天麻素對高糖條件下RF/6A 細胞SIRT1/TLR4 信號通路及細胞增殖與凋亡的影響

楊永利，薛崢，林芳，楊玉潔

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是主要的糖尿病微血管并發(fā)癥，可引起視力障礙和失明[1]。研究[2]表明，炎性過程參與DR 的發(fā)生與發(fā)展，而炎癥作用的靶細胞為人視網膜血管內皮細胞（human retinal endothelial cells，HRECs），炎癥與微血管病變導致HRECs 功能障礙。此外，除無菌炎癥外，高糖誘導的視網膜氧化應激反應在DR 的發(fā)病機理中也起著關鍵作用[3]。天麻素是中草藥天麻的主要活性成分，可在多種疾病中發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用[4]。最近的一項研究[5]表明，天麻素能刺激M2 巨噬細胞極化，并從氧化應激誘導的細胞凋亡和死亡中拯救巨噬細胞。沉默信號調控因子（SIRT1）可以去除賴氨酸殘基，發(fā)揮調節(jié)糖脂代謝、調節(jié)新陳代謝的作用。近年來，SIRT1 在腎臟疾病中的作用越來越明顯，受到人們的關注[6]。SIRT1 能夠減少腎細胞凋亡，減緩腎功能衰退，抑制腎間質纖維化等，在糖尿病腎損傷患者體內發(fā)揮著巨大作用[7]。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR） 與DR 形成的過程密切相關。TLR4可以由巨噬細胞等細胞表達，進而參與DR 的發(fā)展[8]。因此，本研究通過CCK-8 法、TUNEL 法、細胞劃痕法、Western blot 法、qRT-PCR 法等方法分析檢測各組視網膜血管內皮細胞增殖情況、遷移能力、凋亡情況，SIRT1/TLR4 的蛋白含量及其mRNA 的表達含量的差異性，來探究天麻素對高糖誘導的恒河猴脈絡膜-視網膜內皮細胞（rhesus choroido-retinal endothelial cell，RF/6A）生物學行為的影響及對SIRT1/TLR4 表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RF/6A 細胞購自于ATCC 細胞庫。

1.2 試劑與儀器

10%胎牛血清 （美國賽默飛世爾科技公司）；CCK-8 試劑盒（大連美侖生物公司）；恒溫搖床（TS-200B，成都蘇凈器材公司）；DMEM 培育液（上海語純生物科技公司）；胰蛋白酶（深圳樂芙生物科技公司）；天麻素（武漢遠啟醫(yī)藥化工公司）；PBS 緩沖液（廣州濟恒醫(yī)藥科技公司）；PVDF 膜（山東捷林環(huán)保科技公司）；TBST 緩沖液（南京億迅生物科技有限公司）；氯仿（上海易恩化學技術有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（濟南歐萊博電子商務公司）；移液槍頭（濟南千司生物技術公司）；異丙醇（山東檉碩化工有限公司）；乙醇（天帆醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將RF/6A 細胞株在含有10%胎牛血清的DMEM 培育液中培養(yǎng)。放置在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，1～2 d 更換1 次培養(yǎng)基，2～3 d 傳代1 次。當細胞貼壁生長數(shù)量達到80%～90%時，20%胰蛋白酶消化RF/6A 細胞，消化后，1600 r/min離心，時間為5 min，以每孔105 個細胞密度接種于6孔板中，每孔加3 ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后更換為含2%PBS 緩沖液的完全培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)細胞。

1.3.2 細胞分組及處理將細胞隨機分為5 組。正常對照組（NC 組）：正常培養(yǎng)RF/6A 細胞，不做任何處理；高糖對照組（HG 組）：將RF/6A 細胞在高糖環(huán)境（葡萄糖濃度為25 mmol/L）下誘導、培養(yǎng)；低濃度組（LC 組）：在高糖環(huán)境下培養(yǎng)RF/6A 細胞，并用5 μmol/L 天麻素預處理；中濃度組（MC 組）：在高糖環(huán)境下培養(yǎng)RF/6A 細胞，并用10 μmol/L 天麻素預處理；高濃度組（HC 組）：在高糖環(huán)境下培養(yǎng)RF/6A細胞，并用20 μmol/L 天麻素預處理。

1.4 CCK-8 法檢測RF/6A 細胞增殖情況

取出視網膜血管內皮細胞，稀釋為1×105/ml，培養(yǎng)12 h；取培養(yǎng)好的視網膜血管內皮細胞平鋪到16孔板中再培養(yǎng)；每組設3 個復孔，培養(yǎng)到一定數(shù)量后，加入10 μl CCK-8 試劑，常溫放置30 min，利用讀板器檢測450 nm 光密度（optical density，OD)值，實驗重復3 次。

1.5 TUNEL 法檢測RF/6A 細胞凋亡情況

將潔凈并處理后的蓋玻片置于6 孔板內，每組設3 個復孔，種入視網膜血管內皮細胞培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁生長數(shù)量達70%～80%。隨后嚴格按照廠家說明書進行TUNEL 染色。封固涂片樣本，標記反應，觀察視野，于顯微鏡下觀察染色結果并拍照，實驗重復3 次。

1.6 細胞劃痕法測定RF/6A 細胞的遷移能力

將視網膜血管內皮細胞按照每孔5×105個接種于6 孔板中進行培養(yǎng)，每組設3 個復孔，當細胞均勻鋪滿底部后，用100 μl 的移液槍頭垂直于定位線劃痕。PBS 緩沖液漂洗3 次，后加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。用倒置顯微鏡拍照記錄，記為0 h；將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后再進行拍照，2 個時間點進行比較，實驗重復3 次。

1.7 Western blot 法檢測RF/6A 細胞中TLR4/SIRT1蛋白含量

0.25 %胰蛋白酶消化視網膜血管內皮細胞，離心棄上清，加細胞裂解液，4℃、14000 rpm 離心30 min，取上清液。隨后95℃熱浴10 min，對蛋白進行變性。-80℃儲存?zhèn)溆?。定量，電泳，轉膜。轉膜完畢后，將PVDF 膜浸入含有5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液，緩慢搖床1 h，封閉。后用5%脫脂奶粉稀釋抗體，孵育一抗。后用TBST 緩沖液漂洗3 次，每次10 min。室溫下孵育二抗2 h，TBST 緩沖液漂洗2 遍，每次10 min。在暗室進行曝光，GAPDH 做內參，使用Image-Pro Plus v6 軟件檢測蛋白表達。

1.8 qRT-PCR 法檢測RF/6A 細胞中SIRT1/TLR4 mRNA 表達量

在視網膜血管內皮細胞株培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，4℃1200 r/min 離心，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存?？俁NA 提取反轉錄成cDNA，按照說明書進行實驗，內參采用GAPDH，60°C，10 min；95℃、72°C 各30 s；95℃，5 min。循環(huán)次數(shù)以40 為準，實驗次數(shù)2次，用相對定量2-ΔΔCT 計算SIRT1/TLR4 mRNA表達。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t 或bonferonni 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 視網膜血管內皮細胞培養(yǎng)形態(tài)

RF/6A 細胞在細胞鏡下呈卵圓形狀，生長良好（圖1）。

圖1 顯微鏡下RF/6A 細胞形態(tài)圖。1A 低倍鏡下（×100）；1B 高倍鏡下（×200）

2.2 對細胞增殖的影響

與NC 組比較，HG 組細胞OD 值降低（t=5.394，P=0.000）；與HG 組比較，LC 組、MC 組、HC 組細胞OD 值增高（tLC=4.638，tMC=4.938，tHC=8.389，均P=0.000）；與LC 組比較，HC 組細胞OD 值增高（t=4.875，P=0.000）；與MC 組比較，HC 組細胞OD 值增高（t=3.445，P=0.003），差異均有統(tǒng)計學意義。而LC 組與MC 組細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 對細胞凋亡的影響

與NC 組比較，HG 組細胞凋亡數(shù)量升高（t=12.690，P=0.000）；與HG 組比較，LC 組、MC 組、HC 組細胞凋亡數(shù)量降低（tLC=4.713，tMC=7.588，tHC=10.050，均P=0.000）；與LC 組比較，MC 組、HC 組細胞凋亡數(shù)量降低（tMC=3.436，P=0.003；tHC=6.734，P=0.000）；與MC 組比較，HC 組細胞凋亡數(shù)量降低（t=3.822，P=0.002），差異均有統(tǒng)計學意義（表2、圖2）。

2.4 對細胞遷移能力的影響

與NC 組比較，HG 組細胞遷移數(shù)量降低（t=23.100，P=0.000）；與HG 組比較，LC 組、MC 組、HC 組細胞遷移數(shù)量升高（tLC=5.040，tMC=11.280，tHC=15.550，均P=0.000）；與LC 組比較，MC 組、HC 組細胞遷移數(shù)量升高（tMC=6.572，tHC=11.730，P=0.000）；與MC 組比較，HC 組細胞遷移數(shù)量升高（t=6.021，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義（表2、圖3）。

表2 各組細胞OD 值、凋亡率、遷移面積比較（，n=9）

表2 各組細胞OD 值、凋亡率、遷移面積比較（，n=9）

注：a 與NC 組比較，P＜0.05；b 與HG 組比較，P＜0.05；c 與LC組比較，P＜0.05，d 與MC 組比較，P＜0.05

2.5 對細胞SIRT1/TLR4 蛋白含量的影響

SIRT1 蛋白含量： 與NC 組比較，HG 組細胞含量降低 （t=6.606，P=0.000）；與HG 組比較，LC 組、MC 組、HC 組細胞含量增高（tLC=2.195，P=0.043；tMC=3.808，P=0.002；tHC=5.556，P=0.000）；與LC 組比較，MC 組、HC 組細胞含量增高（tMC=2.160，P=0.046；tHC=4.189，P=0.000）；與MC 組比較，HC 組細胞含量增高（t=2.150，P=0.047），差異均有統(tǒng)計學意義（表3、圖4）。

TLR4 蛋白含量：與NC 組比較，HG 組細胞含量升高（t=6.746，P=0.000）；與HG 組比較，LC 組、MC 組、HC 組細胞含量降低（tLC=2.141，P=0.048；tMC=4.427，P=0.000；tHC=5.321，P=0.000）；與LC 組比較，MC 組、HC 組細胞含量降低（tMC=2.212，P=0.042；tHC=2.961，P=0.009），差異均有統(tǒng)計學意義。MC 組與HC 組細胞TLR4 蛋白含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3、圖4）。

2.6 對細胞SIRT1/TLR4 mRNA 表達量的影響

各組細胞SIRT1/TLR4 mRNA 表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

圖2 TUNEL 法檢測各組視網膜血管內皮細胞凋亡情況。2A 正常對照組；2B 高糖對照組；2C 低濃度組；2D 中濃度組；2E 高濃度組。凋亡細胞（黑色箭頭）

圖3 視網膜血管內皮細胞遷移情況。3A 0 h 正常對照組；3B 24 h正常對照組；3C 0 h 高糖對照組；3D 24 h 高糖對照組；3E 0 h 低濃度組；3F 24 h 低濃度組；3G 0 h 中濃度組；3H 24 h中濃度組；3I 0 h 高濃度組；3J 24 h 高濃度組

表3 各組細胞SIRT1/TLR4 蛋白含量及mRNA 表達量比較（，n=9）

表3 各組細胞SIRT1/TLR4 蛋白含量及mRNA 表達量比較（，n=9）

注：a 與NC 組比較，P＜0.05；b 與HG 組比較，P＜0.05；c 與LC組比較，P＜0.05；d 與MC 組比較，P＜0.05。SIRT1 沉默信號調控因子；TLR4 Toll 樣受體4

圖4 各組細胞中SIRT1/TLR4 的蛋白含量。NC 組 正常對照組；HG組 高糖對照組；LC 組 低濃度組；MC 組 中濃度組；HC 組 高濃度組。SIRT1 沉默信號調控因子；TLR4 Toll 樣受體4

3 討論

DR 是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，也是患者失明的主要誘發(fā)原因之一。大量證據(jù)表明，抑制HRECs 增殖可能具有預防DR 進展的作用。天麻素是名貴中藥材天麻的主要活性成份，具有許多藥理學作用，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，天麻素不僅對眩暈、全身癱瘓、癲癇和破傷風有效，還對高糖誘導的HRECs 細胞增殖、遷移等細胞生物活性存在一定作用。

研究[11]表明，高糖條件下，眼部血管細胞的生長逐漸變慢，加速了視網膜血管內皮細胞的凋亡，且細胞凋亡與高糖混合的時間有一定相關性，混合時間越長，凋亡越顯著。與本研究結果一致：正常組細胞的增殖數(shù)量最多，凋亡率最低；高糖組增殖數(shù)量最少，凋亡率最高。亦有實驗結果[12]顯示，高糖條件下，炎癥反應在DR 患者體內發(fā)揮效應顯著，其原理可能與高糖促進患者體內炎性因子的表達，加速視網膜血管內皮新生細胞的凋亡，抑制其增殖、遷移能力有關。天麻素具有明顯的神經營養(yǎng)活性，研究[13]發(fā)現(xiàn)，其對糖尿病早期給光/撤光中心視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGC）具有保護作用，能抑制高血糖介導的小膠質細胞炎性因子的表達，對神經保護作用主要歸功于它的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性[14]。通過本實驗可猜測，天麻素能夠對視網膜血管內皮細胞的生物活性產生一定的影響，進而應用于相關臨床疾病的治療中。

TLR4 信號通路參與了多種免疫相關性疾病，能夠誘導TNF-α 和白細胞介素-1 （Interleukin-1，IL-1）的表達，促進炎癥反應[15]。研究[16]表明，在糖尿病大鼠的視網膜和高糖培養(yǎng)的HRECs 中檢測到TLR4 表達水平上調，且TLR4 具有調節(jié)內皮細胞活性的作用。高葡萄糖作用下，視網膜神經節(jié)細胞中的TLR4 信號通路被激活，進而促進視網膜血管內皮細胞凋亡。近期亦有研究[17]發(fā)現(xiàn)，SIRT1 可能是高糖誘導的HRECs 中TLR4 途徑的調節(jié)劑，SIRT1 表達的升高可顯著抑制經多糖處理的視網膜血管內皮細胞中TLR4 蛋白的表達。本研究結果顯示，低濃度天麻素組細胞的SIRT1 蛋白含量低于高濃度組，而TLR4 蛋白含量與之相反。動物實驗[18]發(fā)現(xiàn)，天麻素作用于患病大鼠時，大鼠體內TLR4 信號通路的表達水平隨之下降，SIRT1 與之相反，同時抑制視網膜血管內皮新生細胞的生物學行為。表明SIRT1 信號通路能夠調控細胞內活性氧 （reactive oxygen species，ROS）水平，保護細胞免受氧化應激損傷。過氧化物酶體增殖物激活受體r-輔激活因子1α，是新發(fā)現(xiàn)的在抗氧化應激系統(tǒng)中起關鍵作用的轉錄調節(jié)因子，其能夠誘導細胞抗氧化酶的表達，提高組織抗氧化能力。天麻素能夠抑制視網膜血管內皮細胞凋亡，其機制可能與SIRT1/TLR4 的表達水平有關，為DR 的診斷和治療提供新方向[19-20]。本實驗的研究結果與上述結論均相同。

本實驗在研究的過程中有一定的不足，由于成本等問題，未對細胞內所有因子進行檢測，不能排除其他因子對實驗的影響；由于時間不足等問題，未對RF/6A 細胞增殖、遷移等生物活性采用多種方法進行檢測，可能產生的結果有一定偏差。在今后的研究中應加入更多的實驗方法對DR 的治療提供更有利的實驗依據(jù)。

綜上所述，高糖條件下可誘導RF/6A 細胞凋亡，天麻素能夠抑制高糖誘導的RF/6A 細胞凋亡，其機制可能與上調SIRT1 表達、抑制TLR4 信號通路等有關。