BSA-葡聚糖-葉黃素納米顆粒的制備及其抗氧化活性

侯惠靜，張曉燕，陳建波，柳昊杰，孟令莉，石振鵬，吳子健，*，趙偉

（1.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；3.天津商業(yè)大學(xué)國(guó)有資產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室管理處，天津300134；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

葉黃素（lutein）是已知的600種類胡蘿卜素物質(zhì)之一，廣泛存在于綠葉植物中，如菠菜、甘藍(lán)、黃胡蘿卜以及萬(wàn)壽菊花瓣[1]。其主鏈含有胡蘿卜素物質(zhì)典型的9個(gè)共軛雙鍵，而其分子的兩端含有羥基[2-3]，因而也屬于胡蘿卜醇的一種[4]。葉黃素具有很好的抗氧化性能[5-6]；也是構(gòu)成人類視網(wǎng)膜的主要黃斑色素，其多烯鏈的共軛長(zhǎng)度決定了其最大吸收峰波長(zhǎng)在藍(lán)光波譜范圍內(nèi)[7-8]，使其能有效吸收和過濾高能量且損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞的藍(lán)光，進(jìn)而減少視網(wǎng)膜的光氧化損傷[9-10]，改善視覺功能；此外，它還具有比β-胡蘿卜素更強(qiáng)的抗癌活性（如乳腺癌、前列腺癌等）[11-12]。然而，葉黃素分子結(jié)構(gòu)中的多不飽和雙鍵導(dǎo)致其在光照、氧氣、高溫等作用下易發(fā)生降解和異構(gòu)化，并且其水溶性也較差，因而其在人體中的生物利用率低[13]，這些都極大地限制了葉黃素在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。葉黃素的分子結(jié)構(gòu)[14]如圖1所示。

圖1 葉黃素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of lutein

納米顆粒因其能夠通過囊封作用提高小分子活性物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性、水溶度以及生物利用率，被廣泛用于食品及醫(yī)藥工業(yè)中[15]。美拉德反應(yīng)將蛋白與糖共價(jià)結(jié)合形成的接枝產(chǎn)物可成為納米顆粒的壁材，用于活性物質(zhì)的包埋，進(jìn)而提高活性物質(zhì)的理化穩(wěn)定性和水溶性[16]。Fan Y等[17]利用干熱法制備得到的BSA-葡聚糖共聚物，通過自組裝可與姜黃素形成納米顆粒，進(jìn)而明顯提高姜黃素的化學(xué)穩(wěn)定性及細(xì)胞抗氧化活性；宋江峰等[18]使用辛烯基琥珀酸酯化淀粉和蔗糖為壁材，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了包埋葉黃素的工藝；曾治平等[19]以明膠和阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)凝聚法制備葉黃素納米顆粒，對(duì)葉黃素納米顆粒的制備工藝、理化性質(zhì)以及貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，徐建中等[20]優(yōu)化了葉黃素納米顆粒的工藝條件，解決了葉黃素在高含量條件下的穩(wěn)定性問題。

本研究擬通過制備牛血清白蛋白V與葡聚糖共聚物對(duì)葉黃素進(jìn)行包埋形成納米顆粒。測(cè)定葉黃素納米顆粒的包封率，粒徑及Zeta電勢(shì)，分析納米顆粒的穩(wěn)定性；同時(shí)也檢測(cè)了葉黃素納米顆粒的體外及細(xì)胞抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素（純度≥90%）：上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖（分子量20 kDa）：MACKLIN公司；過硫酸鉀（純度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白Ⅴ（分子量 68 kDa）、2'，7'-二氯二氫熒 光 素 二 乙 酯 （2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2'-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride ，ABAP）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）：Sigma-Aldrich公司；平衡鹽溶液、胎牛血清等：賽默飛世爾科技；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、NTS-4000C恒溫振蕩水浴搖床：日本EYELA公司；Zetasizer Nano-ZS 90型納米粒度分析儀：英國(guó)Malvern公司；Apreo掃描電鏡：美國(guó)FEI公司；HERAcell vios 160i CO2培養(yǎng)箱、VARIOSKAN LUX微孔板檢測(cè)器：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 牛血清白蛋白-葡聚糖共聚物的制備

采用濕法美拉德反應(yīng)制備牛血清白蛋白與葡聚糖共聚物[21]，具體步驟為：先將牛血清白蛋白V與葡聚糖按摩爾質(zhì)量比7∶1溶于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH=8.50）中，蛋白濃度為2.80 mg/mL，95℃下磁力攪拌2.3 h后，迅速冷卻并離心（6 000 r/min，4℃，15 min），取上清液并于4℃下透析24 h，分子截留量（20±0.2）kDa后，凍干即得牛血清白蛋白-葡聚糖共聚物（dextran-bovine serum albumin-lutein，DBSA）。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考王帥等[22]方法，具體參數(shù)：10%分離膠、4%濃縮膠、7.0 μL蛋白樣品上樣量、蛋白質(zhì)濃度1.0 mg/mL、電壓200 V。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜的測(cè)定

參考Cheng Z J等[23]的方法，并做出調(diào)整：稱取適量的樣品，加入一定量的溴化鉀（樣品與溴化鉀的質(zhì)量比為1∶100），研磨成均勻的粉末并壓成薄片，用傅里葉變換紅外譜儀作全波段（4 000 cm-1～400 cm-1）掃描，掃描16次，掃描前用溴化鉀薄片扣除背景。

1.3.4 葉黃素納米顆粒的制備

根據(jù)張雅婷等[24]的方法制備葉黃素納米顆粒，稍作修改，具體步驟為：將BSA和DBSA分別溶于去離子水中，蛋白濃度為2 mg/mL；葉黃素溶于一定濃度乙醇溶液，然后將葉黃素乙醇溶液分別加入蛋白溶液中，至每100 mL蛋白溶液中含葉黃素2.0 mg，混合后繼續(xù)在25℃下攪拌1.0 h；混勻溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（溫度55℃下）除去乙醇后迅速冷卻，并調(diào)節(jié)溶液pH值至4.70，經(jīng)高壓均質(zhì)處理（作用壓力為85 MPa，循環(huán)3次）后再在4℃下靜置過夜，最后冷凍干燥，就可以得到兩種不同包埋材料的葉黃素納米顆粒，分別為BSA-lutein和DBSA-lutein。未進(jìn)行高壓均質(zhì)處理的BSA與lutein混合物以及DBSA與lutein混合物經(jīng)干燥混合分別為Mix-BSA-lutein和Mix-DBSA-lutein。

1.3.5 納米顆粒包封率的測(cè)定

根據(jù)Muhoza等[25]的方法，測(cè)定游離葉黃素的含量，稍作修改。分別準(zhǔn)確量取0.5 mL的BSA-lutein和DBSA-lutein混合液，再加入2.0 mL正己烷，使它們充分混合后，將其離心（7 000 r/min，5 min），收集上層有機(jī)相，重復(fù)2次上述操作，將有機(jī)相合并，并在448 nm處測(cè)定其吸光值。配置不同濃度的葉黃素，按照上述方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.822x+0.016，R2=0.99），以便計(jì)算游離葉黃素的含量。

總?cè)~黃素的含量。參照Muhoza等[25]的方法測(cè)定，稍作調(diào)整。取0.5 mL葉黃素納米顆粒，加入SDS調(diào)節(jié)終濃度為0.3 mol/L，充分振蕩混合后，置于30℃孵育5 min，測(cè)定448 nm處的吸光值，以不同濃度葉黃素做標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=28.89x-0.013，R2=0.99）計(jì)算納米顆粒中葉黃素的總含量。

葉黃素納米顆粒的包封率按照如下公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

1.3.6 納米顆粒粒徑的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)激光光散射法（dynamic light scattering，DLS）測(cè)定葉黃素納米顆粒的Zeta電位和粒徑分布[26]。設(shè)定散射角為90°，折光指數(shù)1.33，測(cè)定溫度25℃，保溫3.0 min。將待測(cè)樣品分別裝入聚苯乙烯比色皿和電解池中測(cè)定平均粒徑和Zeta電位。

1.3.7 掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，SEM）

參考曹靜等[27]的方法，稍作調(diào)整：將樣品均勻黏附于掃描電鏡的樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金。對(duì)薄片進(jìn)行掃描拍照，參數(shù)電壓為10 kV，放大倍數(shù)為100 000倍。

1.3.8 pH值對(duì)納米顆粒穩(wěn)定性的影響

用不同pH（2.00～7.00）的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解樣品（BSA-lutein或DBSA-lutein），25℃靜置1.0 h，按1.3.4中的方法測(cè)定納米顆粒粒徑和Zeta電位。

1.3.9 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定參考Alam等[28]的方法。

1.3.10 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

ABTS+自由基清除率的測(cè)定參考Seeram等[29]的方法。

1.3.11 羥基自由基清除率的測(cè)定

羥基自由基清除率的測(cè)定參考楊云舒等[30]的方法。

1.3.12 還原力的測(cè)定

還原力的測(cè)定參考張澤生等[31]的方法。

1.3.13 噻唑蘭（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）染色法

HepG2細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25 cm2，康寧）中，置于37℃下、5% CO2和95%的相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，期間需每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的90%時(shí)，取15代～30代細(xì)胞用于本研究。

根據(jù)Abbes等[32]的MTT法對(duì)葉黃素納米顆粒樣品（葉黃素濃度分別為 5、10、15、25、30 μg/mL）進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，得到細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)的細(xì)胞安全濃度范圍。

以葉黃素純品為空白對(duì)照組，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種100 μL；置于37℃、5% CO2、90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞完全貼壁。移去培養(yǎng)基后，用PBS緩沖液（pH=7.2）清洗2遍，加入樣品溶液，再于37℃下孵育24 h。移去培養(yǎng)基，加入 100 μL 的 MTT 溶液（5 μg/mL），再于 37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，除去上清液后，每孔再加入100 μL的DMSO溶劑，振蕩10 min，并于490 nm下檢測(cè)孔中的細(xì)胞OD值，按公式（2）計(jì)算HepG2細(xì)胞的存活率：

1.3.14 細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)

細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)參考Wolfe等[33]的方法，具體操作如下：選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞液（細(xì)胞密度為 6×104個(gè)/mL），黑邊黑底 96 孔板中每孔加入 100 μL HepG2細(xì)胞液，培養(yǎng)24h后，棄上清液，用100μL的PBS緩沖液洗滌孔板；將樣品溶液和DCFH-DA（25μmol/L）按照1∶1（體積比）添加100 μL至96孔板內(nèi)，孵育1 h后棄上清液，用PBS緩沖液洗滌孔板2遍；每孔再加入 100 μL ABAP（600 μmol/L），立刻將 96 孔板放入酶標(biāo)儀中，測(cè)定參數(shù)為37℃、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm、激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、每隔5 min讀數(shù)一次，持續(xù)1 h。對(duì)照組為DCFH-DA和ABAP混合液，空白組為DCFH-DA溶液。樣品空白組為BSA與DCFH和ABAP；DBSA與DCFH和ABAP。所得熒光讀數(shù)扣除空白之后，按照公式（3）計(jì)算細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）值，繪制熒光值-時(shí)間的曲線：

式中：∫SA和∫CA分別為樣品和對(duì)照組熒光曲線的積分面積；EC50值（半數(shù)有效濃度）是由 log（fa/fu）對(duì)log（does）的中效曲線得出；其中fa和fu分別為受到樣品影響和未受到樣品影響的曲線面積；log（does）為樣品濃度的對(duì)數(shù)，當(dāng)log（fa/fu）=log 1=0時(shí)，所得濃度即為EC50。

1.3.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用96孔板進(jìn)行的試驗(yàn)均設(shè)置6組平行，其余試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均質(zhì)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平設(shè)定為p＜0.05，并使用origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素納米顆粒分析結(jié)果

經(jīng)過方法1.3.1制備的DBSA-lutein和BSA-lutein納米顆粒凍干粉末如圖2所示。

圖2 蛋白-葉黃素納米顆粒凍干粉末及其復(fù)溶溶液的照片F(xiàn)ig.2 Photos of BSA-lutein and DBSA-lutein nanoparticle solution

DBSA-lutein的凍干粉末的顏色比BSA-lutein的深；二者分別復(fù)溶后，DBSA-lutein的復(fù)溶液顏色也較BSA-lutein的復(fù)溶液深一點(diǎn)，一般蛋白和糖經(jīng)過美拉德反應(yīng)，顏色都會(huì)加深，同時(shí)發(fā)現(xiàn)二者在水中的溶解度明顯提高，顏色清澈無(wú)懸浮物。溶液放置一周后，BSA-lutein溶液底部出現(xiàn)沉淀，是由于BSA-lutein納米顆粒會(huì)發(fā)生聚集而產(chǎn)生沉淀，而DBSA-lutein溶液仍能保持均勻，說(shuō)明DBSA-lutein提高了葉黃素納米乳液的穩(wěn)定性，通常牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)經(jīng)美拉德反應(yīng)后，可以與葡聚糖等非離子型多糖形成“蛋白-多糖”接枝物，此“蛋白-多糖”接枝物所形成的納米顆粒的穩(wěn)定性能有效提高，糖基化蛋白中蛋白部分通過疏水相互作用與所包埋的疏水性分子進(jìn)行有效吸附，而葡聚糖可以為納米顆粒提供較強(qiáng)的空間位阻，進(jìn)而穩(wěn)定“蛋白-多糖-疏水性功能分子”納米顆粒[34]。BSADextran共聚物的電泳圖見圖3。

圖3 牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物的SDS-PAGE圖片F(xiàn)ig.3 SDS-PAGE image of BSA-Dextran

如圖3所示，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間增加，牛血清白蛋白V的條帶逐漸變淺，同時(shí)電泳膠的上端出現(xiàn)較明顯的蛋白條帶，且條帶越來(lái)越深，表明有較大分子量的蛋白生成，且反應(yīng)時(shí)間的提高，更多的BSA參與了和Dextran反應(yīng)生成共聚物，且形成的共聚物分子量也不斷增加。通過傅里葉變換紅外光譜法進(jìn)一步分析BSA與Dextran是否發(fā)生了接枝聚合反應(yīng)，通常當(dāng)分子中有-OH基團(tuán)的引入，其紅外光譜上在3 700 cm-1～3200cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的伸縮振動(dòng)會(huì)變寬[35]；另外當(dāng)Dextran分子接枝到BSA分子上后會(huì)引起N-H鍵的伸縮振動(dòng)[36]，其紅外光譜圖上表現(xiàn)為3 311 cm-1處（酰胺A帶N-H的伸縮振動(dòng)）和3050 cm-1處（酰胺B帶N-H的伸縮振動(dòng)）吸收峰增強(qiáng)[37]；同時(shí)葡聚糖接枝到蛋白上也引入了新的C-O鍵，紅外光譜圖上表現(xiàn)為1 000 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰，即C-O鍵的吸收峰[38]。應(yīng)該是BSA和Dextran反應(yīng)生成了糖蛋白，如圖4所示。

圖4 樣品傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FT-IR diagram of samples

表1對(duì)比了兩種葉黃素納米顆粒（BSA-lutein和DBSA-lutein）的包封率、平均粒徑、聚合物分散性指數(shù)以及納米顆粒的Zeta電位。

表1 兩種葉黃素納米顆粒的特征指標(biāo)對(duì)比Table 1 Characteristic index comparison of two kinds of encapsulation particles loaded lutein

包封率（encapsulation efficiency）是納米乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一，通常是指被包裹親油性分子（如類胡蘿卜素物質(zhì)）在脂質(zhì)體懸液中占所有親油性分子物質(zhì)的百分比[39]；另外，平均粒徑、大小分布以及ζ-電位也都是納米乳液的重要指標(biāo)，平均粒徑小的納米顆粒的熱穩(wěn)定性高，且在水中的分散性能好[40]，聚合物分散性指數(shù)差異性較小說(shuō)明所形成的乳液滴大小之間的差別不大，形成的乳液體系性能好，不會(huì)發(fā)生部分絮凝，此外一般形成的乳液滴的ζ-電位≥30 mV，乳液的穩(wěn)定性能很好，能夠有效防止乳液滴的聚集，降低乳液滴的絮凝[41]。如表1所示，DBSA對(duì)葉黃素的包封率為（95.86±0.83）%，高于BSA對(duì)葉黃素的包封率（77.82±1.58）%；DBSA-lutein和 BSA-lutein的平均粒徑分別為（176.8±6.5）nm 和（166.7±8.6）nm；另外 DBSA-lutein與BSA-lutein的聚合物分散性指數(shù)分別為0.176±0.07 和 0.276±0.05，均小于 0.3，同時(shí)說(shuō)明分散體系穩(wěn)定性良好。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能的原因是：接枝后的蛋白分子量更大，使其粒徑較大，增加了載體疏水內(nèi)核的大小，提高了DBSA對(duì)葉黃素的包封率，DBSA-lutein的ζ-電位的絕對(duì)值也高于BSA-lutein，這也進(jìn)一步說(shuō)明DBSA-lutein比BSA-lutein的穩(wěn)定性更好。兩種葉黃素納米顆粒樣品的掃描電鏡圖如圖5所示。

圖5 葉黃素納米顆粒的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of encapsulation particles

從圖5中可知，BSA-lutein及DBSA-lutein納米顆粒的形態(tài)均為球形。根據(jù)標(biāo)尺可以估算出這兩種納米顆粒的粒徑也相似，約為200 nm。

2.2 葉黃素納米顆粒的pH值穩(wěn)定性

乳液的pH值對(duì)納米顆粒粒徑以及ζ-電位的影響可以判斷其對(duì)納米顆粒穩(wěn)定性的影響。不同pH值條件下兩種葉黃素納米顆粒穩(wěn)定性的變化如圖6所示。

圖6 pH值對(duì)兩種葉黃素納米顆粒平均粒徑與ζ-電位的影響Fig.6 Effects of pH on the Z-average diameter and Zeta potentialof protein-lutein nanoparticels

由圖 6（a）可得：在 BSA 蛋白的等電點(diǎn)（pH 4.00～5.00）附近，二者的粒徑均達(dá)到了最小值，而當(dāng)pH值變小或變大時(shí)，粒徑均會(huì)有一定的增大，但仍在200 nm以下；在pH值相同的情況下，DBSA-lutein的粒徑較BSA-lutein而言略大，這與糖蛋白載體大小相關(guān)。

通常較高的表面電荷使得納米顆粒間具有較強(qiáng)的相互斥力，進(jìn)而使得納米顆粒在溶液中的溶解穩(wěn)定性較高[42]。由圖 6（b）可知：BSA-lutein 在 pH2.00～pH7.00范內(nèi)其ζ-電位的絕對(duì)值均小于20.0 mV，說(shuō)明在BSA-lutein納米顆粒在此pH值范圍內(nèi)，穩(wěn)定性較差，這與之前復(fù)溶的BSA-lutein在一段時(shí)間后會(huì)有沉淀產(chǎn)生的結(jié)果一致；而對(duì)于DBSA-lutein納米顆粒而言，在pH 2.00～pH5.00范圍，其ζ-電位的絕對(duì)值小于20.0 mV，而在pH6.00和pH7.00時(shí)，其ζ-電位的絕對(duì)值分別是大于20.0 mV和30.0mV，DBSA-lutein納米顆粒的溶解穩(wěn)定性較好。

2.3 體外抗氧化性能

以維生素E（Trolox）為標(biāo)品，測(cè)定其不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）下的抗氧化能力，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種化學(xué)抗氧化法（即DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力）的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y1=631x+3.972，R2=0.991；y2=718.2x-2.163，R2=0.996；y3=477.5x+25.55，R2=0.991；y4=3.958x+0.046，R2=0.992。以維生素E當(dāng)量（mg/mg）表示各樣品之間的抗氧化性能，其結(jié)果如表2所示。

表2 葉黃素及其納米顆粒體外抗氧化性的比較Table 2 Antioxidant activity in vitro of lutein and nanoparticles

由表2可知，與lutein相比，BSA-lutein納米顆粒清除DPPH自由基的能力提高了0.7倍，清除ABTS+自由基的能力提高了2.2倍，清除羥基自由基的能力提高了0.2倍，還原力提升了0.3倍；而DBSA-lutein相應(yīng)的抗氧化能力則分別提升了1.6倍、2.5倍、1.2倍和0.5倍。表明葉黃素的抗氧化性能在經(jīng)過蛋白質(zhì)包埋后有了提升，但經(jīng)糖蛋白包埋后的提升效果更加明顯。Chen Tan等[43]研究得到經(jīng)糖蛋白包埋姜黃素后的抗氧化活性明顯提高，鄧楚君[44]利用葡聚糖-乳鐵蛋白復(fù)合物包埋姜黃素后，這些試驗(yàn)都得出了相類似的結(jié)果?？赡艿脑蚴荄BSA、BSA、葡聚糖-乳鐵蛋白復(fù)合物以及其他的糖蛋白等微顆?；蚣{米顆粒的包材可以有效提高葉黃素等被包埋物質(zhì)的水溶性，而DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和羥基自由基清除率的測(cè)定以及還原力的測(cè)定，這些反應(yīng)都是在水溶液的環(huán)境中進(jìn)行的，因此經(jīng)過包埋后疏水性物質(zhì)的相應(yīng)能力會(huì)有顯著提高。

lutein清除自由基的能力當(dāng)量均大于1，效果高于維生素E，而還原力當(dāng)量為0.962，與維生素E效果相近；Mix-BSA-lutein及Mix-DBSA-lutein的抗氧化能力較葉黃素強(qiáng)，這是由于牛血清白蛋白自身具有一定的抗氧化性能，但是只有在清除人工合成的自由基時(shí)，二者與葉黃素的差異性顯著，而清除羥基自由基和還原能力與葉黃素相比差異不顯著，可見蛋白與葉黃素單純混合對(duì)抗氧化能力的影響并沒有明顯的變化；BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒的抗氧化性能高于混合物及葉黃素，且差異顯著，說(shuō)明納米顆粒的形成能夠很好地增加葉黃素的抗氧化性能；DBSA-lutein比BSA-lutein的抗氧化能力強(qiáng)，在清除自由基方面差異顯著，而還原力差異不顯著，說(shuō)明經(jīng)接枝改性后與葉黃素形成的納米顆粒能夠進(jìn)一步提高葉黃素清除自由基的能力。

2.4 細(xì)胞抗氧化性

2.4.1 細(xì)胞存活率

據(jù)資料[45]顯示，難以被細(xì)胞吸收的化合物有以下特征：分子量>500，擁有5個(gè)及以上氫鍵供體，10個(gè)及以上氫鍵受體，而葉黃素正是這類化合物之一，其由于自身的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)極其不穩(wěn)定，這些都限制了葉黃素在生活中的應(yīng)用。而通過納米顆粒包埋技術(shù)可以有效提高葉黃素在消化道內(nèi)的穩(wěn)定性和被細(xì)胞吸收的能力，從而改善葉黃素的功能特性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用Fig.7 Inhibition effects of different samples（lutein，BSA-lutein and DBSA-lutein）on HepG2 cells

樣品對(duì)HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用，經(jīng)過包埋后，隨著葉黃素濃度的增加，抑制作用越明顯。當(dāng)葉黃素濃度低于15 μg/mL，不同樣品作用下HepG2的存活率均高于90%，即對(duì)HepG2無(wú)產(chǎn)生明顯的毒性，故在之后的細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品中葉黃素的濃度梯度設(shè)置上限不高于15 μg/mL。

2.4.2 細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)

不同樣品的細(xì)胞抗氧化性能檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

隨著葉黃素濃度的升高，樣品的CAA值都有不同程度的提高，說(shuō)明葉黃素及納米顆粒都能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮其抗氧化活性的作用；此外，同一濃度條件下，3種樣品的CAA值由大到小依次為DBSA-lutein、BSA-lutein、lutein，表明包埋后的葉黃素納米顆粒確實(shí)可以提高葉黃素的細(xì)胞抗氧化活性。

以 log（does）值為 x 軸，樣品不同濃度下 log（fa/fu）值為y軸，得到不同樣品的中效曲線方程為lutein（y=1.391x-1.561，R2=0.993），BSA-lutein（y=1.585x-1.438，R2=0.989），DBSA-lutein（y=1.479x-1.076，R2=0.980）。當(dāng)log（fa/fu）=0（即 y=0）時(shí)，得到各樣品 EC50值分別為13.250、8.077、5.340 μg/mL，EC50值越低，表明樣品的抗氧化活性越好，由此可知DBSA-lutein的抗氧化活性比BSA-lutein提高了0.5倍，比lutein提高了1.5倍。

圖8 不同樣品的細(xì)胞抗氧化活性CAA值變化Fig.8 Changes of CAA values of cellular antioxidant activitiy in differents samples（lutein，BSA-lutein and DBSA-lutein）

3 結(jié)論

高壓均質(zhì)法所制備的BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒，二者粒徑分別為（166.7±8.6）nm（PDI=0.276±0.05）和（176.8±6.5）nm（PDI=0.176±0.07），pH 值會(huì)影響納米顆粒的粒徑和Zeta電位，pH=4.00～5.00時(shí)，粒徑最小，其中pH=7.00時(shí)，納米顆粒最穩(wěn)定，DBSA-lutein粒徑較大、包封率＞95%，葉黃素納米顆粒也更加穩(wěn)定；與lutein相比，BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒清除DPPH自由基能力分別提高了0.7倍和1.6倍，清除ABTS+自由基的能力分別提高了2.2倍和2.5倍，清除羥基自由基的能力分別提高了0.2倍和1.2倍，還原力分別提升了0.3倍和0.5倍；DBSA-lutein納米顆粒與BSA-lutein納米顆粒相比，除還原力差異不顯著外，其他3種體外抗氧化試驗(yàn)均存在顯著差異。DBSA-lutein具有更好的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。