桂花樹葉多糖提取及抗氧化活性研究

李建鳳，廖立敏，*

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641100；2.“果類廢棄物資源化”四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641100）

桂花樹是我國常見的一種木樨科木樨屬植物，這種芳香花卉是我國比較珍貴的特產(chǎn)。桂花樹一年四季都有綠色的葉子，生態(tài)效益非常好，經(jīng)濟(jì)價(jià)值及觀賞價(jià)值極佳。桂花樹不僅作為一種優(yōu)良的園林樹種被用來美化和綠化環(huán)境，還在香料、食品和醫(yī)藥等方面被加以利用[1]。桂花樹葉中含有豐富的碳水化合物、脂肪類、蛋白質(zhì)類等成分，此外還含有多糖、多肽、酚類、黃酮類化合物等多種活性物質(zhì)。來自于植物組織中的多糖，如綠茶多糖[2]等具有多重生理功效而被研究者重視，例如具備抗氧化、提高免疫、抵抗腫瘤、抵抗病毒、防止凝血以及降低血糖等生物活性和功能[3-4]，作為添加劑廣泛應(yīng)用于各種保健品、食品、功能飼料中。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)健康需求的增長，人們對(duì)多糖的研究越來越深入[5-7]。目前對(duì)桂花樹的研究側(cè)重在環(huán)境美化方面，桂花樹葉有效成分提取方面的研究還未引起人們足夠的重視。

目前提取植物中有效成分的方法主要有超聲波法[8-11]、微波法[12-14]、酶法[15-17]、溶劑提取法[18-20]等。利用溶劑提取法提取多糖，操作簡(jiǎn)便、無需特殊儀器設(shè)備，但往往存在耗時(shí)、多糖得率低等缺點(diǎn)。在溶劑提取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的內(nèi)部沸騰法[21-22]是指將一定體積分?jǐn)?shù)的低沸點(diǎn)溶劑預(yù)先浸泡原料并進(jìn)入組織內(nèi)部，然后加入一定溫度的高沸點(diǎn)溶劑使原料組織內(nèi)部的低沸點(diǎn)溶劑迅速沸騰，破壞原料組織的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，加速有效成分的溶解與擴(kuò)散而實(shí)現(xiàn)對(duì)有效成分的提取。本文通過響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以乙醇和水作為溶劑采用內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉中的多糖成分，為桂花樹葉的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桂花樹葉：采摘于內(nèi)江師范學(xué)院校園內(nèi)的掛花樹；去離子水、無水葡萄糖、苯酚、0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH<7.4）、0.75 mmol/L 的 FeSO4溶液、0.01% H2O2、無水乙醇：成都金山化學(xué)試劑有限公司；保鮮膜：市購。

電子分析天平（JA2003A）：上海精天電子儀器有限公司；100g手提式高速粉碎機(jī)（DFT-100）：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；低速大容器離心機(jī)（DTL-5-A）：上海市嘉定區(qū)安亭工業(yè)園區(qū)園大路400號(hào)；優(yōu)質(zhì)超純水機(jī)（UPT-Ⅱ-10T）：成都超純科技有限公司；集熱式磁力攪拌器（DF-10S）：常州未來儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桂花樹葉的預(yù)處理

將采摘的新鮮桂花樹葉清洗干凈，60℃下干燥至恒重，將桂花樹葉放入高速粉碎機(jī)中粉碎3 min，制得桂花樹葉干粉，用塑料密封袋裝好，放入裝有干燥劑的干燥器中備用。

1.2.2 桂花樹葉多糖的提取及測(cè)定

稱取2.000 g桂花樹葉粉末放于100 mL的潔凈干燥的錐形瓶，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液15 mL，浸泡30 min，使乙醇溶液能夠充分進(jìn)入桂花樹葉粉末的內(nèi)部，接著將一定溫度、一定體積的熱水加入到其中，使乙醇在植物組織內(nèi)部產(chǎn)生沸騰，提取一定的時(shí)間，冷卻后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)的塑料瓶中4 500 r/min離心5 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)入至比色管中，去離子水定容到一定的體積得待測(cè)液。

精密稱取無水葡萄糖7.4 mg，放于體積為50 mL的容量瓶，加入去離子水溶解并稀釋至刻度線，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.148 g/L。稱取2.5 g苯酚溶于去離子水中，并用50 mL的容量瓶配制得5%的苯酚溶液。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，精密移取0、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于5支比色管中，去離子水稀釋到2.0 mL，再加1 mL的5%的苯酚溶液，然后快速加入濃硫酸5 mL，搖晃均勻，靜置20 min使其冷卻到室溫（25℃），空白溶液用去離子水，在波長為490 nm處測(cè)定吸光度，葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）作橫坐標(biāo)，吸光度（A）作縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得A=1.007C-0.110 9，R2=0.991 5。

待測(cè)液稀釋到合適體積，取1 mL按上述方式顯色定容后測(cè)定其吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。桂花樹葉多糖得率（%）按式（1）計(jì)算。

式中：X為桂花樹葉多糖得率，%；N為體積，mL；V為稀釋倍數(shù)；m為稱取的桂花樹葉粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、液料比30∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時(shí)間7 min為基礎(chǔ)，固定其中3個(gè)參數(shù)，改變其中1個(gè)參數(shù)以研究其對(duì)多糖得率的影響。乙醇體積分?jǐn)?shù)主要考察20%、30%、40%、50%、60%5個(gè)水平，液料比主要考察10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）5 個(gè)水平，提取溫度主要考察 50、60、70、80、90 ℃ 5 個(gè)水平，提取時(shí)間主要考察5、6、7、8、9 min 5 個(gè)水平。

響應(yīng)面試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)及參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken安排試驗(yàn)。選取的因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnke design

1.3 抗氧化活性

以對(duì)·OH清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。樣品管，取1.00 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液于比色管中，依次加入2.00 mL的0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，1.00 mL去離子水和1.00 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，搖勻混合后，繼續(xù)加入一定量樣品溶液和1.00 mL 0.01% H2O2；不加樣品的比色管，除不加樣品外其余試液與樣品管相同；對(duì)照管，除不加樣品和H2O2外其余試液與樣品管相同。將3支比色管搖勻后用去離子水定容至10 mL，然后放入恒溫水浴箱，37℃下保溫60 min，在波長為536 nm處分別測(cè)定吸光值（用A樣品表示）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction

乙醇體積分?jǐn)?shù)主要決定是否產(chǎn)生內(nèi)部沸騰及沸騰的劇烈程度，以及提取溶劑的最終極性，當(dāng)內(nèi)部沸騰劇烈且提取溶劑的最終極性與提取目標(biāo)物極性接近時(shí)提取效果最佳。由圖1可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)太低，不易產(chǎn)生內(nèi)部沸騰，對(duì)提取不利。同時(shí)桂花樹葉多糖的極性比乙醇大，但比水小。起初桂花樹葉多糖得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐步提高而逐步上升，桂花樹葉多糖得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，雖然內(nèi)部沸騰更為劇烈，但桂花樹葉多糖得率反而減小，說明由于極性的原因桂花樹葉多糖在高濃度的乙醇溶液中溶解度降低。因此，初步確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%左右。

液料比對(duì)多糖得率的影響見圖2。

液料比與桂花樹葉多糖得率存在一定的相關(guān)性。多糖提取時(shí)，多糖是從植物細(xì)胞的內(nèi)部擴(kuò)散至細(xì)胞的外部，擴(kuò)散的推動(dòng)力為細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差，當(dāng)多糖的濃度在細(xì)胞的內(nèi)部和外部達(dá)到相等時(shí)，此時(shí)多糖的擴(kuò)散處于一個(gè)平衡狀態(tài)。當(dāng)液料比逐漸增大，擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)細(xì)胞內(nèi)部和外部的多糖濃度就會(huì)下降，從而導(dǎo)致更少的多糖殘留在細(xì)胞內(nèi)部，因此桂花樹葉多糖得率就越大。液料比在30∶1（mL/g）的時(shí)多糖得率取得最大值，之后液料比繼續(xù)增大多糖得率略有下降，可能是加入過多的水導(dǎo)致其它雜質(zhì)的溶出而影響了多糖的提取。因此，初步確定最佳的液料比在30∶1（mL/g）左右。

圖2 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of Effect of liquid-to-solid ratio on extraction

溫度對(duì)多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction

當(dāng)提取溫度慢慢升高，其多糖得率也逐漸升高，當(dāng)溫度達(dá)到80℃左右時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，隨后略呈降低趨勢(shì)。溫度主要影響分子的運(yùn)動(dòng)速率及化合物的穩(wěn)定性，高溫分子運(yùn)動(dòng)快，有利于提取。另外，當(dāng)溫度在乙醇溶液的共沸點(diǎn)溫度之上時(shí)，進(jìn)入到原料中的乙醇溶液會(huì)迅速沸騰起來，對(duì)流擴(kuò)散為主導(dǎo)作用加速提取。如果溫度太低，沸騰作用不強(qiáng)烈甚至無法沸騰，導(dǎo)致在較短的時(shí)間提取不完全。然而高溫又可能導(dǎo)致多糖被破壞或其它雜質(zhì)的溶出，多糖實(shí)際得率反而受到一定的影響。另外，溫度過高導(dǎo)致溶劑揮發(fā)損失，能耗增加。因此，綜合各方面因素，初步確定最佳提取溫度為80℃左右。

提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖4。

起初桂花樹葉多糖得率會(huì)隨著提取時(shí)間的增加而上升。處于植物細(xì)胞內(nèi)部的多糖擴(kuò)散至細(xì)胞外部，這個(gè)過程需要一定時(shí)間。當(dāng)提取時(shí)間非常短暫時(shí)，多糖的擴(kuò)散沒有達(dá)到平衡，以致于多糖提取不完全，提取的效果差。當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)7 min時(shí)，此時(shí)已經(jīng)達(dá)到擴(kuò)散平衡，可以觀察到桂花樹葉多糖得率達(dá)到最大值。擴(kuò)散達(dá)到平衡后，繼續(xù)延長提取時(shí)間多糖得率不會(huì)有明顯的變化。另外，提取時(shí)間過長既耽誤時(shí)間，又增加能耗。因此初步確定最佳提取時(shí)間為7 min左右。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of time on extraction

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)安排及結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken test and results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)及結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken test and results

用Design Expert 8.0.5軟件將表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，得到桂花樹葉多糖得率對(duì)A乙醇體積分?jǐn)?shù)、B液料比、C提取溫度、D提取時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸模型：

對(duì)所建立的響應(yīng)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Regression model coefficients significant significance test and analysis of variance

由表3可知，試驗(yàn)選用的模型高度顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.01）；相關(guān)系數(shù)R＝0.99，說明該模型擬合效果好，試驗(yàn)誤差小，可以用于分析內(nèi)部沸騰法對(duì)桂花樹葉多糖的提取。

從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型一次項(xiàng)A、B、C、D顯著，說明選擇這幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化是較為合適的；模型二次項(xiàng)AB、BD、CD顯著，說明各因素之間存在較為顯著的交互作用；模型二次項(xiàng)B2顯著，其它各項(xiàng)不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值（即桂花樹葉多糖得率）對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，圖5～圖10為A乙醇體積分?jǐn)?shù)、B液料比、C提取溫度、D提取時(shí)間在其中兩個(gè)固定時(shí)，另外兩個(gè)對(duì)桂花樹葉多糖得率的交互影響曲面圖。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比及交互作用Fig.5 Ethanol volume fraction，liquid to material ratio and interaction of them

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度及交互作用Fig.6 Ethanol volume fraction，extraction temperature and interaction of them

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及交互作用Fig.7 Ethanol volume fraction，extraction time and interaction of them

圖8 液料比、提取溫度及交互作用Fig.8 Liquid to material ratio，extraction temperature and interaction of them

圖9 液料比、提取時(shí)間及交互作用Fig.9 Liquid to material ratio，extraction time and interaction and interaction of them

圖10 提取溫度、提取時(shí)間及交互作用Fig.10 Extraction temperature，extraction time and interaction and interaction of them

由圖5～圖10可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)桂花樹葉多糖得率的影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。響應(yīng)面中的等高線的形狀可以反映出兩因素的交互作用的大小，等高線越接近于圓形且多條等高線越接近于共圓心，則這兩個(gè)因素間的交互作用越弱；相反，等高線遠(yuǎn)離圓形趨勢(shì)越大且多條等高線共圓心的趨勢(shì)越小，則這兩個(gè)因素間的交互作用越強(qiáng)。觀察圖5～圖10中的等高線，容易發(fā)現(xiàn)AB、BD、CD交互作用顯著，等高線形狀遠(yuǎn)離圓形，且多條等高線不可能共圓心的趨勢(shì)明顯；AC、AD、BC交互作用弱，表現(xiàn)出多條等高線共圓心的趨勢(shì)明顯，結(jié)果與方差分析一致。

2.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證

在限定范圍內(nèi)，由上述模型求最大值，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為33.39%、液料比為22.16∶1（mL/g）、提取溫度為68.62℃、提取的時(shí)間為7.95 min時(shí)，桂花樹葉多糖得率可達(dá)8.58%。為處理方便將提取條件略做修改，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 33%、液料比為 22∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取的時(shí)間為8 min，在此條件下3次平行試驗(yàn)桂花樹葉多糖得率分別為8.62%、8.64%、8.61%，平均值為8.62%。結(jié)果表明響應(yīng)面試驗(yàn)得到的提取工藝是可取的，桂花樹葉多糖得率高，試驗(yàn)重復(fù)性好，具有一定的意義，最佳提取條件基本得到驗(yàn)證。

2.4 桂花樹葉多糖的抗氧化活性

將最優(yōu)工藝條件下得到的提取液定容至50 mL，分別取1、2、3、4 mL于4支比色管中，按抗氧化活性測(cè)定方法進(jìn)行處理后測(cè)定吸光度并計(jì)算，得到4支比色管中樣品溶液對(duì)·OH清除率分別為18.22%、37.34%、51.54%、70.86%，結(jié)果表明桂花樹葉多糖具有較好的抗氧化活性，并且樣品溶液對(duì)·OH清除率與濃度具有一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)獲得了內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉中多糖的最適宜工藝，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為33%、液料比為22∶1（mL/g）、提取溫度為70℃、提取的時(shí)間為8 min，此時(shí)桂花樹葉多糖得率可達(dá)8.62%；·OH清除測(cè)試結(jié)果表明桂花樹葉多糖具有良好的抗氧化活性。以乙醇溶液及水為提取的溶劑，在提取過程中沒有加入任何有害物質(zhì)，因此內(nèi)部沸騰法提取桂花樹葉多糖不僅成本低，而且安全性高。由于操作簡(jiǎn)單，提取工藝易于放大，本文所得桂花樹葉多糖提取工藝對(duì)于開發(fā)利用桂花樹葉具有一定的參考價(jià)值。