TGF-β1 在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)及其抗凋亡作用

高然，陶永健，接傳紅

青光眼是目前嚴(yán)重?fù)p害視力健康及致盲的常見眼病，到2020 年，全球大約有0.8 億人受青光眼的影響[1]。而視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的凋亡是視功能損傷的主要機(jī)制，RGCs 樹突和線粒體的變性可能是青光眼的早期特征[2]，在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄之前，RGCs 已經(jīng)出現(xiàn)了改變[3-4]。目前認(rèn)為引發(fā)凋亡的因素主要有缺血、氧化損傷、多種營(yíng)養(yǎng)因子缺乏以及神經(jīng)毒性作用等[5]?？刂埔暽窠?jīng)損傷的重要途徑之一即是抑制RGCs 的凋亡[6]。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種廣泛存在于細(xì)胞和組織中的多肽生長(zhǎng)因子，在胚胎的形成，細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、增殖、修復(fù)、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等方面具有不可或缺的作用[7-10]。在神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中，TGF-β1 具有抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活和分化、軸突生長(zhǎng)等重要作用，是突觸重建中細(xì)胞支架蛋白的調(diào)節(jié)因子。此外TGF-β1 還與其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相互作用，促進(jìn)神經(jīng)元存活。在腦損傷性疾病中，TGF-β1 充當(dāng)神經(jīng)保護(hù)劑，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡。本文將重點(diǎn)探討在大鼠慢性高眼壓模型中，TGF-β1 在RGCs 的表達(dá)及抗凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常Wistar 雄性大鼠（購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK (京)2016-0011，SPF 級(jí)）54 只（108 只眼），平均體重200±18 g，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h 晝夜交替，溫度18℃～25℃,濕度40%。本組研究中的所有動(dòng)物飼養(yǎng)級(jí)處理均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 試劑及儀器

兔抗大鼠TGF-β1 多克隆抗體（北京博奧森生物公司）；人基因重組TGF-β1 （北京博奧森生物公司）；TRIzol-A+總RNA 提取試劑（日本，TAKARA 公司）；Realtime PCR 試劑盒（日本，TAKARA 公司）；引物(大連寶生物公司)；凋亡試劑盒及復(fù)合消化液（武漢博士德公司）；SP 免疫組化試劑盒（北京中杉生物公司）；DAB 顯色液（北京中杉生物公司）；微量注射器（德國(guó)，Eppendorf 公司）；顯微手術(shù)顯微鏡（德國(guó)，Leica 公司）；Tono-PenXL 筆式眼壓計(jì)（美國(guó)，Reichert公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)，Leica 公司）；光學(xué)顯微鏡及照相裝置（德國(guó)，Leica 公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf 公司）；Realtime PCR 擴(kuò)增儀 （美國(guó)，ABI 公司）。

1.3 分組和造模

分組： 用隨機(jī)數(shù)字表法將54 只健康Wistar 雄性大鼠分為3 組，正常組：正常眼壓大鼠6 只（12 只眼）；模型組：普通高眼壓大鼠24 只（48 只眼）；干預(yù)組：TGF-β1 抗體干預(yù)高眼壓大鼠24 只 （48 只眼）。后兩組根據(jù)觀察時(shí)間分為1 周、2 周、3 周和4 周組，各6 只（12 只眼）。

造模：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)記，稱重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g 腹腔注射，大鼠麻醉后，排除患有眼前節(jié)疾病，氧氟沙星眼藥水沖洗眼部，5-0 絲線做眼瞼牽引縫線拉開眼瞼。顯微鏡下，以穹隆為基底，距角膜緣外2 mm 處剪開球結(jié)膜，分離筋膜，暴露鞏膜的上方、顳側(cè)的鞏膜上靜脈，用熱凝器燒灼封閉鞏膜上靜脈。將浸有0.2 mg/ml 絲裂霉素的棉片置于鞏膜面約1 min，立即予10 ml 生理鹽水沖洗，再用10-0 絲線縫合，將球結(jié)膜復(fù)位，用復(fù)方妥布霉素地塞米松眼膏涂術(shù)眼以防止感染。TGF-β1 抗體干預(yù)高眼壓組，在造模開始前，用自制玻璃毛細(xì)管連接微量注射器，在上直肌和外直肌中間，自睫狀體平坦部向后方以45°角穿刺進(jìn)入玻璃體腔，注射TGF-β1 抗體50 ng，注射后，用燒灼器燒灼封閉穿刺口。眼壓用Tono-PenXL筆式眼壓計(jì)測(cè)量，測(cè)量3 次，取平均值。測(cè)量分別于造模術(shù)前、術(shù)后即刻和處死前進(jìn)行。

標(biāo)本制作：在預(yù)定時(shí)間，無菌條件下，摘除大鼠左眼，立即置于4%多聚甲醛中，固定2 h 后，沿角膜緣處去除角膜，剪掉晶狀體，再置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，備免疫組化和TUNEL 實(shí)驗(yàn)用；無菌條件下摘除大鼠右眼，自角膜緣處剪除角膜，去掉晶狀體，翻轉(zhuǎn)鞏膜，去除玻璃體，小心完整取出視網(wǎng)膜，置于EP 管中，-80℃下保存，備Realtime PCR 實(shí)驗(yàn)用。

1.4 免疫組化SP 法檢測(cè)TGF-β1 蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)中常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 洗滌3 min×3 次，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)，冷卻至室溫，PBS 洗滌3 min×3次，動(dòng)物血清封閉，一抗4℃過夜，PBS 洗滌3 min×3次，二抗?jié)窈蟹跤?0 min，抗生物素蛋白-過氧化酶10 min，DAB 顯色，檢測(cè)TGF-β1 蛋白的表達(dá)，TGF-β1 免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色、細(xì)顆粒狀，它主要表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。顯微鏡下隨機(jī)選擇10 個(gè)高倍視野，其中每個(gè)視野均計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率，分為4 個(gè)等級(jí)： 百分率≤5%為0 分，百分率6%～25%為1 分，百分率26%～50%為2 分，百分率＞50%為3 分。將細(xì)胞染色強(qiáng)度也分為4 個(gè)等級(jí)：其中無著色計(jì)為0 分，淡黃色計(jì)為1 分，棕黃色計(jì)為2 分，深棕色計(jì)為3 分。將陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相加后最后得出綜合評(píng)分。最后綜合評(píng)分≥4 分為陽性表達(dá)，<4 分為陰性表達(dá)。

1.5 RT-PCR 法檢測(cè)TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

大鼠RGCs 總RNA 的提取，采用Trizol 一步法，步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行，采用SYBR Green I 熒光染料嵌合法，以構(gòu)建的RNA 為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)大鼠RGCs 樣品中的TGF-β1 基因和β-actin 基因分別進(jìn)行定量，檢測(cè)各組大鼠RGCs 中TGF-β1mRNA 基因的相對(duì)表達(dá)量。如果TGF-β1mRNA 及β-actin 的融解曲線均為單峰，則說明PCR 的產(chǎn)物單一，證明其為特異性產(chǎn)物。

1.6 TUNEL 法檢測(cè)模型組、干預(yù)組RGCs 凋亡率

充分脫蠟、水化，0.01 M TBS 1:200 新鮮稀釋protease K 37℃消化15 min，加標(biāo)記緩沖液20 μl/片，于濕盒中37℃標(biāo)記2 h，加封閉液50 μl/片，室溫30 min，去掉封閉液，用抗體稀釋液1:100 稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50 μl/片加至標(biāo)本片上，37℃×30 min，用抗體稀釋液1:100 稀釋SABC：取l ml 抗體稀釋液加SABC 10μl，50μl/片加至切片上，37℃反應(yīng)30 min，TBS 洗滌，DAB 顯色20 min，水洗，鏡下掌握顯色程度，蘇木素輕度復(fù)染，0.01 M TBS 洗，蒸餾水洗，脫水，透明，封片。各切片分別測(cè)定5 個(gè)獨(dú)立高倍視野(×400)中的陽性細(xì)胞數(shù)，進(jìn)一步換算成標(biāo)記指數(shù)，即為(陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)測(cè)細(xì)胞核總數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，同時(shí)采用方差分析，t 檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。若P<0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RGCs 中TGF-β1 蛋白的表達(dá)

將TGF-β1 蛋白在各個(gè)觀察時(shí)間段的表達(dá)情況匯總分析得出,TGF-β1 在正常組RGCs 中陽性率33.33%，模型組75.00%，干預(yù)組4.17%；模型組與干預(yù)組，χ2=22.301,P=0.000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組與模型組，正常組與干預(yù)組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。TGF-β1 在模型組、干預(yù)組2 周、4 周時(shí)的表達(dá)見圖1。

表1 各組RGCs 中TGF-β1 蛋白的表達(dá)[眼只數(shù)（率）]

2.2 各組RGCs 中TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

圖1 模型組和干預(yù)組2 周、4 周時(shí)TGF-β1 蛋白的表達(dá)（×400）。1A TGF-β1 蛋白的陰性表達(dá)；1B 模型組2 周；1C 模型組4 周；1D 干預(yù)組2周；1E 干預(yù)組4 周。白箭頭指TGF-β1 蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞

TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量在模型組最高（6.33±4.81），其次是正常組（1.19±0.09），最后是干預(yù)組（0.20±0.17）。正常組與模型組比較，t=2.583,P=0.027；模型組與干預(yù)組比較，t=3.119,P=0.011；正常組與干預(yù)組，t=13.667,P=0.000，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 RGCs 凋亡率

模型組RGCs 凋亡率,隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，明顯增加，4 周時(shí)達(dá)到（76.18±5.25）%，各時(shí)間點(diǎn)前后比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組同樣具有隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率增加的趨勢(shì)，4 周時(shí)達(dá)到 （82.37±2.18）%，各時(shí)間點(diǎn)前后比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

兩組間凋亡率比較，同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 2 組各時(shí)間段RGCs 凋亡率比較（，n=6）

表2 2 組各時(shí)間段RGCs 凋亡率比較（，n=6）

注：* 與同組其他時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05；# 與同組1 周、2 周比較，P＜0.05；& 與同組1 周比較，P＜0.05

3 討論

TGF-β1 分布廣泛，在體內(nèi)所有細(xì)胞幾乎均可生成，包括結(jié)締組織細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞等。而在正常視網(wǎng)膜組織中，TGF-β1 主要表達(dá)于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜附近，神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)顆粒層也可見較弱表達(dá)。

青光眼患者視功能的損害是RGCs 凋亡的結(jié)果。引起RGCs 凋亡的一個(gè)重要原因是多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，因此，提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，成為阻止RGCs 凋亡的一個(gè)重要途徑。研究表明，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子增多的干預(yù)下，RGCs 凋亡的明顯減少[11-12]。而且，TGF-β1 是一種非常強(qiáng)的多功能性細(xì)胞因子，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和免疫功能，這種特性在受損傷后會(huì)增強(qiáng)[13]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)并不能促進(jìn)高度純化的神經(jīng)元存活，只有增加了TGF-β1 后，GDNF 的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性才起作用，而且，體內(nèi)用TGF-β1 的抗體封閉，可以充分阻斷GDNF對(duì)軸突切斷后的神經(jīng)元的保護(hù)作用。Dhandapani等[14]也在體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)TGF-β1 可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡；盛蕾等[15]應(yīng)用大鼠MCAO 模型再灌注損傷后，體外給予TGF-β1 干預(yù)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少。目前，已知此保護(hù)作用的途徑包括降低Ca2+濃度，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣及增加Bcl-2 相關(guān)死亡因子Bad 磷酸化，減少Bad 蛋白表達(dá)[16]。近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1 抑制RGCs 的機(jī)制與caspase-3 的生物活性有關(guān)，它可通過下調(diào)caspase-3 的表達(dá)活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1 在正常眼壓組RGCs 中有少量表達(dá)，在普通高眼壓組，眼壓升高時(shí)，引起內(nèi)源性TGF-β1 表達(dá)升高，在前2 周時(shí)，表達(dá)增強(qiáng)尤為顯著，作為一個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗凋亡因子，這是機(jī)體抵御RGCs 凋亡的自我保護(hù)機(jī)制。但是隨著高眼壓持續(xù)的時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1 的表達(dá)也逐漸減弱，RGCs 凋亡也越來越重。

在TGF-β1 抗體干預(yù)高眼壓組，采用TGF-β1 抗體干預(yù)，使TGF-β1 表達(dá)受到抑制，此時(shí)RGCs 凋亡的更加嚴(yán)重，視網(wǎng)膜組織的病理結(jié)構(gòu)也顯示RGCs層顯著變薄。在缺乏了TGF-β1 表達(dá)的高眼壓組，失去了TGF-β1 的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和抗凋亡作用，RGCs 凋亡的明顯加重。

RGCs 的凋亡在2 周時(shí)，RGCs 的數(shù)目逐漸減少，節(jié)細(xì)胞層的組織變得疏松，核周間隙增寬。內(nèi)核層可見少部分細(xì)胞固縮，染色加深，少量空泡形成。4周時(shí)，內(nèi)層視網(wǎng)膜組織明顯變薄萎縮，而RGCs 大部分消失，殘留少量固縮核，形狀不規(guī)則。

本實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1 可能作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者抗凋亡因子可以阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，TGF-β1 在正常眼壓組RGCs 中有少量表達(dá)。在高眼壓早期，可以引起內(nèi)源性TGF-β1 表達(dá)升高，實(shí)現(xiàn)機(jī)體抵御RGCs 凋亡的自我保護(hù)機(jī)制。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種保護(hù)機(jī)制逐漸減弱，RGCs 凋亡越來越嚴(yán)重。缺少了TGF-β1 的表達(dá)，在眼壓增高的同時(shí)，RGCs 凋亡的數(shù)量也增多，表明TGF-β1 可能作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者抗凋亡因子，可以進(jìn)一步阻止RGCs 的凋亡。