桂花樹葉多糖提取及抗氧化活性研究

李建鳳，廖立敏，*

（1.內(nèi)江師范學院化學化工學院，四川內(nèi)江641100；2.“果類廢棄物資源化”四川省高等學校重點實驗室，四川內(nèi)江641100）

桂花樹是我國常見的一種木樨科木樨屬植物，這種芳香花卉是我國比較珍貴的特產(chǎn)。桂花樹一年四季都有綠色的葉子，生態(tài)效益非常好，經(jīng)濟價值及觀賞價值極佳。桂花樹不僅作為一種優(yōu)良的園林樹種被用來美化和綠化環(huán)境，還在香料、食品和醫(yī)藥等方面被加以利用[1]。桂花樹葉中含有豐富的碳水化合物、脂肪類、蛋白質(zhì)類等成分，此外還含有多糖、多肽、酚類、黃酮類化合物等多種活性物質(zhì)。來自于植物組織中的多糖，如綠茶多糖[2]等具有多重生理功效而被研究者重視，例如具備抗氧化、提高免疫、抵抗腫瘤、抵抗病毒、防止凝血以及降低血糖等生物活性和功能[3-4]，作為添加劑廣泛應用于各種保健品、食品、功能飼料中。隨著科學技術的發(fā)展和人們對健康需求的增長，人們對多糖的研究越來越深入[5-7]。目前對桂花樹的研究側(cè)重在環(huán)境美化方面，桂花樹葉有效成分提取方面的研究還未引起人們足夠的重視。

目前提取植物中有效成分的方法主要有超聲波法[8-11]、微波法[12-14]、酶法[15-17]、溶劑提取法[18-20]等。利用溶劑提取法提取多糖，操作簡便、無需特殊儀器設備，但往往存在耗時、多糖得率低等缺點。在溶劑提取基礎上發(fā)展起來的內(nèi)部沸騰法[21-22]是指將一定體積分數(shù)的低沸點溶劑預先浸泡原料并進入組織內(nèi)部，然后加入一定溫度的高沸點溶劑使原料組織內(nèi)部的低沸點溶劑迅速沸騰，破壞原料組織的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，加速有效成分的溶解與擴散而實現(xiàn)對有效成分的提取。本文通過響應面法設計試驗，以乙醇和水作為溶劑采用內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉中的多糖成分，為桂花樹葉的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桂花樹葉：采摘于內(nèi)江師范學院校園內(nèi)的掛花樹；去離子水、無水葡萄糖、苯酚、0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH<7.4）、0.75 mmol/L 的 FeSO4溶液、0.01% H2O2、無水乙醇：成都金山化學試劑有限公司；保鮮膜：市購。

電子分析天平（JA2003A）：上海精天電子儀器有限公司；100g手提式高速粉碎機（DFT-100）：溫嶺市林大機械有限公司；T6型新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；低速大容器離心機（DTL-5-A）：上海市嘉定區(qū)安亭工業(yè)園區(qū)園大路400號；優(yōu)質(zhì)超純水機（UPT-Ⅱ-10T）：成都超純科技有限公司；集熱式磁力攪拌器（DF-10S）：常州未來儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桂花樹葉的預處理

將采摘的新鮮桂花樹葉清洗干凈，60℃下干燥至恒重，將桂花樹葉放入高速粉碎機中粉碎3 min，制得桂花樹葉干粉，用塑料密封袋裝好，放入裝有干燥劑的干燥器中備用。

1.2.2 桂花樹葉多糖的提取及測定

稱取2.000 g桂花樹葉粉末放于100 mL的潔凈干燥的錐形瓶，加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液15 mL，浸泡30 min，使乙醇溶液能夠充分進入桂花樹葉粉末的內(nèi)部，接著將一定溫度、一定體積的熱水加入到其中，使乙醇在植物組織內(nèi)部產(chǎn)生沸騰，提取一定的時間，冷卻后轉(zhuǎn)移至離心機的塑料瓶中4 500 r/min離心5 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)入至比色管中，去離子水定容到一定的體積得待測液。

精密稱取無水葡萄糖7.4 mg，放于體積為50 mL的容量瓶，加入去離子水溶解并稀釋至刻度線，得到葡萄糖的標準溶液為0.148 g/L。稱取2.5 g苯酚溶于去離子水中，并用50 mL的容量瓶配制得5%的苯酚溶液。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，精密移取0、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于5支比色管中，去離子水稀釋到2.0 mL，再加1 mL的5%的苯酚溶液，然后快速加入濃硫酸5 mL，搖晃均勻，靜置20 min使其冷卻到室溫（25℃），空白溶液用去離子水，在波長為490 nm處測定吸光度，葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）作橫坐標，吸光度（A）作縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，并求出標準曲線回歸方程得A=1.007C-0.110 9，R2=0.991 5。

待測液稀釋到合適體積，取1 mL按上述方式顯色定容后測定其吸光度，按標準曲線計算多糖含量。桂花樹葉多糖得率（%）按式（1）計算。

式中：X為桂花樹葉多糖得率，%；N為體積，mL；V為稀釋倍數(shù)；m為稱取的桂花樹葉粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3 試驗設計

單因素試驗，以乙醇體積分數(shù)40%、液料比30∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時間7 min為基礎，固定其中3個參數(shù)，改變其中1個參數(shù)以研究其對多糖得率的影響。乙醇體積分數(shù)主要考察20%、30%、40%、50%、60%5個水平，液料比主要考察10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）5 個水平，提取溫度主要考察 50、60、70、80、90 ℃ 5 個水平，提取時間主要考察5、6、7、8、9 min 5 個水平。

響應面試驗，在單因素試驗及參考相關文獻的基礎上，采用Box-Behnken安排試驗。選取的因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnke design

1.3 抗氧化活性

以對·OH清除能力進行評價。樣品管，取1.00 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液于比色管中，依次加入2.00 mL的0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，1.00 mL去離子水和1.00 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，搖勻混合后，繼續(xù)加入一定量樣品溶液和1.00 mL 0.01% H2O2；不加樣品的比色管，除不加樣品外其余試液與樣品管相同；對照管，除不加樣品和H2O2外其余試液與樣品管相同。將3支比色管搖勻后用去離子水定容至10 mL，然后放入恒溫水浴箱，37℃下保溫60 min，在波長為536 nm處分別測定吸光值（用A樣品表示）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

乙醇體積分數(shù)對多糖得率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction

乙醇體積分數(shù)主要決定是否產(chǎn)生內(nèi)部沸騰及沸騰的劇烈程度，以及提取溶劑的最終極性，當內(nèi)部沸騰劇烈且提取溶劑的最終極性與提取目標物極性接近時提取效果最佳。由圖1可以看出，乙醇體積分數(shù)太低，不易產(chǎn)生內(nèi)部沸騰，對提取不利。同時桂花樹葉多糖的極性比乙醇大，但比水小。起初桂花樹葉多糖得率隨著乙醇體積分數(shù)的逐步提高而逐步上升，桂花樹葉多糖得率在乙醇體積分數(shù)40%時達到最大值。當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，雖然內(nèi)部沸騰更為劇烈，但桂花樹葉多糖得率反而減小，說明由于極性的原因桂花樹葉多糖在高濃度的乙醇溶液中溶解度降低。因此，初步確定最佳乙醇體積分數(shù)在40%左右。

液料比對多糖得率的影響見圖2。

液料比與桂花樹葉多糖得率存在一定的相關性。多糖提取時，多糖是從植物細胞的內(nèi)部擴散至細胞的外部，擴散的推動力為細胞內(nèi)外多糖濃度差，當多糖的濃度在細胞的內(nèi)部和外部達到相等時，此時多糖的擴散處于一個平衡狀態(tài)。當液料比逐漸增大，擴散達到平衡時細胞內(nèi)部和外部的多糖濃度就會下降，從而導致更少的多糖殘留在細胞內(nèi)部，因此桂花樹葉多糖得率就越大。液料比在30∶1（mL/g）的時多糖得率取得最大值，之后液料比繼續(xù)增大多糖得率略有下降，可能是加入過多的水導致其它雜質(zhì)的溶出而影響了多糖的提取。因此，初步確定最佳的液料比在30∶1（mL/g）左右。

圖2 液料比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of Effect of liquid-to-solid ratio on extraction

溫度對多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction

當提取溫度慢慢升高，其多糖得率也逐漸升高，當溫度達到80℃左右時多糖得率達到最大值，隨后略呈降低趨勢。溫度主要影響分子的運動速率及化合物的穩(wěn)定性，高溫分子運動快，有利于提取。另外，當溫度在乙醇溶液的共沸點溫度之上時，進入到原料中的乙醇溶液會迅速沸騰起來，對流擴散為主導作用加速提取。如果溫度太低，沸騰作用不強烈甚至無法沸騰，導致在較短的時間提取不完全。然而高溫又可能導致多糖被破壞或其它雜質(zhì)的溶出，多糖實際得率反而受到一定的影響。另外，溫度過高導致溶劑揮發(fā)損失，能耗增加。因此，綜合各方面因素，初步確定最佳提取溫度為80℃左右。

提取時間對多糖得率的影響見圖4。

起初桂花樹葉多糖得率會隨著提取時間的增加而上升。處于植物細胞內(nèi)部的多糖擴散至細胞外部，這個過程需要一定時間。當提取時間非常短暫時，多糖的擴散沒有達到平衡，以致于多糖提取不完全，提取的效果差。當提取時間到達7 min時，此時已經(jīng)達到擴散平衡，可以觀察到桂花樹葉多糖得率達到最大值。擴散達到平衡后，繼續(xù)延長提取時間多糖得率不會有明顯的變化。另外，提取時間過長既耽誤時間，又增加能耗。因此初步確定最佳提取時間為7 min左右。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of time on extraction

2.2 響應面試驗

2.2.1 試驗安排及結(jié)果分析

響應面試驗安排及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗及結(jié)果Table 2 Box-Behnken test and results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗及結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken test and results

用Design Expert 8.0.5軟件將表2中試驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸分析，得到桂花樹葉多糖得率對A乙醇體積分數(shù)、B液料比、C提取溫度、D提取時間的二次多項式回歸模型：

對所建立的響應模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗及方差分析Table 3 Regression model coefficients significant significance test and analysis of variance

由表3可知，試驗選用的模型高度顯著（P<0.000 1），失擬項不顯著（P>0.01）；相關系數(shù)R＝0.99，說明該模型擬合效果好，試驗誤差小，可以用于分析內(nèi)部沸騰法對桂花樹葉多糖的提取。

從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可以看出，模型一次項A、B、C、D顯著，說明選擇這幾個因素進行優(yōu)化是較為合適的；模型二次項AB、BD、CD顯著，說明各因素之間存在較為顯著的交互作用；模型二次項B2顯著，其它各項不顯著。

2.2.2 響應面分析

響應面圖形是響應值（即桂花樹葉多糖得率）對各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，圖5～圖10為A乙醇體積分數(shù)、B液料比、C提取溫度、D提取時間在其中兩個固定時，另外兩個對桂花樹葉多糖得率的交互影響曲面圖。

圖5 乙醇體積分數(shù)、液料比及交互作用Fig.5 Ethanol volume fraction，liquid to material ratio and interaction of them

圖6 乙醇體積分數(shù)、提取溫度及交互作用Fig.6 Ethanol volume fraction，extraction temperature and interaction of them

圖7 乙醇體積分數(shù)、提取時間及交互作用Fig.7 Ethanol volume fraction，extraction time and interaction of them

圖8 液料比、提取溫度及交互作用Fig.8 Liquid to material ratio，extraction temperature and interaction of them

圖9 液料比、提取時間及交互作用Fig.9 Liquid to material ratio，extraction time and interaction and interaction of them

圖10 提取溫度、提取時間及交互作用Fig.10 Extraction temperature，extraction time and interaction and interaction of them

由圖5～圖10可知，乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間對桂花樹葉多糖得率的影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。響應面中的等高線的形狀可以反映出兩因素的交互作用的大小，等高線越接近于圓形且多條等高線越接近于共圓心，則這兩個因素間的交互作用越弱；相反，等高線遠離圓形趨勢越大且多條等高線共圓心的趨勢越小，則這兩個因素間的交互作用越強。觀察圖5～圖10中的等高線，容易發(fā)現(xiàn)AB、BD、CD交互作用顯著，等高線形狀遠離圓形，且多條等高線不可能共圓心的趨勢明顯；AC、AD、BC交互作用弱，表現(xiàn)出多條等高線共圓心的趨勢明顯，結(jié)果與方差分析一致。

2.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗證

在限定范圍內(nèi)，由上述模型求最大值，當乙醇體積分數(shù)為33.39%、液料比為22.16∶1（mL/g）、提取溫度為68.62℃、提取的時間為7.95 min時，桂花樹葉多糖得率可達8.58%。為處理方便將提取條件略做修改，乙醇體積分數(shù)為 33%、液料比為 22∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取的時間為8 min，在此條件下3次平行試驗桂花樹葉多糖得率分別為8.62%、8.64%、8.61%，平均值為8.62%。結(jié)果表明響應面試驗得到的提取工藝是可取的，桂花樹葉多糖得率高，試驗重復性好，具有一定的意義，最佳提取條件基本得到驗證。

2.4 桂花樹葉多糖的抗氧化活性

將最優(yōu)工藝條件下得到的提取液定容至50 mL，分別取1、2、3、4 mL于4支比色管中，按抗氧化活性測定方法進行處理后測定吸光度并計算，得到4支比色管中樣品溶液對·OH清除率分別為18.22%、37.34%、51.54%、70.86%，結(jié)果表明桂花樹葉多糖具有較好的抗氧化活性，并且樣品溶液對·OH清除率與濃度具有一定的相關性。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗及響應面試驗獲得了內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉中多糖的最適宜工藝，即乙醇體積分數(shù)為33%、液料比為22∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取的時間為8 min，此時桂花樹葉多糖得率可達8.62%；·OH清除測試結(jié)果表明桂花樹葉多糖具有良好的抗氧化活性。以乙醇溶液及水為提取的溶劑，在提取過程中沒有加入任何有害物質(zhì)，因此內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉多糖不僅成本低，而且安全性高。由于操作簡單，提取工藝易于放大，本文所得桂花樹葉多糖提取工藝對于開發(fā)利用桂花樹葉具有一定的參考價值。