS液淋洗后滴加AB酶孵育0.5 h，PBS液充分淋洗后加入過氧化物酶底物顯色，蒸餾水沖洗后，鏡下觀察。以95%乙醇10 s×2次，100%乙醇10 s×2次，二甲苯10 s×3次，進行脫水封片，擦去多余二甲苯。陰性對照以PBS液代替一抗，其余步驟同前，顯微鏡攝片。利用ImageJ軟件半定量分析免疫組化圖片中TRβ1、AMPK、PPARα、LDL-R表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟TRβ1免疫組化結(jié)果 見圖1。

由圖1可見，TRβ1多集中于血管周圍肝臟細胞上。3組TRβ1面積分數(shù)分別為NC組10.75±2.03，AM 組 10.64±2.13，DR 組 10.25±6.63，3 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠肝臟AMPK免疫組化結(jié)果 見圖2。

由圖2可見，AMPK表達部分位于細胞胞漿中。3組AMPK面積分數(shù)分別為NC組26.48±1.23，AM組11.39±6.63，DR組16.06±6.70,雖然 AM組及DR組表達水平低于NC組，但3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠肝臟PPARα免疫組化結(jié)果 見圖3。

由圖3可見，對照組門管區(qū)域胞漿區(qū)域可見散在棕色部分，3組PPARα面積分數(shù)分別為NC組15.22±2.34，AM 組 13.56±6.72，DR 組 10.45±7.08，3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肝臟TRβ1免疫組化結(jié)果（A：對照組，B：胺碘酮組，C：決奈達隆組；×200）

2.4 各組大鼠肝臟LDL-R免疫組化結(jié)果 見圖4。

由圖4可見，肝臟LDL-R明顯表達于胞膜上，其中以NC組最為明顯，DR組次之，而AM組表達最低。3組LDL-R面積分數(shù)分別為NC組40.53±6.13，AM 組 18.70±10.56，DR 組 26.92±1.84，3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中NC組高于AM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝臟AMPK免疫組化結(jié)果（A：對照組，B：胺碘酮組，C：決奈達隆組；×200）

圖3 各組大鼠肝臟PPARα免疫組化結(jié)果（A：對照組，B：胺碘酮組，C：決奈達隆組；×200）

圖4 各組大鼠肝臟LDL-R免疫組化結(jié)果（A：對照組，B：胺碘酮組，C：決奈達隆組；×200）

3 討論

心律失常抑制試驗（cardiac arrhythmia suppression trial，CAST）結(jié)果發(fā)布以后，傳統(tǒng)抗心律失常藥物治療觀念發(fā)生了明顯改變，Ⅰ類抗心律失常藥物的重要性逐漸降低。胺碘酮作為廣譜的Ⅲ類抗心律失常藥物，具有低致心律失常和弱負性肌力的特性，所以臨床應(yīng)用更加普遍[1-3]。決奈達隆為胺碘酮的去碘衍生物，兩者分子結(jié)構(gòu)均類似甲狀腺激素[4-5]。

臨床研究及動物基礎(chǔ)研究均提示胺碘酮可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。Pollak等[6]對服用胺碘酮患者（血脂及甲狀腺功能正常）隨訪18個月觀察血脂變化，得出胺碘酮可引起TC、HDL-C、LDL-C以及磷脂水平升高。為進一步分析其機制，可能為胺碘酮干擾膽固醇合成和脂質(zhì)代謝途徑。具體表現(xiàn)為胺碘酮可與甲狀腺激素競爭性結(jié)合肝臟TRβ1，下調(diào)編碼肝臟LDL-R的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，抑制TG轉(zhuǎn)化為極低密度脂蛋白，抑制脂肪酸β氧化，抑制微粒體轉(zhuǎn)運蛋白等，最終導(dǎo)致以TG、LDL-C、TC等水平升高為主的脂質(zhì)代謝紊亂[7-9]。而補充甲狀腺激素后能減輕胺碘酮導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂程度，并且胺碘酮導(dǎo)致的肝臟LDL-R下調(diào)現(xiàn)象也得到逆轉(zhuǎn)[7]。其他實驗同樣得出胺碘酮顯著升高TG、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺水平，其機制可能與抑制脂肪酸氧化，促進脂質(zhì)和脂滴形成相關(guān)基因和蛋白表達水平有關(guān)，導(dǎo)致TG在肝臟細胞內(nèi)積聚[11-12]。本實驗也得出胺碘酮和決奈達隆可降低肝臟LDL-R表達密度，其中胺碘酮影響更為顯著，與前述研究相似，解釋了課題組前期研究得出胺碘酮和決奈達隆誘發(fā)LDL-C水平升高的現(xiàn)象[1]。決奈達隆組肝臟LDL-R表達受影響程度弱于胺碘酮組，其機制可能與胺碘酮誘發(fā)甲狀腺功能障礙發(fā)生率高有關(guān)。

胺碘酮本身可導(dǎo)致甲狀腺功能障礙，同時由于其分子結(jié)構(gòu)類似甲狀腺激素，所以可與甲狀腺激素競爭性結(jié)合肝臟TRβ1。因此胺碘酮可引起類似甲狀腺功能減退特征性的血脂譜變化（TC及LDL-C水平升高等）[10-13]。目前認為甲狀腺功能減退患者出現(xiàn)血脂代謝改變的機制可能由于偏低的甲狀腺激素水平結(jié)合肝臟TRβ受體的能力下降，進而激活TRβ受體下游的AMPK及后續(xù)分子的能力下降，如乙酰輔酶A羧化酶、羥甲基戊二酸、p38絲裂原活化蛋白激酶和PPARα等，從而引起糖脂代謝紊亂[13-15]。本實驗得出胺碘酮和決奈達隆對肝臟TRβ1表達沒有影響，其原理為胺碘酮及決奈達隆只與甲狀腺受體β1結(jié)合，而不引起受體降解或表達受損[4]。由于干擾了甲狀腺激素與TRβ1結(jié)合，所以可引起下游AMPK激活障礙。所以本研究顯示胺碘酮組及決奈達隆組AMPK表達下降，但對于AMPK下游PPARα未見明顯改變的原因可能為PPARα為核受體，具體機制較為復(fù)雜，也有可能本研究采用免疫組化方法，技術(shù)較為粗糙，出現(xiàn)假陰性。所以需進一步的探討。

本研究得出胺碘酮及決奈達隆對TRβ1的表達未見明顯改變，但對LDL-R影響較大，支持胺碘酮和決奈達隆誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象。但由于本研究僅用了免疫組化一種方法，需要從基因和蛋白角度進一步分析研究結(jié)論，所以后期將對胺碘酮與甲狀腺激素競爭性結(jié)合TRβ1、AMPK、LDL-R蛋白和基因表達水平進一步探討。