超聲輔助酶法提取綠蘆筍可溶性膳食纖維工藝條件優(yōu)化

朱廣成，楊慧，路風(fēng)銀，韓俊豪，王童

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南鄭州450002）

蘆筍（Asparagus officinalis）為百合科植物，又名石刁柏、龍須菜。其柔軟多汁，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值高，富含18種氨基酸、15種礦物質(zhì)元素及多糖、膽堿、甾皂苷、葉酸、黃酮、蘆丁等生物活性物質(zhì)[1-2]，能夠調(diào)節(jié)基體代謝，提高免疫力，對高血壓、心臟病、白血病、膽結(jié)石、各種腫瘤等都有很好的預(yù)防和治療作用，具有很高的醫(yī)療保健功能[3-5]，是名副其實的藥食兩用名貴蔬菜，享有“蔬菜之王”美稱。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）顯示，我國蘆筍收獲面積和總產(chǎn)量常年位列世界第一，產(chǎn)值超過100億元，已發(fā)展成為我國主要經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)[6]。

目前國內(nèi)外對蘆筍的營養(yǎng)價值和藥理作用進行了廣泛的研究，提出了蘆筍的綜合利用，在蘆筍深加工方面已開發(fā)出速溶蘆筍粉、蘆筍飲料、蘆筍膠囊等產(chǎn)品，然而蘆筍制品的質(zhì)量穩(wěn)定性和成品率常受到本身膳食纖維的限制[7]。膳食纖維根據(jù)溶解性的不同，可分為可溶性膳食纖維（soluble dieary fibre，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[8]，其中可溶性膳食纖維比不溶性膳食纖維有著更強的生理功能，如對結(jié)腸癌的防治效果、降低血液膽固醇含量等，且用途也更廣[9-10]。目前常用提取可溶性膳食的方法主要有化學(xué)法（如酸堿處理[11]）、物理法（如擠壓膨化法[12]、高壓均質(zhì)法[13]）、酶法[14]和發(fā)酵法[15]，其中酶法提取率較高且更為溫和，符合發(fā)展環(huán)境友好型社會的主題，所以成為提取可溶性膳食纖維研究的熱點方向。張少穎[7]、楊曉寬等[8]、田星等[16]、周馳[9]均采用酶法對蘆筍中可溶性膳食纖維的酶解工藝進行了研究，然而近年來逐漸發(fā)展一些輔助方法，包括微波、超聲、加壓、超臨界等物理技術(shù)[17]，其中超聲波細胞破碎技術(shù)可以將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過液體介質(zhì)而變成一個個密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，從而起到破碎細胞、提高可溶性膳食纖維素得率，縮短提取時間，提高工作效率的目的[18]。以此為創(chuàng)新點和突破點，本試驗采用超聲波-酶法協(xié)同提取綠蘆筍中可溶性膳食纖維，通過Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析，獲得最佳提取工藝條件，以期為綠蘆筍資源的綜合利用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

綠蘆筍：漯河市億康工貿(mào)有限公司；氫氧化鈉、檸檬酸、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；纖維素酶（酶活力≥5 000.0 U/g）：索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

i9雙光束紫外可見分光光度計：濟南海能儀器股份有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FiveEasy Plus FE28 pH計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠蘆筍可溶性膳食纖維提取及測定

1.3.1.1 粗可溶性膳食纖維的提取工藝

參考劉秀鳳等[19]方法，略作修改。提取粗可溶性膳食纖維，具體工藝流程如下：

原料挑選、清洗→打漿→調(diào)節(jié)pH值→協(xié)同酶解→抽濾→醇沉→離心→沉淀物用80%乙醇洗滌3次→干燥→粗可溶性膳食纖維

操作要點：（1）原料挑選和清洗：挑選無彎曲畸形、無損傷、無病蟲害、長度在20 cm左右，直徑1.0 cm～1.5 cm的綠蘆筍為試驗材料，清洗干凈后備用。（2）打漿∶按綠蘆筍與水料液比1∶2（g/mL）進行打漿，當(dāng)原料呈細小的纖維狀，料液不黏，可均勻流動時停止攪打。（3）調(diào)節(jié)pH值：用2 mol/L檸檬酸逐滴加入至所需pH值，邊加邊振蕩，將檸檬酸溶液與漿液混勻，避免局部酸性偏高影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（4）酶解：向調(diào)pH值后的漿液中加入纖維素酶，放入超聲波清洗機中，一定時間后取出得到酶解液。（5）醇沉：在上述酶解液中按照體積比1∶1加入0.5%氫氧化鈉溶液，放入70℃水浴加熱210 min，抽濾后往濾液中加入4倍體積的無水乙醇，充分混合后靜置過夜，絮狀沉淀析出。（6）洗滌：用80%乙醇溶液洗滌沉淀，去除殘留還原糖[20]。

1.3.1.2 去蛋白

參考劉秀鳳等[19]方法，采用Sevag法[21]去蛋白。

1.3.1.3 可溶性膳食纖維的測定

采用苯酚－硫酸法測定。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參考周馳等[9]方法。分別量取濃度為 0.25 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，蒸餾水定容至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，振蕩搖勻，加硫酸5.0 mL，搖勻，室溫（25±1）℃放置 30 min，定容至10 mL，搖勻，于490 nm波長下測定吸光度。計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=35.249X-0.037 1（R2=0.993）。

2）可溶性膳食纖維樣液的制備：用適量蒸餾水溶解去蛋白的可溶性膳食纖維，并定容到250 mL，備用。

3）可溶性膳食纖維樣液的測定：取1 mL待測樣液，加入1 mL 5%苯酚，搖勻，加入5 mL濃硫酸，靜置30 min，定容至10 mL，在490 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可溶性膳食纖維含量。

1.3.2 超聲-酶法協(xié)同提取可溶性膳食纖維條件的確定

1.3.2.1 單因素試驗

1）纖維素酶添加量對SDF含量的影響

固定超聲功率270 W，酶解時間60 min，酶解溫度50℃，pH值4.5，考察纖維素酶添加量（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%）對SDF含量的影響，每組試驗重復(fù)3次。

2）超聲時間對SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、微波功率270 W、酶解溫度50 ℃、pH 值 4.5，考察超聲時間（0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）對 SDF 含量的影響，每組試驗重復(fù)3次。

3）pH值對SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、超聲功率270 W、酶解時間120 min，酶解溫度 50 ℃，考察 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對 SDF 含量的影響，每組試驗重復(fù)3次。

4）微波功率對SDF含量的影響

固定酶添加量0.06%、酶解時間120 min、酶解溫度 50 ℃、pH 值 4.5，考察微波功率（0、120、150、180、210、240、270、300 W）對 SDF 含量的影響，每組試驗重復(fù)3次。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取纖維素酶添加量、超聲時間、pH值、超聲功率為考察因子，SDF含量為響應(yīng)值，利用Design Expert進行Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化超聲協(xié)同酶解工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。采用Origin8.6軟件作圖，使用Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 纖維素酶添加量對SDF含量的影響

纖維素酶添加量對SDF含量的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對SDF含量的影響Fig.1 Effects of cellulase addition on SDF content

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量的增加，SDF含量呈先上升后下降趨勢，當(dāng)纖維素酶添加量為0.06%時，SDF含量達到最大值7.135 mg/g。SDF含量隨著纖維素酶添加量的繼續(xù)增加呈下降趨勢，此與田星等[16]研究的一致，可能是加入過量酶液導(dǎo)致一些SDF含量會被水解[16，22]的緣故。故確定纖維素酶最佳添加量為0.06%。

2.1.2 超聲時間對SDF含量的影響

超聲時間對SDF含量的影響見圖2。

圖2 超聲時間對SDF含量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on SDF content

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，SDF含量呈先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲時間達120 min時，SDF含量達到最大值6.236 mg/g。下降的原因可能是隨著超聲時間的延長，超聲波產(chǎn)生的剪切和空化作用切斷SDF之間相連的鍵，使部分SDF降解[23]，生成不易被乙醇沉淀的小分子物質(zhì)[24]，導(dǎo)致SDF含量下降。故確定最佳酶解時間為120 min。

2.1.3 pH值對SDF含量的影響

pH值對SDF含量的影響見圖3。

圖3 pH值對SDF含量的影響Fig.3 Effects of pH on SDF content

由圖3可知，隨著pH值的增加，SDF含量呈先上升后下降趨勢，并在pH值為5時，SDF含量達到最大值6.305 mg/g。故確定最佳酶解pH值為5.0。

2.1.4 超聲功率對SDF含量的影響

超聲功率對SDF含量的影響見圖4。

圖4 超聲功率對SDF含量的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on SDF content

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，SDF含量呈先上升后下降的趨勢，并在超聲功率為150 W時，SDF含量達到最高6.034mg/g。當(dāng)功率超過150 W時SDF呈下降的趨勢，可能由于超聲作用鈍化了酶的活性，甚至造成酶失活[25]，同時超聲的空化作用可能破壞SDF的結(jié)構(gòu)[26]，從而影響了SDF含量。故確定最佳超聲功率為150 W。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取纖維素酶添加量（X1）、超聲時間（X2）、pH 值（X3）、超聲功率（X4）為考察因子，SDF含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken原理設(shè)計并進行響應(yīng)面試驗。試驗因素水平設(shè)計見表1，試驗方案及結(jié)果見表2。

表1 Box Behnken分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box Behnken試驗方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and corresponding results

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到可溶性膳食纖維含量，對以上4個因素的二次多項回歸方程為：

為說明回歸方程的有效性以及各因素對響應(yīng)值（Y）影響程度，因此對回歸方程進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

由表3可知，模型P<0.000 1，表明回歸模型高度顯著；失擬項P=0.407>0.05，表明模擬失擬項不顯著，表明模型合適，即試驗數(shù)據(jù)有意義。決定系數(shù)R2是參數(shù)變量和總變量的比值，也是檢測數(shù)據(jù)合理性的指標(biāo)。當(dāng)R2接近1時，表明模型與真實數(shù)據(jù)擬合度好[27]。本試驗?zāi)Ｐ突貧w相關(guān)系數(shù)R2=0.954 6，說明相關(guān)性較好；矯正決定系數(shù)R2Adj=0.909 2，表明90.92%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋，可用此模型對SDF含量進行分析和預(yù)測?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析：X1、X12、X22、X42對 SDF 含量的影響達到高度顯著水平，X2、X3、X1X2對 SDF 含量的影響達到極顯著水平，X1X4對SDF含量的影響達到顯著水平。各試驗因素的主效應(yīng)關(guān)系依次是：酶添加量（X1）＞pH 值（X3）＞超聲時間（X2）＞超聲功率（X4）。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

由表3可知，交互項X1X2、X1X4P值分別為0.0051、0.015 4，表明酶添加量與超聲時間之間的交互影響達到極顯著水平，酶添加量與超聲功率之間的交互影響達到顯著水平。圖5和圖6分別是根據(jù)上述回歸方程繪出的響應(yīng)曲面圖及等高線圖。

圖5 酶添加量（X1）和超聲時間（X2）對SDF含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasound time（X2）on SDF content

圖6 酶添加量（X1）和超聲功率（X4）對SDF含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effects of cellulase addition（X1）and ultrasonic power（X4）on SDF content

響應(yīng)曲面圖直觀地反映了這些因素對綠蘆筍SDF含量的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱[27]，兩因素交互作用越強，等高線越接近橢圓，而圓形則表示交互作用不明顯，且等高線越密集表明該因素的影響效果越大[28]。由圖5和圖6可看出，各影響因素對SDF含量的影響不是簡單的線性關(guān)系，各等高線均呈橢圓形，表明兩因素間的相互影響較顯著。從圖5可以看出，隨著酶添加量和超聲時間的增加，SDF含量呈先快速增高后逐漸降低的趨勢，且酶添加量的響應(yīng)面曲面較超聲時間陡峭，表明酶添加量比超聲時間影響大；從圖6中可以看出，隨著酶添加量和超聲功率的增加，SDF含量呈先增加后降低的趨勢，同樣酶添加量曲面較陡峭，影響大于超聲功率。

2.2.4 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗證

通過回歸模型，采用Design Expert8.0軟件優(yōu)化酶解工藝，得到最佳條件為：纖維素酶添加量0.066%、超聲113.59 min，pH5.48，超聲功率 171.58 W，預(yù)測蘆筍可溶性膳食纖維含量可達到8.825 mg/g。

為檢測響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，根據(jù)試劑操作和設(shè)備性能，將上述最優(yōu)條件修正為：纖維素酶添加量0.065%、超聲114 min，pH5.50，超聲功率180 W，進行3次重復(fù)試驗，在此條件下實際測得蘆筍可溶性膳食纖維含量為（8.807±0.014）mg/g，比預(yù)測值稍低，但該值落在響應(yīng)值的95%預(yù)測區(qū)間 [8.384 mg/g，9.266 mg/g]內(nèi)，表明所建回歸模型具有良好的預(yù)測效果。

3 結(jié)論

本研究采用超聲-酶法協(xié)同提取綠蘆筍可溶性膳食纖維工藝，基于單因素試驗，采用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法，擬合了酶添加量、超聲時間、pH值、超聲功率等4個因素對綠蘆筍可溶性膳食纖維含量的回歸模型。最終得到影響蘆筍可溶性膳食纖維含量的主次因素依次為：酶添加量＞pH值＞超聲時間＞超聲功率。根據(jù)模型及響應(yīng)面分析，進行修正后的最佳提取工藝為：纖維素酶添加量0.065%、超聲時間114 min，pH 5.50，超聲功率180 W。在此條件下，提取蘆筍可溶性膳食纖維得率最高，驗證試驗得到的得率為8.807 mg/g。綠蘆筍可溶性膳食纖維提取工藝的優(yōu)化，為綠蘆筍廢棄老莖的綜合利用提供較好的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。