酶解對(duì)紫蘇蛋白乳化特性的影響

王麗娜，孫洪蕊，李鳳林，劉香英，田志剛，康立寧，*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長(zhǎng)春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Brit]別名赤蘇、香蘇、紅蘇、紅紫蘇，系唇形科紫蘇屬一年生草本植物[1]。紫蘇是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食藥兩用型植物，紫蘇籽中的油脂含量很高，其中又以α-亞麻酸含量居多[2-3]，紫蘇籽粒中蛋白含量為20%～25%，其脫脂后的副產(chǎn)物（紫蘇餅粕）蛋白含量高達(dá)28%～45%[4-5]。紫蘇蛋白具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以作為新興植物蛋白資源應(yīng)用于食品工業(yè)中[6]。

作為一種新的植物蛋白資源，人們對(duì)紫蘇蛋白在食品加工中功能特性的研究還不夠深入。吳錦波等[7]研究認(rèn)為紫蘇濃縮蛋白溶解特性和乳化特性受pH值、離子強(qiáng)度、溫度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度等影響。姜文鑫[8]、劉寧等[9]研究表明紫蘇蛋白中不同蛋白組分的功能性質(zhì)不同。盛彩虹等[10]研究認(rèn)為中性條件下紫蘇分離蛋白的乳化性、起泡性和凝膠性均不及大豆分離蛋白。乳化性作為植物蛋白的基本特性之一，對(duì)飲料、奶油、焙烤等乳制品的品質(zhì)和穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。

酶法改性是提高植物蛋白乳化性的重要手段，它具有催化反應(yīng)條件溫和而且專(zhuān)一、無(wú)副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離蛋白改性的主要研究方向，通過(guò)酶解改性提高植物蛋白功能特性是近來(lái)食品科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。應(yīng)用酶法改性可以明顯提高大豆蛋白[11-12]、核桃蛋白[13]、甘薯蛋白[14]、米渣蛋白[15]等常見(jiàn)植物蛋白的乳化特性。但酶法改性在提高紫蘇蛋白乳化特性方面的研究還較為少見(jiàn)。

本文以提高紫蘇蛋白乳化性為目的，采用堿性蛋白酶對(duì)紫蘇分離蛋白進(jìn)行酶解改性，研究不同酶解程度和改性工藝對(duì)乳化特性的影響，并對(duì)改性的紫蘇蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行了分析，以期為紫蘇蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持促進(jìn)紫蘇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇粕：吉林沃達(dá)食品有限公司；堿性蛋白酶（1.7×105U/g）：吉林奧博星生物有限公司；木瓜蛋白酶（4.2×104U/g）、胰蛋白酶（7.4×104U/g）：北京沃爾康星技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器和設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2300）：上海美天儀器有限公司；數(shù)顯pH計(jì)（pHS-25）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)（APV-1000）：丹麥APV公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇分離蛋白的制備

紫蘇分離蛋白采用堿溶酸沉的方法提取[16-17]。用乙腈將放在索氏抽提中的紫蘇餅粕進(jìn)行脫脂6 h，通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，脫脂粉裝入聚乙烯袋中，在-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。脫脂紫蘇粉與蒸餾水1∶20（g/mL）混合，2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為10，60℃水浴1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，1 mol/LHCL調(diào)至等電點(diǎn)pH為4.4，5 000 r/min離心10 min。沉淀水洗3次，用1 mol/L NaOH調(diào)至pH值為7，冷凍干燥，即得分離蛋白，過(guò)60目篩4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定，參考GB/T28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定分光光度法》。

1.3.3 紫蘇蛋白酶的酶解處理

1.3.3.1 各蛋白酶的酶解條件

3種蛋白酶的最適酶解條件見(jiàn)表1。

表1 各蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymatic conditions of each protease

1.3.3.2 蛋白水解度的測(cè)定

本研究中采用pH-stat法[18-19]，此法操作簡(jiǎn)便，可以連續(xù)測(cè)定。公式如下：

式中：B為水解過(guò)程中消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；Nb為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；α 為 α-氨基解離度；MP為底物蛋白質(zhì)含量，g；htot為蛋白質(zhì)中總的可被水解的肽鍵數(shù)（紫蘇蛋白為7.219 mmol/g）。

1.3.4 紫蘇蛋白的功能性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 乳化性測(cè)定

參考WANG[20]方法并做適當(dāng)改動(dòng)。精確稱(chēng)取1g左右樣品，溶解于100 mL水中，室溫25℃下1 000 r/min攪拌1 h，取15 mL蛋白溶液與5 mL紫蘇油混合，在高速乳化均質(zhì)機(jī)下13 500 r/min乳化2 min后倒入25 mL燒杯中，分別于0 min，10 min在燒杯底部取20 μL與5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液均勻混合，在500 nm處測(cè)定吸光度值。

式中：T=2.303為固定常數(shù)；N為稀釋倍數(shù)，取250；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，g/mL；φ為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)0.25；A0為0 min的吸光度值；A10為10 min的吸光度值。

1.3.5 紫蘇蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)測(cè)定

1.3.5.1 掃描電鏡

利用掃描電鏡觀察原料蛋白與堿性蛋白酶改性樣品的表面結(jié)構(gòu)變化情況。

1.3.5.2 傅里葉紅外光譜測(cè)試

將冷凍干燥后的紫蘇蛋白樣品處理后稱(chēng)取1 mg，加入適量的溴化鉀進(jìn)行研磨，使溴化鉀與蛋白充分混勻后再進(jìn)行壓片處理，而后進(jìn)行傅里葉紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR） 分析測(cè)試。通過(guò)持續(xù)充入N2進(jìn)入測(cè)量室以避免水蒸氣的干擾，并排除空氣背景。分析測(cè)試的波數(shù)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率 4 cm-1，波數(shù)精度 0.01 cm-1、掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25℃[21-22]。

1.3.6 堿性蛋白酶的酶解條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化。以紫蘇分離蛋白的乳化活性為響應(yīng)值，A酶添加量、B酶解時(shí)間、C酶解溫度、D酶解底物濃度、E酶解pH值為影響因素，根據(jù)響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)五因素三水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。其因素和水平編碼表見(jiàn)表2。

表2 因素水平編碼Table 2 Factor level coding table

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件繪圖，用SPSS 11.5分析軟件進(jìn)行相關(guān)分析和方差分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶酶活

3種蛋白酶的酶活力見(jiàn)表3。

表3 各蛋白酶酶活力Table 3 Protease activity

如表3各蛋白酶的酶活力，由于3種蛋白酶存在生產(chǎn)儲(chǔ)運(yùn)時(shí)間等差異，試驗(yàn)所用的蛋白酶活力之間存在差異，但總體保持原有蛋白酶活性，可以保證良好的酶解效果。

2.2 不同蛋白酶酶解紫蘇分離蛋白水解度的變化

3種蛋白酶對(duì)紫蘇蛋白水解度的變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同酶隨水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of different enzymes on DH with hydrolysis time

如圖1所示，胰蛋白酶先呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但在60 min后水解度逐漸下降，原因可能是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和數(shù)量有限，從而限制了胰蛋白酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致水解度不會(huì)無(wú)限升高，后期變化趨勢(shì)逐步下降[23]。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的水解度總體相似，在酶解的初始階段，水解度均隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而當(dāng)酶解繼續(xù)進(jìn)行后，水解度開(kāi)始隨著水解時(shí)間的增加逐步下降又趨向平穩(wěn)。原因在于，酶解反應(yīng)初期，紫蘇蛋白乳液的底物豐富，蛋白酶中的肽鍵及酶解切割位點(diǎn)被作用的較多，因而，水解度呈現(xiàn)出相對(duì)比較明顯的上升趨勢(shì)。但隨著酶解反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，紫蘇分離蛋白逐漸被切割為多肽，可供蛋白酶提供的切割位點(diǎn)逐漸減少，導(dǎo)致水解度的增長(zhǎng)緩慢，此外水解產(chǎn)物的積累可能對(duì)蛋白酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，進(jìn)而影響蛋白酶活力，這也是水解度曲線在此條件下增長(zhǎng)緩慢的原因之一[24]。根據(jù)水解度的變化趨勢(shì)可知，3種蛋白酶水解能力由強(qiáng)到弱依次為堿性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。比較3種蛋白酶對(duì)紫蘇蛋白水解度的變化影響，最終選擇堿性蛋白酶為本試驗(yàn)的水解酶。

2.3 不同酶解對(duì)紫蘇分離蛋白乳化性的影響

2.3.1 不同酶隨水解時(shí)間對(duì)乳化活性的影響

3種酶在相同的底物濃度2%和酶的添加量3 000 U/g下，各種酶在其最適的反應(yīng)溫度和pH值下分別水解，測(cè)定不同時(shí)間水解產(chǎn)物的乳化性。不同酶隨水解時(shí)間對(duì)乳化活性的影響見(jiàn)圖2。

如圖2所示，在不同時(shí)間內(nèi)3種酶的乳化特性，都先隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的不斷增加，蛋白質(zhì)斷裂成肽段后分子剛性降低，紫蘇分離蛋白的分子形狀由緊密球體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性分子，從而增加了蛋白的分子柔性，并且更加有順序的排列在油水界面；另外，隨著酶解處時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)內(nèi)部包埋的疏水性基團(tuán)開(kāi)始暴露出來(lái)，并慢慢擴(kuò)散于油水界面，進(jìn)而降低界面張力，從而使紫蘇分離蛋白乳化性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[25]。但隨著水解時(shí)間的不斷增加，紫蘇分離蛋白水解度增大，使紫蘇分離蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)力（包括氫鍵、范德華力）逐漸開(kāi)始被破壞，致使油滴表面的保護(hù)層變的脆弱，進(jìn)而導(dǎo)致乳化性的降低[26]。

圖2 不同酶隨水解時(shí)間對(duì)乳化活性的影響Fig.2 Effect of different enzymes on emulsification activity with hydrolysis time

通過(guò)比較可知，木瓜蛋白和胰蛋白酶的乳化特性相對(duì)較好，堿性蛋白酶其次；木瓜蛋白酶在30 min～40 min內(nèi)，乳化活性先升高再降低的趨勢(shì)，分析原因可能是紫蘇分離蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，多肽鏈開(kāi)始展開(kāi)，使原來(lái)隱藏在分子內(nèi)部的很多疏水區(qū)域暴露于溶液中，然而這種疏水區(qū)域在水溶液中是不穩(wěn)定的，它們會(huì)因相互疏水作用而凝集或聚合在一起，進(jìn)而從溶液中析出而沉降，從而使紫蘇分離蛋白的表面疏水性增加[27]。胰蛋白酶和堿性蛋白酶在30 min～70 min內(nèi)，乳化活都呈現(xiàn)先逐步升高后又逐步降低的趨勢(shì)，分析原因?yàn)槿榛匦缘脑黾涌赡苁怯捎诖蠓肿拥鞍踪|(zhì)的降解，使蛋白的溶解性不斷提高，從而乳化活性更好。不同酶隨水解時(shí)間對(duì)乳化穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。

如圖3為不同種酶在不同時(shí)間下對(duì)紫蘇蛋白乳化穩(wěn)定性的影響，經(jīng)過(guò)不同蛋白酶處理的紫蘇分離蛋白乳化穩(wěn)定性變化不一。堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解后的紫蘇分離蛋白乳化穩(wěn)定性有顯著提升，通常蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性與乳滴粒徑大小有關(guān)，堿性蛋白酶酶解后酶解肽段變小引起液滴粒徑減小，進(jìn)而造成紫蘇蛋白酶解修飾后乳化穩(wěn)定性提高[28-29]。另外，胰蛋白酶酶解后的紫蘇蛋白乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)了降低的趨勢(shì)。分析原因可能是酶水解會(huì)釋放出疏水基團(tuán)，增加蛋白疏水性，有利于乳化性的提高，但由于小分子肽含量過(guò)多，分子量過(guò)小的蛋白在油-水界面無(wú)法形成剛性結(jié)構(gòu)，所以乳化穩(wěn)定性較差，形成的乳狀液不穩(wěn)定[30]。

圖3 不同酶隨水解時(shí)間對(duì)乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of different enzymes on emulsification stability with hydrolysis time

2.4 紫蘇分離蛋白的酶解

2.4.1 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

在酶解處理單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。以紫蘇分離蛋白的乳化活性（Y）為響應(yīng)值，A酶添加量、B酶解時(shí)間、C酶解溫度、D酶解底物濃度、E酶解pH值為影響因素，設(shè)計(jì)五因素三水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。其因素水平編碼表見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)安排及結(jié)果Table 4 Test arrangement and results

續(xù)表4 試驗(yàn)安排及結(jié)果Continue table 4 Test arrangement and results

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

Y=74.88-1.6A-8.07B+8.71C-3.84D-0.071E-5.07AB+2.93AC+1.07AD+1.04AE+2.90BC+0.50BD+4.19BE+4.06CD+0.96CE+0.75DE-1.60A2-9.35B2-8.54C2-4.22D2-3.88E2應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)紫蘇蛋白乳化性模型方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），一般情況下，R2越接近于 1，擬合的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮胶茫涣硪环矫?，R2值越小，模型中獨(dú)立變量的相關(guān)性越差，從方差分析得到的回歸方程顯示，模型的擬合度和校正擬合度分別為0.942 1和0.895 7，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明了二次模型的模擬具有較高的可信度。交互項(xiàng)AC、AD、AE、BC、BD、CE、DE、A2對(duì)紫蘇蛋白乳化活性沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）；而 A、B、C、D、AB、BE、CD、B2、C2、D2、E2項(xiàng)對(duì)蛋白乳化活性具有顯著影響 （P＜0.05）。由F值可以得出，影響蛋白乳化活性因素的貢獻(xiàn)值大小順序?yàn)镃＞B＞D＞A＞E，即酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶解底物濃度＞酶添加量＞酶解pH值。失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明其他未知因素不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成顯著干擾，并能較好地反映乳化活性與底物濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量及酶解pH值的關(guān)系，故此回歸方程能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)乳化活性隨各參數(shù)變化規(guī)律。

表5 紫蘇蛋白乳化性回歸與方差分析結(jié)果Table 5 Results of emulsification regression and variance analysis of perilla protein

2.4.2 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析最佳酶解溫度46.94℃、酶添加量為1820.9U/g、酶解時(shí)間為37.62min、底物濃度為4.97%、酶解pH值為8.81，在此條件下紫蘇分離蛋白乳化活性的預(yù)測(cè)值為79.16 m2/g，與對(duì)照組（未加堿性蛋白酶）紫蘇蛋白的乳化活性40.86 m2/g相比提高了93.73%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述最佳酶解條件對(duì)紫蘇蛋白的乳化活性進(jìn)行5次試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得的乳化活性平均值為78.86 m2/g，與預(yù)測(cè)值接近，證明了模型的可行性。

2.5 紫蘇蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定

2.5.1 電鏡掃描結(jié)果

掃描電鏡結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 原料蛋白與改性蛋白掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph of raw protein and modified protein

從圖4可以看出，在相同放大倍數(shù)（200×）下，未經(jīng)改性的原料蛋白比較規(guī)整，分子之間距離靠近，結(jié)構(gòu)緊密，有細(xì)微的孔眼，且很淺；質(zhì)地飽滿(mǎn)顆粒表面光澤，顆粒的大小不均勻；經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶改性后的蛋白表面展開(kāi)，孔眼較多且孔眼較深，質(zhì)地疏松；原因可能是在堿性蛋白酶改性過(guò)程中露出了被深埋在蛋白分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)，增強(qiáng)了分子柔韌性，蛋白分子在界面上的展開(kāi)與形態(tài)的改變會(huì)更容易些。這使堿性蛋白酶對(duì)乳化活性增大的微觀原因得到了很好的直觀說(shuō)明。

2.5.2 紅外光譜分析

紅外光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5、堿性蛋白酶改性后紅外光譜圖見(jiàn)圖6。

圖5 原料蛋白紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of raw protein

圖6 堿性蛋白酶改性后紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of alkaline protease modification

從圖5和圖6對(duì)比可以看出，堿性蛋白酶改性的分離蛋白在 1 451.62、1 236.90、162.62 cm-1均出現(xiàn)了新的吸收峰，經(jīng)查找，芳環(huán)C-H吸收峰位于3 100 cm-1～3 000 cm-1，醛基 C-H 吸收峰位于 2820 cm-1～2 720 cm-1，芳香胺C-N吸收峰位于1 350 cm-1～1 280 cm-1。酸酐C-O的吸收峰位于1 310 cm-1～1 045 cm-1，因此推測(cè)先產(chǎn)生的吸收峰分別是芳香胺、酸酐發(fā)生了伸縮振動(dòng)。另外3 276.25 cm-1處的吸收峰變平，由于N-H鍵的吸收峰在3 500 cm-1～3 300 cm-1[31]，推測(cè)有新的基團(tuán)在NH2處引入。

3 結(jié)論

本研究以紫蘇分離蛋白為原料，選用堿性蛋白酶對(duì)紫蘇分離蛋白進(jìn)行酶解改性，提高紫蘇分離蛋白的乳化性能，結(jié)果表明：蛋白酶的篩選堿性蛋白酶的水解度最好，其改性選擇堿性蛋白酶。紫蘇蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶酶解改性后，在酶解溫度46.94℃，酶添加量1 820.9 U/g，反應(yīng)時(shí)間37.62 min，底物濃度為4.97%，pH=8.81在此條件下，其乳化活性為79.16 m2/g，較改性前提高了93.73%。通過(guò)掃描電鏡得出，經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶改性使原來(lái)緊密、不均勻的顆粒微觀結(jié)構(gòu)變得質(zhì)地疏松、均勻的微觀結(jié)構(gòu)；紅外光譜分析得出經(jīng)堿性蛋白酶改性的蛋白有明顯吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明有新的基團(tuán)引入。