超聲輔助纖維素酶法制備杏鮑菇蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化

許新月，崔文玉，黃澤天，弓志青，王文亮，王延圣，*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.聊城市陽(yáng)谷縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東聊城252300）

杏鮑菇屬于傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]，因其營(yíng)養(yǎng)豐富口感鮮美，具有草原牛肝菌之稱(chēng)[2]。杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，蛋白質(zhì)、膳食纖維含量較多，脂肪、灰分含量少，是優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源。杏鮑菇蛋白的抗炎性、抗病毒性以及抗氧化性等功能已經(jīng)得到研究人員證實(shí)[3-4]。杏鮑菇蛋白中具有人體必需氨基酸，在進(jìn)入人體消化系統(tǒng)后生成分子量不同的肽，其中小分子肽對(duì)降血壓、提高人體免疫力，以及預(yù)防癌癥等均有良好的功效，已逐漸成為研究熱點(diǎn)[5-6]?，F(xiàn)已有研究人員對(duì)杏鮑菇蛋白的提取方式進(jìn)行了研究，本文在已有研究的基礎(chǔ)上將超聲與纖維素酶解的方式結(jié)合在一起，通過(guò)響應(yīng)面分析進(jìn)一步優(yōu)化杏鮑菇蛋白提取方式，顯著提高了提取率，為下一步杏鮑菇蛋白功能活性研究奠定了基礎(chǔ)[7-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

杏鮑菇：濟(jì)南華聯(lián)超市；考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；纖維素酶（400 U/mg）：上海源葉有限公司；氫氧化鈉（片狀）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）：萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-A水浴恒溫振蕩器：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SB25-12DTb超聲水浴鍋、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；AR423CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)：日本日立（HITACHI）公司；SG2便攜式pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-6100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；78HW-1型恒溫磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 杏鮑菇粉末的制備

將杏鮑菇清洗后切片，放入50℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，使用高速粉碎機(jī)打粉后過(guò)100目篩，置于干燥器中保存。

1.2.2 杏鮑菇蛋白的提取

取定量杏鮑菇干粉，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取料液比、時(shí)間、溫度、pH值，杏鮑菇粉末水提一定時(shí)間后8000r/min離心10min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.2.3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

稱(chēng)取29.25 g NaCl固體溶于500 mL去離子水中，配置成0.15 mol/L NaCl溶液，0.1 g牛血清蛋白溶于1 000 mL去離子水中配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液[11]。取 7 個(gè)干凈的試管編號(hào) 0、1、2、3、4、5、6，向每只試管中分別加入 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液后，每只試管中分別加入 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL的NaCl溶液，再分別加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液[12-13]，混勻后靜置5 min，以0號(hào)試管作為空白對(duì)照，于595 nm處測(cè)定吸光值。得出線(xiàn)性方程為y=0.008 8x+0.008 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。

1.2.4 指標(biāo)的測(cè)定

杏鮑菇總蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定；上清液中蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；杏鮑菇蛋白提取率的計(jì)算：蛋白提取率/%=（上清液中蛋白含量/杏鮑菇總蛋白含量）×100[12]。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 料液比對(duì)蛋白提取率的影響

杏鮑菇粉1 g，超聲功率300 W，超聲20 min，研究1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）料液比對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響[14-17]。

1.2.5.2 超聲功率對(duì)蛋白提取率影響

杏鮑菇粉 1 g，料液比 1∶30（g/mL），超聲功率分別為 100、200、300、400、500 W，超聲 20 min。

1.2.5.3 超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率得影響

杏鮑菇粉 1 g，料液比 1 ∶30（g/mL），超聲功率400 W，分別超聲 10、15、20、25、30 min。

1.2.5.4 纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質(zhì)量2%的纖維素酶，pH 7.0，酶解溫度 20 ℃，分別酶解 25、30、35、40、45 min。

1.2.5.5 纖維素酶酶解pH值對(duì)蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質(zhì)量2%的纖維素酶，酶解溫度20℃，酶解時(shí)間30 min，酶解pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。

1.2.5.6 纖維素酶酶解溫度對(duì)蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質(zhì)量2%的纖維素酶，酶解pH 7.0，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度25、30、35、40、45、50 ℃。

1.2.5.7 纖維素酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

纖維素酶酶解pH 7.0，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度20℃，纖維素酶添加量為杏鮑菇粉質(zhì)量的1%、2%、3%、4%、5%[18-20]。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取具有顯著影響的功率（A）、時(shí)間（B）、料液比（C）、纖維素酶添加量（D）為自變量，杏鮑菇蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），使用Design-Expert 8.0.5b軟件Box-Behnken中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析，建立杏鮑菇蛋白提取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型[21-22]。試驗(yàn)因素及編碼水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Experimental factors and level table

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel和Design-Expert 8.0.5b進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇蛋白提取率影響因素的研究

2.1.1 料液比對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響

不同料液比對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析圖1得出，隨著液體體積增大，蛋白提取率增加，在料液比1∶30（g/mL）時(shí)提取率最大，此后隨液體體積的增大蛋白提取率呈下降趨勢(shì)。在液體體積較低時(shí)杏鮑菇粉擴(kuò)散作用較弱，蛋白提取率低；當(dāng)液體體積較高時(shí)，蛋白與溶液之間的濃度差較小不利于蛋白溶出。因此選擇料液比1∶30（g/mL）進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 超聲功率對(duì)蛋白提取率的影響

不同超聲功率對(duì)蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

分析圖2得出，杏鮑菇蛋白提取率在100 W～400 W范圍內(nèi)，隨超聲功率的提高逐漸增大，在超聲功率400W時(shí)達(dá)到最大，此后超聲功率提高，蛋白提取率下降。在隨著超聲功率增大的過(guò)程中，超聲破碎杏鮑菇的細(xì)胞壁使其細(xì)胞中的蛋白溶出，蛋白提取率增加；超聲功率繼續(xù)增大，超聲破壞已溶出的蛋白質(zhì)，蛋白提取率降低。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖2 超聲功率對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

圖3 超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在10 min～20 min范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率增大，在20 min時(shí)達(dá)到最大，隨著時(shí)間繼續(xù)增加，蛋白提取率降低。超聲前期杏鮑菇細(xì)胞破碎蛋白溶出，提取率升高；后期超聲過(guò)程中，破碎已溶出的蛋白，同時(shí)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)產(chǎn)生熱量對(duì)蛋白具有破壞作用，故提取率降低。

2.1.4 纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase hydrolysis time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在25 min～35 min范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白提取率增大，在35 min時(shí)達(dá)到最大，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。隨著時(shí)間繼續(xù)增加，纖維素酶進(jìn)一步對(duì)破碎后的杏鮑菇細(xì)胞壁進(jìn)行水解，蛋白質(zhì)溶出，提取率升高；時(shí)間增加，凝集沉淀，提取率降低。

2.1.5 纖維素酶酶解pH值對(duì)蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解pH值對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 纖維素酶酶解pH值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of cellulase hydrolysis pH value on protein extraction rate

pH 4.0時(shí)，杏鮑菇蛋白提取率最低，因?yàn)樵損H值位于杏鮑菇等電點(diǎn)附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低。pH 6.0時(shí)蛋白提取率最高，此時(shí)纖維素酶活性最大，蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng)，溶解性提高；此后，隨pH值增大，纖維素酶活性降低，提取率降低。

2.1.6 纖維素酶酶解溫度對(duì)蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解溫度對(duì)蛋白提取率影響試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 纖維素酶酶解溫度對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of cellulase hydrolysis temperature on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析圖6可以看出，杏鮑菇蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，溫度30℃時(shí)，提取率最高，纖維素酶活性最大；溫度繼續(xù)升高，纖維素酶活性下降，杏鮑菇蛋白受熱分解，提取率下降。

2.1.7 纖維素酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

不同的纖維素酶添加量對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 纖維素酶添加量對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of cellulase addition on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

隨著纖維素酶添加量的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在添加量為2%時(shí)蛋白提取率最高，在一定的料液比情況下隨纖維素酶增加蛋白提取率升高，纖維素酶添加量增大，總固形物含量上升，杏鮑菇粉擴(kuò)散作用減弱，同時(shí)纖維素酶擴(kuò)散作用降低，蛋白提取率降低。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析與提取工藝優(yōu)化

2.2.1 二次回歸方程模型的建立

固定纖維素酶酶解時(shí)間35 min，纖維素酶酶解pH 6.0，纖維素酶酶解溫度30℃，以有顯著影響的功率、時(shí)間、料液比、纖維素酶添加量為自變量，杏鮑菇蛋白提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2[8，21-23]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Response surface experiment design and results

采用Design-Expert 8.0.5b數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析，得到關(guān)于蛋白提取率（Y）以及A、B、C、D 的回歸模型：Y=37.04-0.067A-1.34B+2.77C-0.81D-0.15AB+2.12AC+0.92AD+3.27BC+0.45BD+1.60CD-3.22A2-2.03B2-5.44C2-3.75D2。

回歸模型方差分析如表3所示。

該模型F=21.56，P<0.001，顯示為杏鮑菇蛋白提取效果回歸模型極顯著；回歸方程失擬項(xiàng)的F值為0.17表明失擬項(xiàng)與誤差項(xiàng)相比效果不明顯；決定系數(shù)R2=0.955 7，顯示出此模型的擬合程度較好，能夠使用該模型對(duì)杏鮑菇蛋白提取進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2.2.2 交互作用分析

在該模型A、B、C、D 4個(gè)因素中C因素效果極顯著，B、D因素效果顯著，A不顯著；交互作用中，AB、AD、BD交互作用不顯著，AC、CD交互作用顯著，BC交互作用極顯著；在二次項(xiàng)中A2、C2、D2效果極顯著，B2效果顯著；由F檢驗(yàn)可以看出A、B、C、D四個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響為C>B>D>A，即料液比>超聲時(shí)間>纖維素酶添加量>超聲功率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

各因素交互作用對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8。

在圖 8（a）～（c）中，響應(yīng)面圖的形狀起伏越大，兩個(gè)因素之間差異越明顯。等高線(xiàn)圖中，等高線(xiàn)形狀趨近于橢圓形則交互作用明顯，若等高線(xiàn)形狀趨近于圓形則交互作用不明顯。

圖8（a）中，當(dāng)超聲時(shí)間以及纖維素酶添加量一定時(shí)，隨超聲功率以及料液比的變化，蛋白質(zhì)提取率整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，料液比變化幅度大于超聲功率，提取率最高為35.7%。等高線(xiàn)圖呈現(xiàn)橢圓形，交互作用顯著。

圖8 各因素交互作用對(duì)杏鮑菇蛋白提取率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the interaction of various factors on the protein extraction rate of Pleurotus eryngii

圖8（b）中，當(dāng)超聲功率與纖維素酶添加量一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間與料液比的變化，蛋白提取率整體變化明顯，響應(yīng)面圖中隨著超聲時(shí)間的變化蛋白提取率變化明顯，先升高后下降的趨勢(shì)明顯，料液比變化幅度大于超聲時(shí)間，提取率最高為36.7%。等高線(xiàn)圖中呈現(xiàn)橢圓形，超聲時(shí)間與料液比的交互作用極顯著。

圖8（c）中，當(dāng)超聲時(shí)間與超聲功率一定時(shí)，隨著料液比和纖維素酶添加量的變化，響應(yīng)面圖蛋白提取率整體變化明顯，料液比變化幅度大于纖維素酶添加量，提取率最高為35.4%。等高線(xiàn)圖呈現(xiàn)橢圓形，交互作用顯著。

2.2.4 回歸模型驗(yàn)證

Design-Expert 8.0.5b分析結(jié)果表明，最佳料液比為1∶30.31（g/mL）、超聲功率398.7 W、超聲時(shí)間 20.4 min、纖維素酶添加量1.92%。杏鮑菇蛋白提取率理論值為75.1%。根據(jù)實(shí)際修正為料液比1∶30（g/mL）、超聲功率400 W、超聲時(shí)間20 min、纖維素酶添加量2%，得到的杏鮑菇蛋白提取率為75.7%，相對(duì)偏差0.79%，可見(jiàn)該模型能夠較好預(yù)測(cè)蛋白提取條件。

3 結(jié)論

對(duì)杏鮑菇蛋白提取的研究，從料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、纖維素酶酶解時(shí)間、纖維素酶酶解pH值、纖維素酶酶解溫度、纖維素酶添加量7個(gè)方面對(duì)杏鮑菇蛋白提取影響因素進(jìn)行了研究，選取了4個(gè)具有顯著影響效果的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，由F檢驗(yàn)得出對(duì)杏鮑菇蛋白提取效果影響順序?yàn)榱弦罕?超聲時(shí)間>纖維素酶添加量>超聲功率。優(yōu)化后得到最佳提取條件為料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 400 W、超聲時(shí)間 20 min、纖維素酶添加量2%。實(shí)際提取率75.7%，理論提取率75.1%，相對(duì)偏差0.79%，證明該模型可行，為杏鮑菇蛋白的提取提供了依據(jù)。杏鮑菇具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)杏鮑菇的研究較少，因此，為了充分開(kāi)發(fā)利用杏鮑菇，提高杏鮑菇深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展仍需加大科研力度，完善杏鮑菇蛋白提取方法，符合工業(yè)生產(chǎn)要求，提高生產(chǎn)效率。