一測多評法測定復(fù)方金線蓮中4種活性成分的含量

許曉文， 洪瑞霞， 楊麗娟， 黃麗英

復(fù)方金線蓮口服液是由金線蓮、靈芝提取液制成，具有清熱解毒、益氣涼血的功效，適用于急性或慢性肝炎、乙肝病毒攜帶者之熱毒氣虛證，是福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院的院內(nèi)制劑。金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物的新鮮或干燥全草，主產(chǎn)于福建、浙江、臺灣、云南等地，具有多種藥理功效，在東南亞及我國民間廣泛用于治療肝炎、高血壓病、腫瘤、腎炎和糖尿病等，特別是保肝作用倍受人們青睞，在福建、廣東和臺灣民間廣泛用于治療肝炎[1-2]。靈芝在我國已有2 000多年的藥用歷史，被歷代醫(yī)藥學(xué)家視為滋補強壯、扶正固本的神奇珍品。核苷類物質(zhì)是金線蓮的主要活性成分[3]，具有明顯的藥理活性，對于急、慢性肝炎和肝硬化等具有良好的療效[4]。三萜類化合物是靈芝中的主要有效成分(如靈芝酸A[5-6]和赤芝酸C[7])，對多種理化及生物因素引起的肝損傷有保護作用[8]，能促進肝臟對藥物及毒物的代謝，對于中毒性肝炎有確切的療效，可明顯消除慢性肝炎所引起的頭暈、乏力、惡心、肝區(qū)不適等癥狀，并且能夠有效地改善肝功能[9]。

如果以傳統(tǒng)測定方法同時測定中藥材中幾種成分，不但檢驗周期長，還耗能、耗時、耗對照品。一測多評法作為一種對多指標(biāo)質(zhì)量控制的有效方法[10-11]，不僅可測定某個代表性成分，還可計算出其他待測成分的含量，是一種適合中藥特點的多指標(biāo)質(zhì)量評價的新模式[12-14]。鳥苷相對其他對照品價格較便宜，且含量穩(wěn)定，故本研究以鳥苷對照品作為參照物，對其與尿苷、赤芝酸C、靈芝酸A的相對校正因子進行含量計算，以驗證一測多評法在復(fù)方金線蓮口服液多指標(biāo)質(zhì)量控制中應(yīng)用的適用性及可行性。

1 材料與儀器

1.1儀器 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS-2020型)、高效液相色譜儀(LC-15C型，SPD-15C紫外-可見檢測器)及紫外可見分光光譜儀(2450型)(日本島津公司)；Agilent ZOBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國安捷倫公司)；分析天平(BS124S，上海奕宇電子科技有限公司)；精密pH計(UltraBasic-7，美國丹佛儀器有限公司)；自動雙重純水蒸餾器(RE-2000，上海亞榮生化儀器廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑 尿苷(純度≥99%，批號：L1628034，Aladdin試劑公司)；鳥苷(純度≥98%，批號：E1605104，Alfa Aesar公司)；赤芝酸C(純度≥98%，批號：M11M10S82676)、靈芝酸A(純度≥98%，批號：6032)購于Tansoole公司；色譜級的甲醇、乙腈(美國Sigma-Aldrich試劑公司)；其余試劑為分析純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為實驗室自制雙蒸水。

1.3復(fù)方金線蓮口服液 復(fù)方金線蓮口服液(每支10 mL，生產(chǎn)批號：20181104，20190603，20191102，由福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院提供)。

1.4方法

1.4.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZOBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相包括13 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈，二元梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

表1 流動相洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，掃描模式正負離子檢測ESI(±)；霧化器流速：1.5 L/min，干燥氣流速(N2)：12 L/min；掃描范圍：質(zhì)荷比150～700。接口溫度：350 ℃，加熱塊溫度：200 ℃，DL溫度：250 ℃，進樣量：20 μL。

1.4.3對照品溶液的制備 分別精密稱取尿苷10.0 mg、鳥苷10.0 mg、赤芝酸C 9.0 mg和靈芝酸A 10.0 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成對照品溶液的濃度分別為尿苷1 g/L、鳥苷 1 g/L、赤芝酸C 0.9 g/L、靈芝酸A 1 g/L。置于4 ℃的冰箱內(nèi)，待用。

1.4.4混合對照品溶液的制備 分別精密吸取對照品溶液尿苷600 μL、鳥苷600 μL、赤芝酸C 222 μL、靈芝酸A 1 600 μL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成尿苷0.06 g/L、鳥苷0.06 g/L、赤芝酸C 0.02 g/L、靈芝酸A 0.16 g/L。

1.4.5陰性對照溶液的制備 按照復(fù)方金線蓮口服液的處方比例和生產(chǎn)工藝，分別制備不含金線蓮和靈芝的陰性對照溶液。

1.4.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取上述混合對照品溶液8,5,2.5,1,0.5,0.25,0.062 5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，稀釋得到7個不同濃度的混合對照品溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進樣20 μL，測定。

1.4.7質(zhì)譜定性分析 按1.4.2項下質(zhì)譜條件，對供試品溶液進行質(zhì)譜定性分析。

1.4.8外標(biāo)法 將同一批次的10瓶復(fù)方金線蓮口服液均勻混合在一起，0.45 μm微孔濾膜濾過，即為供試品溶液。按1.4.1項下色譜條件對供試品溶液進樣20 μL測定，以外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量。測定重復(fù)3次。

1.4.9一測多評法 混合對照品溶液(尿苷30 μg/mL、鳥苷30 μg/mL、赤芝酸C 10 μg/mL、靈芝酸A 80 μg/mL)進樣2,5,10,15,20 μL，分別進行測定，計算得到各自的校正因子f(f=W/A，W是物質(zhì)的含量，A是檢測器響應(yīng)值)以及相對校正因子fkm(fkm=fk/fm，k是參照物，m是其他成分)。按1.4.1項下色譜條件對供試品溶液進樣20 μL測定，獲得各個成分的峰面積，以一測多評法(Wm=fkm×Ak×Wk/Ak)計算含量。上述進樣測定重復(fù)3次[15]。

2 結(jié) 果

2.1HPLC-ESI/MS鑒定4種有效成分

2.1.1對照品溶液和供試品溶液的HPLC-UV分析 在1.4.1項色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液經(jīng)HPLC-UV分析得色譜圖(圖1)，對照品中的4種有效成分尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的保留時間分別為7.23,17.29,36.37和49.17 min，各對照品的濃度分別為30,30,10和80 μg/mL。根據(jù)保留時間，復(fù)方金線蓮口服液色譜圖的1,2,3,4號色譜峰分別初步鑒定為尿苷、鳥苷、赤芝酸C、靈芝酸A。

2.1.2方法專屬性 取陰性對照溶液，在1.4.1項色譜條件下進行分析，結(jié)果表明，金線蓮汁與靈芝原液中都含有尿苷和鳥苷，且金線蓮汁中不含赤芝酸C和靈芝酸A。HPLC色譜圖見圖1。

2.1.3對照品溶液和供試品溶液的MS定性分析 由于中藥材樣品中有效成分復(fù)雜，微量成分的色譜峰有干擾峰的影響，因此，對復(fù)方金線蓮口服液樣品進行質(zhì)譜分析。在1.4.2項質(zhì)譜條件下，對對照品溶液和復(fù)方金線蓮口服液供試品溶液4個色譜峰按出峰順序進行質(zhì)譜分析，得到各離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，質(zhì)譜圖見圖2。圖2(A,A1)分別是對照品和樣品1號色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，質(zhì)荷比245,267分別是尿苷生成的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰和[M+Na]+離子峰；圖2(B，B1)分別是對照品和樣品2號色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，質(zhì)荷比284是鳥苷生成的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰；圖2(C,C1)分別是對照品和樣品3號色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，質(zhì)荷比475是赤芝酸C生成的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰；圖2(D,D1)分別是對照品和樣品4號色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，質(zhì)荷比515是靈芝酸A生成的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。根據(jù)色譜的保留時間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)和文獻資料，樣品溶液中色譜圖峰1、峰2、峰3和峰4分別是尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A。

1：尿苷；2：鳥苷；3：赤芝酸C；4：靈芝酸A. A:混合對照品(尿苷和鳥苷濃度30 μg/mL，赤芝酸C 10 μg/mL，靈芝酸A 80 μg/mL)； B:復(fù)方金線蓮口服液； C:不含金線蓮的陰性對照溶液； D:不含靈芝的陰性對照溶液.圖1 混合對照品、樣品和陰性對照溶液的色譜圖Fig 1 HPLC choromatograms of mixture references ingredients and samples

2.2線性關(guān)系的考察、檢測限和定量限 取上述8個不同濃度混合對照品溶液按1.4.1項色譜條件進行分析，以各對照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，各對照品濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2,表明各化合物在相應(yīng)的濃度線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3精密度試驗 選取一定濃度的混合對照品溶液(尿苷30 μg/mL、鳥苷30 μg/mL、赤芝酸C 10 μg/mL、靈芝酸A 80 μg/mL)，按照1.4.1項色譜條件連續(xù)進樣6次，測定尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的含量并計算RSD值，結(jié)果分別為0.52%,1.34%,1.23%和1.17%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4重復(fù)性試驗 選取一定濃度的混合對照品溶液(尿苷30 μg/mL、鳥苷30 μg/mL、赤芝酸C 10 μg/mL、靈芝酸A 80 μg/mL)，按照1.4.1項色譜條件連續(xù)測定3 d，測定尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的含量并計算RSD值，結(jié)果分別為1.85%,1.64%,1.74%和2.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方金線蓮口服液，在室溫下放置0,1,2,4,6,8,12 h后各精密吸取20 μL進樣，尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的色譜峰面積的RSD(n=6)分別為2.78%,2.81%,1.59%和3.17%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6加樣回收率試驗 精密吸取復(fù)方金線蓮口服液(生產(chǎn)批號：20190603)0.5 mL，按低、中、高水平分別加入適量的混合對照品溶液并定容至1 mL，用0.45 μm微含孔濾膜濾過，進樣20 μL，按照外標(biāo)法計算各成分的含量，并計算回收率，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好(表3)。

A,A1：尿苷； B,B1：鳥苷； C,C1：赤芝酸C； D,D1：靈芝酸A.圖2 4種活性成分的對照品和樣品質(zhì)譜圖Fig 2 Full mass spectrum of four standards and samples

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.7相對校正因子計算 在一定的線性范圍內(nèi)，待測成分的量(W)與檢測器響應(yīng)值(A)成正比，即W=f×A，選取待測成分中一組分k為參照物，建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子，即fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)。配置一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，精密吸取不同體積的同一混合對照品進樣分析，分別計算不同進樣體積下的fkm，然后計算平均值，并以此作為相對校正因子進行樣品測定。按照1.4.9項下試驗方法進樣測定，以鳥苷為內(nèi)參照物，分別計算鳥苷對尿苷、赤芝酸C和靈芝酸A的相對校正因子，相對校正因子的平均值分別為1.02,0.34,0.40，RSD值(n=3)均小于2%。

2.8一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 采用外標(biāo)法和一測多評法計算尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A含量，結(jié)果見表4。

表4 外標(biāo)法和一測多評法測定復(fù)方金線蓮口服液中4種成分含量

將常規(guī)的外標(biāo)法實測含量與一測多評法計算的含量采用向量夾角法進行比較，驗證一測多評法用于多指標(biāo)有效成分質(zhì)量評價的準(zhǔn)確性。夾角余弦值計算公式[16]如下:

本研究采用一測多評法和外標(biāo)法測得4種有效成分的計算值和實測值之間的夾角余弦值均達到0.999 9，表明兩種方法測得的含量沒有顯著性差異，說明一測多評法可用于復(fù)方金線蓮口服液多成分質(zhì)量評價的研究。

3 討 論

本研究考察了不同有機相、pH及乙酸銨濃度對4種有效成分色譜分離的影響，結(jié)果表明流動相為甲醇-乙酸銨時，色譜峰出峰慢，目標(biāo)峰與干擾峰不能得到較好的分離。在乙腈-乙酸銨(13 mmol/L)體系中加入乙酸(pH=4)，各化合物色譜峰就可得到較好的分離。同時，本實驗還對流動相流速、洗脫梯度進行了反復(fù)篩選優(yōu)化，確定了流動相最佳梯度的洗脫程序。

核苷是生物細胞維持生命的重要物質(zhì)，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、調(diào)節(jié)心血管等多種藥理生理活性[17]，尤其是在抗乙型肝炎病毒方面具有明顯的療效[18]，金線蓮及靈芝中均富含核苷類物質(zhì)尿苷和鳥苷[3，19]。三萜類化合物是靈芝的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗病毒、保護肝臟等多種藥理活性[20]，靈芝酸A和赤芝酸C是其中具有代表性的成分。

采用一測多評校正因子對樣品進行含量計算，在不同波長下偏差較大，因此選定適合的波長對降低測定誤差很關(guān)鍵。經(jīng)二極管陣列檢測器分析，尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的最大吸收波長分別為261，251，251和259 nm，綜合考慮4個成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在254 nm處4個成分均有較大吸收且色譜峰分離度良好，達到色譜分析要求，因此選用254 nm作為檢測波長。鳥苷性質(zhì)穩(wěn)定，不與其他成分反應(yīng)，也不受口服液中其他成分干擾，容易購買，以此為參照物，各成分的相對校正因子穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，且相比其他成分分離效果較好。本研究分別采用外標(biāo)法和一測多評法對復(fù)方金線蓮口服液中4種有效成分進行含量測定，結(jié)果使用向量夾角法進行比較分析，2種方法對同一樣品的測定結(jié)果的夾角余弦值為0.999 9，表明2種測定方法所得結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性，說明一測多評法可用于復(fù)方金線蓮口服液中尿苷、鳥苷、赤芝酸C和靈芝酸A的含量測定。本研究的測定方法為復(fù)方金線蓮口服液保肝功效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)，同時，也為復(fù)方金線蓮口服液的藥理活性研究和臨床應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。