紅松種子園單株ISSR-PCR遺傳多樣性分析

童茜坪 剡麗梅 張磊

摘要： ?以林口青山紅松無(wú)性系種子園216個(gè)單株生健康嫩葉為試驗(yàn)材料，利用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性的試驗(yàn)結(jié)果表明：從100條引物中共篩選出11條具有多態(tài)性的ISSR引物，經(jīng)ISSR-PCR擴(kuò)增后共獲得102個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性譜帶102條，多態(tài)位點(diǎn)比率為100%，單株有效等位基因數(shù)變動(dòng)范圍為1.004 6～2.000，群體總基因多樣性指數(shù)為0.333 3，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，期望雜合度為0.004 6～0.500 0，紅松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞： ?ISSR; ?紅松; ?單株; ?遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： ? S 722. 8 + 3， ?S 791. 247 ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001 - 9499（2020）02 - 0017 - 04

紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）為松科松屬的喬木植物， 分布于中國(guó)東北長(zhǎng)白山和小興安嶺，是我國(guó)東北地區(qū)的頂級(jí)森林植被建群樹種，也是優(yōu)良的用材和油料樹種。不同物種的遺傳物質(zhì)是不同的，物種的遺傳多樣性越豐富，適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)[ 1 - 8 ]，而物種遺傳多樣性研究一直是生物學(xué)研究的重點(diǎn)。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷和成本低的特點(diǎn)，已廣泛的應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳育種、種植資源鑒別等內(nèi)容[ 9 - 17 ]。李雪峰通過利用ISSR和RAPD兩種標(biāo)記方法對(duì)興安落葉松105個(gè)無(wú)性系個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平上證明了興安落葉松種源具有豐富的遺傳多樣性[ 18 ]。馮富娟等對(duì)露水河天然種群和種子園內(nèi)紅松優(yōu)良無(wú)性系的遺傳多樣性的研究[ 19 ]。邱新宇應(yīng)用ISSR標(biāo)記了青山種子園長(zhǎng)白落葉松種子園單株樣本[ 20 ]。魏利以引種俄羅斯的西伯利亞紅松不同地理分布區(qū)的19個(gè)種群為材料，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行西伯利亞紅松遺傳多樣性以及種群劃分，證明西伯利亞紅松種群具有豐富的遺傳多樣性[ 21 ]。當(dāng)前，對(duì)紅松分子標(biāo)記遺傳多樣性的研究仍然較少，東北林業(yè)大學(xué)利用已經(jīng)開發(fā)的落葉松ISSR分子標(biāo)記，優(yōu)化了紅松ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，這對(duì)其輔助育種及親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析等研究均具有重要意義。本研究采用黑龍江省林口青山紅松無(wú)性系種子園的紅松單株，從DNA水平上分析遺傳多樣性，為紅松無(wú)性系分子鑒定與遺傳保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黑龍江省林口青山紅松種子園定植的216株紅松單株，1974年定砧木，1978年嫁接，接穗來源于五營(yíng)林業(yè)局。2017年7月4日，采取當(dāng)年生幼嫩健康嫩葉，將灰塵雜物擦凈，分別編號(hào)，置于冰盒保存，帶回試驗(yàn)室后于冰箱-80 ℃冷凍保存。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

利用試劑盒提取紅松總DNA，定容不少于50 uL洗脫緩沖液（北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)）。提取的DNA置于冰箱-40 ℃保存?zhèn)溆?。使用電泳儀（DYY-2C，北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)），用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外吸收法檢測(cè)DNA質(zhì)量，電泳觀察DNA條帶清晰明亮，無(wú)明顯雜帶，則說明DNA完整性較好。樣品DNA最終濃度應(yīng)大于50 ng/uL，以80～100 ng/uL為最宜，DNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度比以O(shè)D260/OD280=1.7～1.9為宜。若樣品DNA OD260/OD280在2.0～2.3之間，則說明DNA中有RNA污染。

1. 2. 2 引物篩選

參照加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR引物序列（上海生工公司合成），隨機(jī)選取3個(gè)單株作為模板進(jìn)行引物篩選，初篩出44條能擴(kuò)增出條帶的引物，再進(jìn)一步選取11條擴(kuò)增條帶多且清晰的引物用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1. 2. 3 ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

擴(kuò)增體系25 uL的PCR反應(yīng)液：模板DNA 1 uL，Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 1 uL，10×PCR Buffer 2.5 ul，DNTP 2 ul，引物（10 μmol/L） 1 uL，ddH2O 17.5 uL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃（引物TM+5 ℃）退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)， 72 ℃補(bǔ)延伸7 min[ 23 ]。從多次試驗(yàn)結(jié)果來看，該體系能有效擴(kuò)增片段，減少PCR儀的損壞率。

1. 2. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與遺傳多樣性分析

利用ISSR反應(yīng)產(chǎn)生的凝膠電泳圖譜，與2 000 bpMaker進(jìn)行比對(duì)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，按擴(kuò)增條帶的有無(wú)記為“1”和“0”，統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)并建立0～1矩陣。利用Popgene32軟件計(jì)算紅松216個(gè)單株的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù) （N， number of polymorphic loci）、多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL， percentage of polymorphic loci）、有效等位基因數(shù)（Ne， effective number of alleles）、期望雜合度（He，Nei's gene diversity）、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I ，Shannon's Information index） [ 24 - 26 ]。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

由紅松基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）可以看出：DNA窄帶較亮且比較集中，未發(fā)現(xiàn)有拖帶彌散現(xiàn)象，提取的紅松DNA樣品濃度及純度符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2. 2 引物篩選

根據(jù)電泳結(jié)果，從100條引物中篩選出11條譜帶清晰、差異明顯、重復(fù)性和穩(wěn)定性高的引物，引物名稱及序列見表1。

2. 3 ISSR-PCR擴(kuò)增

利用11個(gè)引物對(duì)紅松216個(gè)單株的DNA樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到102個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)范圍為250～3 000 bp，多態(tài)位點(diǎn)有102個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率高達(dá)100%。多態(tài)位點(diǎn)比率反映了群體遺傳變異水平的高低，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的群體多態(tài)位點(diǎn)比率也比較高[ 19 ]，試驗(yàn)結(jié)果說明不同紅松單株對(duì)該地區(qū)的適應(yīng)性極強(qiáng)，存在較高水平的變異。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶在4～15條之間，平均每個(gè)引物擴(kuò)增9.27個(gè)條帶，其中，引物UBC841擴(kuò)增位點(diǎn)最多，多達(dá)15個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為60.49%，其它引物UBC864、UBC835、UBC823、UBC808多態(tài)位點(diǎn)百分率也在50%以上，這說明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在檢測(cè)紅松基因組遺傳多態(tài)性上有較好的檢出效率。

2. 4 單株遺傳多樣性分析

由紅松ISSR單株多態(tài)性位點(diǎn)分析（表2）和紅松單株之間的遺傳相似性和遺傳距離（表3）可以看出：（1）單株等位基因數(shù)為2.000，有效等位基因數(shù)變動(dòng)范圍為1.0046～2.000，其中，第57號(hào)單株有效等位基因數(shù)最小，第92號(hào)單株有效等位基因數(shù)最大。（2）Nei's指數(shù)（期望雜合度）為0.004 6～0.500 0，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，群體總基因多樣性指數(shù)為0.333 3，總信息指數(shù)為0.495 4。表明群體中單株之間分化強(qiáng)烈，遺傳變異差別較大。（3）遺傳一致度變化范圍為0.352 9～0.951 0，遺傳距離范圍為0.050 3～1.041 5，變化幅度較大，說明216個(gè)紅松單株之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，第42和43單株遺傳一致度最大（0.995 10），遺傳距離最?。?.050 3），說明這兩個(gè)單株之間遺傳分化最小，親緣關(guān)系最近，極大可能性來源于同一個(gè)無(wú)性系。第99和31，32單株之間遺傳一致度最?。?.352 9），遺傳距離最大（1.041 5），表明第99號(hào)單株與31，32單株之間遺傳分化最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

對(duì)紅松種子園單株樣本進(jìn)行ISSR顯性標(biāo)記，得到多態(tài)性譜帶102條，多態(tài)位點(diǎn)比率高達(dá)100%，Nei's指數(shù)為0.004 6～0.500 0，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，遺傳距離為0.050 3～1.041 5，這表明林口青山紅松種子園中各單株之間遺傳變異明顯，親緣關(guān)系變幅大，多態(tài)性高對(duì)環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)。對(duì)比邱新宇運(yùn)用ISSR標(biāo)記長(zhǎng)白落葉松種子園單株樣本結(jié)果[ 20 ]，林口青山紅松種子園單株多態(tài)性更高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，遺傳多樣性更高，群體總體遺傳變異水平更高，單株間分化強(qiáng)烈，遺傳變異變化幅度更廣，可提供大量無(wú)親緣關(guān)系的優(yōu)良紅松種子。由此可以認(rèn)定，林口青山種子園的紅松單株無(wú)性系有較高的遺傳多樣性水平，且并未在人工栽培馴化過程中丟失大量遺傳變異，更容易擴(kuò)展其分布范圍，擁有較高的進(jìn)化潛力，可用于大量培育優(yōu)質(zhì)紅松單株。

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第1作者簡(jiǎn)介： ?童茜坪（1998- ）， ?女， ?本科， ?研究方向： ?林木遺傳育種。

通訊作者： ?張含國(guó)（1962- ）， ?男， ?教授， ?博導(dǎo)， ?研究方向： ?林木遺傳育種。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（責(zé)任編輯： ? 王 巖）

Abstract With healthy young needles from 216 single plant of Pinus koraiensis in the seed orchard of Linkou， we studied the genetic diversity by ISSR markers. The results showed that 11 polymorphic ISSR primers were screened from 100 primers. After ISSR-PCR were amplified， a total of 102 loci were obtained， and there are 102 polymorphic loci， whose average polymorphism percentage was 100%. The variation range of effective alleles per plant was 1.004 6～2.000. The total genetic diversity index of population was 0.333 3. The Shannon diversity index was 0.016 4～0.693 1， and Nei's gene diversity index was 0.004 6～0.500 0. Finally， Pinus koraiensis in seed orchard had abundant genetic diversity.

Key words ISSR; ?Pinus koraiensis; ?Individual; ?Genetic diversity