巖石-土壤-四川牡丹元素遷移體系中的微生物效應(yīng)

馮瑋娜，彭培好，謝成晟，羅 雯

(成都理工大學(xué) 地球科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610059)

土壤是地球關(guān)鍵帶的重要組成部分，生物和非生物在此進(jìn)行著高頻率的物質(zhì)交換和能量、信息的傳遞[1-2]。土壤對成土母巖有一定的物質(zhì)繼承性，土壤中大約80%～100%的鉀、鈣、鎂和磷來自巖石的風(fēng)化輸入[3]。成土母巖是植物礦質(zhì)元素的初始來源，成土初期，巖體微裂隙及表面附著的微生物和低等植物在營養(yǎng)需求的驅(qū)動下直接與巖石作用，在促進(jìn)巖石風(fēng)化釋放礦質(zhì)元素的同時固定碳，為植物的生長儲備條件；土壤中的動植物及微生物生活產(chǎn)生的酸性和具有生命活性的分泌物促進(jìn)巖石礦物的進(jìn)一步風(fēng)化[2-3]。快速的風(fēng)化并不等于可利用元素的快速補(bǔ)充，早期風(fēng)化產(chǎn)物難以發(fā)生化學(xué)變化，而微生物快速多樣的代謝過程所塑造的氧化還原微環(huán)境則為元素形態(tài)轉(zhuǎn)化、次生礦物的進(jìn)一步風(fēng)化提供了動能[4-5]。土壤微生物的結(jié)構(gòu)和功能深刻影響著全球元素(主要是碳氮)大循環(huán)和巖石—土壤—植物間的元素小循環(huán)[6-7]。然而，由于微生物種類繁多、功能多樣、微生物群落間、微生物與其它生物和非生物關(guān)系復(fù)雜，其在土壤中所承擔(dān)的生態(tài)功能至今未得到清晰的描述[8]。

巖石風(fēng)化與元素循環(huán)直接影響土壤營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步影響植物生長和生態(tài)演化[9-11]。例如，中國干旱及半干旱區(qū)，土壤元素平衡(P，S，Be，Al，Mo，Pb，Cd，Ni)對禾本科、莎草科、豆科植物的生長有重要影響。中國干旱區(qū)，磷是控制草甸草原發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[12]。四川牡丹是一種自然分布帶狹窄的極小種群[13]，多生長于營養(yǎng)貧瘠的坡積物上，其獨(dú)特的基質(zhì)條件和營養(yǎng)循環(huán)特點(diǎn)尚未得到深入研究。本文就四川牡丹生境的巖土元素組成特點(diǎn)進(jìn)行研究，并描述幾種大量、微量營養(yǎng)元素的遷移富集規(guī)律，分析細(xì)菌、真菌在元素遷移吸收過程中的效應(yīng)，為了解營養(yǎng)元素的表生地球化學(xué)行為規(guī)律、微生物在元素遷移體系中的作用提供理論依據(jù)，同時為研究四川牡丹及其它干旱河谷地帶性植被的基質(zhì)條件與營養(yǎng)循環(huán)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

四川牡丹生長于岷江及大渡河上游海拔2 204～2 800 m的干旱河谷地帶，谷坡多在30°～40°之間，有的甚至更高。土壤層薄、石礫多、成熟度低。根據(jù)四川牡丹野外分布調(diào)查結(jié)果，于2018和2019年8月下旬在四川牡丹的5個集中分布區(qū)(見表1)，分別選擇3～5個四川牡丹分布較集中的地點(diǎn)劃分5 m×5 m的樣方。每個樣方內(nèi)隨機(jī)選擇3株四川牡丹，于地莖30 cm范圍內(nèi)根系分布密集處采集土壤，混合為1份土壤樣品。四川牡丹生長的土壤層極薄，故在除去土壤表層枯落物后垂直挖取土壤截面至礫石層，不分層取樣。同時使用經(jīng)75%酒精消毒的鐵鏟、無菌手套等取樣工具，取根莖抖落土壤于無菌密封袋中，并立即使用冰袋保存送回實(shí)驗室。收集樣方內(nèi)所有植株已成熟的種子。對照區(qū)域地質(zhì)圖在四川牡丹垂直分布帶的上、中、下部各尋找一處母巖出露處采集母巖樣品。共取得35件土壤樣品(包括12件根際土壤樣品)，17件巖石樣品以及25件植物種子樣品。

表1 研究區(qū)樣點(diǎn)布置

1.2 元素含量測定

取巖石、自然風(fēng)干后的土壤粉碎并過75 μm 200篩目篩，經(jīng)105 ℃烘干2 h后使用硝酸、氫氟酸3∶2微波消解[14]。

植物種子先后于烘箱105 ℃烘干30 min，80 ℃烘干4 h，過60目篩，采用硝酸、雙氧水8∶2濕法消解。所有消解后的樣品經(jīng)過濾，ICP-OES測定P，S，K，Na，Ca，Mg，Al，F(xiàn)e，Mn，Cu的含量(巖石、土壤中的元素含量以氧化物計)[14]。取自然風(fēng)干，過60目篩的土壤電位法[15]測定土壤pH值。

1.3 微生物基因測序

使用ZymoBIOMICSTM DNA Minipre Kit提取試劑盒提取根際土壤的細(xì)菌和真菌DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增及檢測(擴(kuò)增引物詳見表2)，產(chǎn)物回收后，使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit所建文庫，于Illumina Hiseq 2500平臺PE250模式測序。測序結(jié)果經(jīng)過Trimmomatic2976質(zhì)控及除雜，在97%的一致性水平上進(jìn)行OTU聚類及分類注釋[16]。

表2 土壤細(xì)菌及真菌PCR擴(kuò)增引物序列[17-18]

2 數(shù)據(jù)處理

元素遷移累積系數(shù)=(X土壤/Al土壤)/(X巖石/Al巖石)，表征某元素(X)相對于參比元素Al的遷移積累特征。植物吸收富集系數(shù)=(X植物/X土壤)×100%，表征元素從土壤到植物的生物吸收特征。土壤風(fēng)化淋溶率以土壤、巖石的風(fēng)化淋溶指數(shù)之比表示，指數(shù)包括：鋁鐵系數(shù)(Af)=Al2O3/Fe2O3，堿金屬淋溶系數(shù)(Kn)=(Na2O+K2O)/Al2O3，堿土金屬淋溶系數(shù)(Cm)=(CaO+MgO)/Al2O3和鋁化率(α)=Al土壤/Al母巖[19]。微生物物種多樣性(Alpha)指數(shù)包括豐富度指數(shù)ACE和Chao1，多樣性指數(shù)Shannon，Simpson(此處以1-Simpson指數(shù)的值計)和InvSimpson[16,20]。

使用Canoco 5默認(rèn)程序進(jìn)行主成分分析和冗余分析，SPSS 25進(jìn)行因子分析和Person相關(guān)性分析，R 3.6.1的corr.test函數(shù)對元素含量和微生物豐度進(jìn)行Spearmen相關(guān)分析(p<0.05)，并基于相關(guān)性結(jié)果使用igraph程序包構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 元素遷移富集特征

與華東地臺沉積蓋層相比，四川牡丹生長區(qū)母巖的Cu，S含量豐富，Ca，Mg含量較低(表3)。K，Ca，Na的最大值與最小值均相差四倍以上，反映各樣地母巖的鹽基儲量差異較大。四川牡丹生長土壤pH值介于7.4～8.0之間(表中未列出)，呈弱堿性。與全國表層土壤相比，四川牡丹生長土壤中S，Ca，Cu含量偏高，尤其是Ca遠(yuǎn)超過全國表層土壤鈣含量的95%區(qū)間。S，Cu在各樣點(diǎn)間含量差異較大，其最大值與最小值之比分別為4.89，3.24。植物種子中Al，F(xiàn)e含量差異較大，最大值與最小值之比分別為3.08，3.45。

表3 研究區(qū)巖石、土壤、植物元素含量

土壤營養(yǎng)元素的遷移富集系數(shù)排序為：Ca>Na>S>P>Mg>K>Al>Fe>Mn>Cu。其中P，S，K，Ca，Na，Mg的遷移富集系數(shù)大于1，在土壤中相對富集，F(xiàn)e，Mn，Cu的遷移富集系數(shù)小于1，表示其相對于Al發(fā)生了淋失。四川牡丹種子的元素吸收系數(shù)排序為：P>S>K>Cu>Mg>Ca>Na>Mn>Fe>Al。其中P，S的富集系數(shù)大于100%，表示其在四川牡丹種子中相對于土壤富集(見表3)。Al，F(xiàn)e均是植物所需的微量元素，其吸收率均不到1%。

3.2 元素組合特征

成土過程中諸多因素的干擾使得相互影響的元素之間往往難以呈現(xiàn)出線性關(guān)系，通過主成分分析探討元素間的潛在關(guān)聯(lián)有助于理解成土過程中的元素行為規(guī)律[23]。母巖與土壤之間的元素組成差異由主成分1解釋，各樣地之間的元素組成差異由主成分2解釋(見圖1)。因子向量向主軸的投影為因子貢獻(xiàn)率。相對于母巖，土壤以高Al2O3，CaO含量和低Cu，Na2O含量為最主要特征。這與元素遷移富集順序稍有偏差，因為主成分分析更關(guān)注樣點(diǎn)間的總體組成差異。巖石在各樣點(diǎn)間的組成差異由主成分2解釋，K2O，Na2O，F(xiàn)e2O3是最主要的載荷因子，表明3者含量不同是母巖元素組成的主要差異。相較于母巖，各樣點(diǎn)土壤的組成較為相似，這符合均一化理論，同時表明5個樣點(diǎn)的成土過程基本相似。

因子1和因子2分別指示母巖中大量元素(氧化物)和微量元素(見圖1)。主要存在兩個元素組合：①因子1的主要正載荷因子為Al2O3，F(xiàn)e2O3，S，K2O，P，CaO；②因子2的主要正載荷因子為Mn，Cu。

土壤中存在兩個組合：①因子1的主要正載荷因子P，S，Mn，Cu；②一二象限的Fe2O3，K2O，CaO，MgO，Al2O3(見圖1)。對比圖1中的各元素組成特征可知，母巖與土壤的元素(氧化物)組合基本相似，反映土壤對母巖的物質(zhì)繼承性。不同之處在于土壤的P，S移入了Mn，Cu的組合中(其中P與Mn相關(guān)性顯著，圖3)，表明兩種元素在母巖和土壤中的主要存在形式可能不同。

此外，pH值與K2O，CaO同是因子1的主要負(fù)載荷因子，表明土壤酸堿度與土壤K，Ca的遷移積累可能存在相互影響(見圖1)。因子1指示基質(zhì)的營養(yǎng)限制，其主要正載荷因子Al，Mn，P(其中Al分別與Mn，P顯著相關(guān))在種子中的含量均受到巖石和土壤元素組成的影響；因子2的正載荷因子S，F(xiàn)e，Mg，Cu均受到微生物活動的影響，其中S，Mg，F(xiàn)e兩兩之間顯著相關(guān)。Fe和Mg無論是在巖石、土壤還是植物中均在一個組合內(nèi)，雖然兩者沒有顯著的相關(guān)關(guān)系，但仍可以推測兩者在遷移吸收過程中存在潛在相互影響。

圖1 巖石、土壤、植物種子的元素組成特征

3.3 土壤環(huán)境與微生物多樣性

鋁鐵率、堿金屬和堿土金屬淋溶率越小，鋁化系數(shù)越高表明土壤經(jīng)歷的風(fēng)化淋溶程度越強(qiáng)，成熟度越高。鈣的高度聚集(見表3)使得堿土金屬淋溶率在此處并不適宜作為衡量土壤風(fēng)化程度的指標(biāo)，因此，堿土金屬淋溶率僅作為衡量CaO，MgO相對淋溶或富集情況的度量。堿金屬淋溶率在0.3～1之間，鋁化系數(shù)和鋁鐵率多在0.8～2之間，總體表現(xiàn)為土壤淋溶程度較弱(見表4)。

表4 研究四川牡丹生長區(qū)的土壤風(fēng)化淋溶率均值

對細(xì)菌群落Alpha多樣性和土壤風(fēng)化淋溶率做冗余分析。前兩個主軸共解釋了總變量的74.68%(見圖2)。4種風(fēng)化率指數(shù)所指示的風(fēng)化程度與微生物多樣性之間的關(guān)系并不一致，表明四川牡丹生長土壤的風(fēng)化進(jìn)程并不是控制根際土壤微生物群落的主要因素。但是，堿土金屬淋溶率(Cm∶F=4.7，p=0.036)和鋁鐵率(Af∶F=3.0，p=0.04)兩個解釋變量仍然可以很好地解釋細(xì)菌的多樣性。堿土金屬淋溶率與細(xì)菌多樣性指數(shù)(Shannon，Simpson和InvSimpson)呈正相關(guān)，與物種豐富度指數(shù)(ACE，Chao1)呈負(fù)相關(guān)，Af則正好相反。這表明隨著土壤Ca，Mg，F(xiàn)e相對積累程度加深，細(xì)菌多樣性增加而豐富度反而有降低的趨勢。所有指標(biāo)均無法解釋真菌的Alpha多樣性，表明四川牡丹根際真菌對土壤環(huán)境變化的響應(yīng)不如細(xì)菌敏感。

圖2 土壤風(fēng)化淋溶率與細(xì)菌多樣性冗余分析

堿土金屬淋溶率與細(xì)菌的擬桿菌門(Bacteroidetes)、Epsilonbacteraeota呈高度正相關(guān)，與硝化螺旋菌門(Nitrospirae)呈負(fù)相關(guān)，這三類細(xì)菌多具有與硝化相關(guān)的代謝途徑(見表5)。鋁鐵率與真菌的座囊菌綱(Dothideomycetes)相關(guān)性顯著，鋁化系數(shù)與盤菌綱(Pezizomycetes)和傘菌綱(Agaricomycetes)相關(guān)性顯著。上述菌類均是根際土壤中的優(yōu)勢菌種[16]。

表5 土壤風(fēng)化淋溶率與微生物相關(guān)性

3.4 網(wǎng)絡(luò)分析

網(wǎng)絡(luò)圖便于反映微生物之間、元素之間、微生物與元素之間直接或間接的相關(guān)關(guān)系。模塊1與微生物均無顯著相關(guān)性，這部分主要包括巖石元素，以及土壤的P，Mn和植物的P，Al，Mn(圖3)。說明P，Mn在巖石—土壤—四川牡丹種子的遷移體系中可能主要受控于母巖。微生物主要影響模塊2，3，其中包括土壤元素：K，Ca，Mg，Al，F(xiàn)e和種子元素：K，Na，Ca，Mg，F(xiàn)e，S。此外，土壤S、植物Cu以及巖石Cu，Mn，Mg，P，S的含量同樣與部分微生物的豐度顯著相關(guān)。巖石和土壤微生物可通過土壤的橋梁作用產(chǎn)生相互影響，而這一過程如何發(fā)生在網(wǎng)絡(luò)圖中并未體現(xiàn)。

對比可知，Epsilonbacteraeota將巖石的Mn元素連接進(jìn)入模塊2中，細(xì)菌類的疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、Latescibacteria和真菌類的糞殼菌綱(Sordariomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、古菌根菌綱(Archaeorhizomycetes)作為一個整體將土壤Ca和植物Mg連接到模塊2中，變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)將模塊3中的元素連接成為一個整體。上述微生物作為連接多種元素的節(jié)點(diǎn)，在營養(yǎng)反饋與調(diào)節(jié)上可能具有重要意義。微生物的加入使整個網(wǎng)絡(luò)趨于復(fù)雜，它們不僅為元素間的反應(yīng)提供了更多的途徑還改變了元素之間的關(guān)系。細(xì)菌和真菌之間沒有明顯的分區(qū)，表明其在元素循環(huán)中的主要功能相似。

4 討 論

(1) 四川牡丹的基質(zhì)條件。四川牡丹生長土壤以弱堿積鈣為主要特征。母巖鈣含量低，不足以形成高鈣土壤。其分布區(qū)少雨干燥的氣候特點(diǎn)(年干燥度約1.6～2.5)或為土壤鈣化提供條件[13]。除Ca在土壤中發(fā)生大量積聚外，K，Na，Mg相對于Al均發(fā)生輕微的富集。一方面，四川牡丹生長區(qū)受焚風(fēng)效應(yīng)影響，在高水分蒸發(fā)狀態(tài)下，鹽分可隨著土壤毛細(xì)管道上移并在表土層積聚，這一現(xiàn)象易發(fā)生在干旱、半干旱及半濕潤區(qū)[24]。另一方面，土壤中的鹽基組分可能存在外源輸入。四川牡丹生長區(qū)屬于青藏高原東南緣，構(gòu)造抬升導(dǎo)致山體破碎，河谷谷坡陡峭，水土流失嚴(yán)重，初期風(fēng)化產(chǎn)物在重力及流水作用下堆積于谷坡凹陷或坡度減緩處發(fā)育成壤是植被發(fā)展的基礎(chǔ)[25]，谷坡上部土體及巖體經(jīng)風(fēng)化淋失的元素同樣易在此匯集沉淀[26]，最終可在植被、氣候等作用下形成鹽基組分的富集。相比于一般的植物吸收順序，Cu較之Ca，Mg，Na位置較靠前，但4者含量均在正常范圍內(nèi)。

a 巖石—土壤—四川牡丹種子元素網(wǎng)絡(luò)圖 b 微生物與元素網(wǎng)絡(luò)圖

(2) 元素組合特點(diǎn)。P和S是表生系統(tǒng)中較為活躍的元素，兩者組合關(guān)系的變化可能與其賦存形式、元素遷移動力等因素有關(guān)。巖石中的S與Ca，K，Al，F(xiàn)e在同一組合內(nèi)且相關(guān)性顯著(圖3)，表明S可能主要以硫酸鹽、硫鐵化合物等形式存在于巖石中，而土壤中的S可能主要以Cu或Mn的硫化物形式存在(見圖1)。堿性土壤中的P多以Ca-P的形式存在[25]，但P與Mn的相關(guān)性說明土壤中可能有相當(dāng)一部分P以Mn-P形式存在[27]。四川牡丹生長土壤常以坡積物為成土母質(zhì)，土壤成熟度低，因此土壤元素組成得以保留其母巖的主要特征，其主要造巖元素組合關(guān)系未發(fā)生變化，這一特征在干旱、半干旱區(qū)等風(fēng)化程度弱的區(qū)域較為常見[28]。

(3) 土壤環(huán)境與微生物多樣性。一般而言，土壤微生物的多樣性和豐富度隨著土壤風(fēng)化程度的加深而趨于增加[29]。這一點(diǎn)并未在四川牡丹的根際土壤微生物中體現(xiàn)，其原因可能在于微生物群落中普遍存在的結(jié)構(gòu)冗余，即多個群落單元共同行使同一項功能的現(xiàn)象，使得微生物對環(huán)境變化有一定的承載能力，微小的環(huán)境變化與群落結(jié)構(gòu)間往往沒有確定關(guān)系[30]。但是，Ca，Mg，F(xiàn)e的相對積累程度仍然是控制細(xì)菌多樣性的主要因素之一。鈣鎂可通過改變微生物代謝活性及途徑影響微生物群落結(jié)構(gòu)。Rosenberg和Balland[31-32]通過控制試驗證明鈣鎂可直接影響土壤微生物的生物量、活性，以及改變微生物的礦物風(fēng)化能力。鐵對微生物來說是理想的電子傳遞載體，微生物與Fe的反應(yīng)控制著有機(jī)物礦化、反硝化等關(guān)鍵性土壤元素循環(huán)過程[33]。元素遷移對微生物的影響并非單向作用，如土壤中鈣鎂含量的變化可影響細(xì)菌從云母中提取鐵的能力[32]，進(jìn)而推動多種元素的遷移。

(4) 微生物與元素遷移。本文以網(wǎng)絡(luò)模塊為單元分析微生物在元素遷移體系中的作用，模塊2是整個網(wǎng)絡(luò)的核心，幾乎所有元素都與某類微生物或微生物群存在直接或間接的相關(guān)關(guān)系(見圖3)。其中Ca，Mg，F(xiàn)e，S是微生物鏈接進(jìn)入該網(wǎng)絡(luò)的主要節(jié)點(diǎn)，亦是微生物作用的主要對象。上述元素的相互作用間接影響著包括Mn，Al，K，Cu在內(nèi)的諸多元素的活動。所有關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的真菌均屬于子囊菌門，其中包括多種菌根和地衣，被認(rèn)為是陸地植被進(jìn)化的關(guān)鍵[34]。細(xì)菌中的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)廣泛寄生于巖石中，對巖石的風(fēng)化和土壤的初始形成有著重要作用[35]。其中以典型的鐵氧化細(xì)菌——變形菌門(Proteobacteria)的希瓦氏菌(Shewanella)的研究最為廣泛[2]。由于缺少諸如植物、流水、氣候、地形等關(guān)鍵性因子，微生物與元素是如何發(fā)生相互作用的我們并未得知。

5 結(jié) 論

(1) 四川牡丹生長土壤以弱堿富鈣為主要特征。元素遷移富集系數(shù)排序為：Ca>Na>S>P>Mg>K>Al>Fe>Mn>Cu；吸收系數(shù)排序為：P>S>K>Cu>Mg>Ca>Na>Mn>Fe>Al。

(2) 母巖元素組成特征在土壤中基本得以保留，P和S在成土過程中較為活躍。

(3) Ca，Mg，F(xiàn)e的相對淋溶或相對積累程度是四川牡丹根際土壤細(xì)菌多樣性的主要控制因素之一。

(4) P和Mn在巖石—土壤—四川牡丹種子中的遷移主要受巖石組分控制。細(xì)菌和真菌在元素遷移體系中的作用相似，主要參與Fe，S，Mg，K，Ca的相關(guān)反應(yīng)過程。參與其中的主要細(xì)菌菌門包括Epsilonbacteraeota，Verrucomicrobia，F(xiàn)irmicutes，Latescibacteria，Spirochaetes，Proteobacteria。主要真菌菌綱包括Sordariomycetes，Leotiomycetes，Pezizomycetes，Archaeorhizomycetes和Dothideomycetes。

(5) 在干旱、堿性條件下，土壤化學(xué)反應(yīng)相對較弱，多種礦物(元素)難以發(fā)生溶解，植物根系—微生物耦合風(fēng)化作用常是有效的應(yīng)對措施。這一過程十分復(fù)雜，過去常以模擬試驗的方式進(jìn)行研究，但這與自然狀態(tài)下的過程相卻甚遠(yuǎn)。本文直接測定四川牡丹生長土壤營養(yǎng)元素含量以及微生物組成，但這種方式難以揭示特定物種的作用。因此在門、綱水平進(jìn)行研究，并不強(qiáng)調(diào)微生物與元素、礦物間的對應(yīng)關(guān)系，而是試圖尋找參與元素循環(huán)過程的主要微生物類群以及微生物與之作用的主要元素，以期為使用礦物、礦物—微生物等手段改善四川牡丹及干旱河谷地帶性植被的基質(zhì)營養(yǎng)條件提供指導(dǎo)或參考。