峨眉巖白菜總?cè)萍兓盎钚苑治?/h1>
2020-10-14 06:35:50羅思源馮士令周莉君丁春邦
關(guān)鍵詞：能力
羅思源，曾 辰，馮士令，陳 濤，周莉君，丁春邦
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安，625000)
峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)巖白菜屬(Bergenia)，為我國(guó)特有多年生草本植物，分布于四川西南地區(qū)[1-2].巖白菜屬植物中主要的活性成分為巖白菜素，是治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥物[3].但目前大多研究主要集中在巖白菜素的提取、修飾及其活性，忽略了其他活性成分的相關(guān)研究[4-5].有研究指出巖白菜中還含有三萜、黃酮、多糖等活性成分[6-7].陳蕉等發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜多糖和黃酮提取物均具有一定的抗氧化活性[6]，但關(guān)于三萜化合物的提取和活性研究報(bào)道較少.
從植物中提取出的三萜化合物已被證實(shí)具有抑菌、抗癌、保肝、降糖等多種活性[8-11]，但不同植物中三萜的含量不同.馬比木根中總?cè)坪繛?45 mg·g-1(干重)，莖中總?cè)坪繛?25.17 mg·g-1[12](干重)；女貞葉中總?cè)坪績(jī)H為5.11 mg·g-1[13](干重).目前研究?jī)H對(duì)巖白菜中三萜化合物進(jìn)行了定性分析，并沒(méi)有進(jìn)行定量分析[7].三萜純化是三萜類化合物分離、鑒定和應(yīng)用的一個(gè)重要步驟.樊梓鸞等用大孔樹(shù)脂純化紅豆越橘總?cè)?，其純度由原?lái)的5.13%提高到29.46%[14]；Luo等采用吸附色譜的方法從靈芝中分離純化得到不同三萜單體[15].但關(guān)于峨眉巖白菜總?cè)频募兓芯枯^少.
峨眉巖白菜目前屬于野生資源，還沒(méi)有被充分開(kāi)發(fā)利用.因此本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)特有物種峨眉巖白菜為研究對(duì)象，對(duì)其根中的總?cè)七M(jìn)行分離純化，并比較純化前后體外抗氧化、抑菌和抑癌活性，為峨眉巖白菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論和技術(shù)支撐.
1材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 供試材料采自四川峨眉山海拔1 300～1 500 m地區(qū)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)胡超副教授鑒定為峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu).將根用超純水清洗3遍，50 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，干粉-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?
1.1.2儀器與試劑 Scientz-10N臺(tái)式冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BT-124S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；RM-220實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器)；AIR TECH超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安康公司制造)；Spectra Max M2酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司).
2，2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸(Vc)、乙醇、冰乙酸、高氯酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鐵、鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、香草醛、二甲亞砜購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；氨芐青霉素鈉和瓊脂粉購(gòu)自北京索萊寶公司；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、消化酶、青霉素-鏈霉素(雙抗)和PBS購(gòu)自Hyclone公司；CCK-8試劑購(gòu)自武漢博士德生物公司；FBS購(gòu)自杭州四季青生物有限公司.
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1三萜提取 3 L 80 %乙醇與100 g巖白菜根粉末充分混勻，45 ℃下210 W超聲提取40 min.將提取液抽濾所得濾液蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥4 d得粉末狀提取物.
1.2.2總?cè)坪繙y(cè)定 采用香草醛-高氯酸法測(cè)定總?cè)坪縖16].取50 μL樣液加入100 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液(m/V)和200 μL高氯酸，60 ℃水浴15 min后加入冰乙酸定容至1 mL，混勻靜置5 min，于550 nm處測(cè)定吸光值.標(biāo)準(zhǔn)曲線采用熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品制作，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)坪?
1.2.3沉淀分級(jí)溶解法純化 第一次提取液冷凍干燥4 d得粉末狀提取物為第一次凍干提取物.取凍干后的提取物用500 mL無(wú)水乙醇50 ℃超聲溶解，抽濾3次，濾液蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥4天得第二次凍干提取物，稱量并測(cè)定提取物中總?cè)坪?重復(fù)以上步驟3次，分別得到第1次、第2次、第3次、第4次凍干提取物.
1.2.4體外抗氧化活性測(cè)定
1) DPPH清除能力測(cè)定.將第一次和第四次凍干提取物用80 %乙醇溶解成相應(yīng)濃度.根據(jù)Marsden的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力[17].30 μL樣液與170 μL DPPH乙醇溶液(0.8 mM)混勻，黑暗處放置15 min.于517 nm處測(cè)定吸光值.DPPH自由基清除率根據(jù)以下公式計(jì)算：
其中，A1為樣品處理組吸光值，A0為乙醇代替樣品空白組吸光值.
2) 總還原能力測(cè)定.將第1次和第4次凍干提取物用80%乙醇溶解成相應(yīng)濃度.根據(jù)Liyana等的方法測(cè)定總還原能力[18].0.5 mL樣液與0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液(m/V)和0.5 mL PBS(0.2 mol·L-1)混勻，50 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 10 %三氯乙酸溶液(m/V)，冷卻5 min.取上清液0.5 mL加入0.1 mL 0.1 %三氯化鐵溶液(m/V)和0.5 mL蒸餾水，混勻后在700 nm處測(cè)定吸光值.吸光值越大表示總還原能力越強(qiáng).
1.2.5抑菌活性測(cè)定
1) 菌種準(zhǔn)備.枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)系保種.取菌種加入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下200 r·min-1搖菌24 h.接種環(huán)蘸取菌懸液在LB固體培養(yǎng)基上劃線.放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r·min-1搖菌24 h獲得活化菌懸液.
2) 抑菌圈測(cè)定.采用牛津杯法測(cè)定抑菌圈[19].將第一次和第四次凍干提取物用DMSO溶解成相應(yīng)濃度，DMSO最終含量低于0.05%.根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定活化菌懸液菌濃度，并調(diào)整為1×107CFU·mL-1.取0.5 mL菌液均勻鋪滿培養(yǎng)基表面，待液體吹干后放置滅菌過(guò)的牛津杯，在牛津杯中加入200 μL不同濃度的藥物.100 μg·mL-1氨芐青霉素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，0.05% DMSO溶液作為空白對(duì)照.將培養(yǎng)基放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測(cè)定抑菌圈大小.
1.2.6抑癌活性測(cè)定 Hela和A549細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系惠贈(zèng).Hela細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%FBS和0.1%雙抗)，A549細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%FBS和0.1%雙抗)在含5%二氧化碳37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次.待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化細(xì)胞并用PBS緩沖液沖洗兩次，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL-1，取90 μL細(xì)胞懸浮液到96孔板中，邊緣用100 μL PBS填充.培養(yǎng)12 h后加入10 μL不同濃度的藥物.培養(yǎng)24和48 h后用100 μL新鮮培養(yǎng)基代替舊培養(yǎng)基，并加入10 μLCCK-8培養(yǎng)30 min，在450 nm處測(cè)定吸光值.細(xì)胞抑制率根據(jù)以下公式計(jì)算：
其中，A1為加入藥物組的吸光值，A0為空白組的吸光值.
1.3數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±相對(duì)誤差(mean±SD)表示.采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2結(jié)果與分析
2.1沉淀分級(jí)溶解法提高三萜純度
從圖1中可以看出提取物中總?cè)坪枯^高，說(shuō)明峨眉巖白菜中富含三萜類化合物.從表1中可以看出，第1次凍干的樣品提取率為38.13%，提取物中總?cè)坪繛?8.58%(圖1).經(jīng)4次凍干后，樣品提取率有所下降，為26.79%，而提取物中總?cè)坪匡@著提高，為70.99%.說(shuō)明在沉淀分級(jí)溶解過(guò)程中，提取率下降表示不溶于醇的雜質(zhì)被過(guò)濾掉，顯著提高峨眉巖白菜提取物中總?cè)坪?凍干3次和4次的樣品提取率無(wú)顯著差異，提取物中總?cè)坪恳矡o(wú)顯著變化.因此，可以用沉淀分級(jí)溶解的方法對(duì)峨眉巖白菜總?cè)七M(jìn)行純化.
2.2純化前后體外抗氧化活性比較
從圖2A中可以看出純化前即第1次凍干總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基最大清除率為90.91%，IC50為0.32 mg·mL-1.純化后即第4次凍干總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基的最大清除率為94.45%，IC50為0.27 mg·mL-1.IC50越小代表抗氧化能力越強(qiáng)，純化后，能降低總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基的IC50，由此可見(jiàn)經(jīng)純化后峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)DPPH自由基的清除率顯著提高.從圖2(b)中可以看出，在0.2到1.0 mg·mL-1之間，純化后總?cè)频目傔€原能力高于純化前.蔡天嬌等人發(fā)現(xiàn)紅棗三萜酸經(jīng)純化后，對(duì)ABTS自由基清除能力增強(qiáng)，IC50由1.18 mg·mL-1變?yōu)?.73 mg·mL-1[21].本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频捏w外抗氧化能力提高，說(shuō)明有效成分經(jīng)沉淀分級(jí)溶解純化后達(dá)到了富集的效果.
圖1 多次凍干后總?cè)坪孔兓疐ig.1 The content of triterpenes in extract after repeatedly freeze-dried times
表1 不同次數(shù)凍干后樣品提取率
圖2 純化前后體外抗氧化活性比較Fig.2 The comparison of antioxidant abilities before and after purification
2.3純化前后抑菌活性比較
植物三萜提取物被證實(shí)具有一定的抑菌能力，例如金銀花總?cè)茖?duì)7種常見(jiàn)致病菌均有較強(qiáng)的抑制能力，而關(guān)于峨眉巖白菜總?cè)埔志钚匝芯繄?bào)道較少[7].從表2中可以看出純化前后的峨眉巖白菜總?cè)苹衔飳?duì)枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌均有一定的抑制能力(抑菌圈均大于8 mm).抑菌圈為10～14 mm時(shí)，表明藥物對(duì)致病菌為輕度敏感；抑菌圈為15～20 mm時(shí)，藥物對(duì)致病菌為中度敏感.純化前峨眉巖白菜總?cè)圃?～8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌均具有輕度敏感(抑菌圈均在10～14 mm內(nèi)).純化后在4 mg·mL-1濃度下峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)兩種菌為輕度敏感，8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌為中度敏感(抑菌圈均在15～20 mm內(nèi)).說(shuō)明經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频囊志钚缘玫教岣?
表2 純化前后抑菌活性比較Tab.2 The comparison of antimicrobial abilities before and after purification
2.4純化前后對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力比較
多種植物三萜提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑癌活性.靈芝三萜和金絲小棗三萜對(duì)前列腺癌細(xì)胞均具有較好的抑制能力[22-23].劉素君等人發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞和小鼠腹水瘤細(xì)胞有較好的抑制能力[24].從圖3(a)中可以看出，純化前峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞具有較好的抑制能力，24 h和48 h的IC50分別為102.5和69.00 μg·mL-1.從圖3(b)中可以看出純化后三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力顯著提高，24 h和48 h的IC50分別為59.01和28.56 μg·mL-1.說(shuō)明經(jīng)過(guò)重結(jié)晶純化后，能顯著提高峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)Hela細(xì)胞的抑制能力.
圖3 純化前后抑癌活性比較Fig.3 The comparison of anticancer ability before and after purification
2.5純化前后對(duì)A549細(xì)胞的抑制能力比較
從圖4中可以看出峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞具有一定的抑制能力.未純化前隨著三萜提取物濃度升高，抑制率也逐漸上升，48 h最高抑制率達(dá)到55.80 %，24和48 h的IC50分別為238.90 μg·mL-1和172.00 μg·mL-1(圖4(a)).從圖4(b)中可以看出，純化后的三萜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制能力提高，當(dāng)濃度高于200 μg·mL-1時(shí)，抑制率趨于平穩(wěn)，48 h最高抑制率為66.21 μg·mL-1，24和48 h的IC50分別為84.32 μg·mL-1和65.99 μg·mL-1.經(jīng)純化后，能顯著降低對(duì)A549的IC50，說(shuō)明經(jīng)過(guò)重結(jié)晶純化后，能顯著提高峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)A549細(xì)胞的抑制能力.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜總?cè)凭哂休^強(qiáng)的抑癌活性，因此表明峨眉巖白菜提取物中抑癌活性成分可能為總?cè)?
圖4 純化前后抑癌活性比較Fig.4 The comparison of anticancer ability before and after purification
3結(jié)論
峨眉巖白菜中含有較豐富的總?cè)?經(jīng)沉底分級(jí)溶解純化后，樣品提取率從38.13%降低到26.79%，提取物中總?cè)坪繌?8.58%升高到70.99%，說(shuō)明沉底分級(jí)溶解法能有效提高峨眉巖白菜中總?cè)坪?經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频目傔€原能力增強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的IC50由0.32 mg·mL-1降低到0.27 mg·mL-1.抑菌結(jié)果表明峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)銅綠假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制能力，在4～8 mg·mL-1濃度下，對(duì)兩種菌為輕度敏感.經(jīng)純化后，在8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌為中度敏感.并且總?cè)铺崛∥锬苡行б种艸ela細(xì)胞增殖，純化前處理24 h和48 h后的IC50分別為102.5 μg·mL-1和69.00 μg·mL-1.純化后IC50降小為59.01 μg·mL-1和28.56 μg·mL-1.對(duì)A549肺癌細(xì)胞有一定的抑制能力，純化后能顯著降低IC50為84.32 μg·mL-1和65.99 μg·mL-1.說(shuō)明經(jīng)純化后，能提高峨眉巖白菜總?cè)频囊职┗钚?因此沉淀分級(jí)溶解法可適用于峨眉巖白菜總?cè)频募兓?，純化后的總?cè)?體外抗氧化、抑菌活性和抑癌活性均有一定程度的提高.
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峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)巖白菜屬(Bergenia)，為我國(guó)特有多年生草本植物，分布于四川西南地區(qū)[1-2].巖白菜屬植物中主要的活性成分為巖白菜素，是治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥物[3].但目前大多研究主要集中在巖白菜素的提取、修飾及其活性，忽略了其他活性成分的相關(guān)研究[4-5].有研究指出巖白菜中還含有三萜、黃酮、多糖等活性成分[6-7].陳蕉等發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜多糖和黃酮提取物均具有一定的抗氧化活性[6]，但關(guān)于三萜化合物的提取和活性研究報(bào)道較少.
從植物中提取出的三萜化合物已被證實(shí)具有抑菌、抗癌、保肝、降糖等多種活性[8-11]，但不同植物中三萜的含量不同.馬比木根中總?cè)坪繛?45 mg·g-1(干重)，莖中總?cè)坪繛?25.17 mg·g-1[12](干重)；女貞葉中總?cè)坪績(jī)H為5.11 mg·g-1[13](干重).目前研究?jī)H對(duì)巖白菜中三萜化合物進(jìn)行了定性分析，并沒(méi)有進(jìn)行定量分析[7].三萜純化是三萜類化合物分離、鑒定和應(yīng)用的一個(gè)重要步驟.樊梓鸞等用大孔樹(shù)脂純化紅豆越橘總?cè)?，其純度由原?lái)的5.13%提高到29.46%[14]；Luo等采用吸附色譜的方法從靈芝中分離純化得到不同三萜單體[15].但關(guān)于峨眉巖白菜總?cè)频募兓芯枯^少.
峨眉巖白菜目前屬于野生資源，還沒(méi)有被充分開(kāi)發(fā)利用.因此本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)特有物種峨眉巖白菜為研究對(duì)象，對(duì)其根中的總?cè)七M(jìn)行分離純化，并比較純化前后體外抗氧化、抑菌和抑癌活性，為峨眉巖白菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論和技術(shù)支撐.
1材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 供試材料采自四川峨眉山海拔1 300～1 500 m地區(qū)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)胡超副教授鑒定為峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu).將根用超純水清洗3遍，50 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，干粉-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?
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1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1三萜提取 3 L 80 %乙醇與100 g巖白菜根粉末充分混勻，45 ℃下210 W超聲提取40 min.將提取液抽濾所得濾液蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥4 d得粉末狀提取物.
1.2.2總?cè)坪繙y(cè)定 采用香草醛-高氯酸法測(cè)定總?cè)坪縖16].取50 μL樣液加入100 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液(m/V)和200 μL高氯酸，60 ℃水浴15 min后加入冰乙酸定容至1 mL，混勻靜置5 min，于550 nm處測(cè)定吸光值.標(biāo)準(zhǔn)曲線采用熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品制作，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)坪?
1.2.3沉淀分級(jí)溶解法純化 第一次提取液冷凍干燥4 d得粉末狀提取物為第一次凍干提取物.取凍干后的提取物用500 mL無(wú)水乙醇50 ℃超聲溶解，抽濾3次，濾液蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥4天得第二次凍干提取物，稱量并測(cè)定提取物中總?cè)坪?重復(fù)以上步驟3次，分別得到第1次、第2次、第3次、第4次凍干提取物.
1.2.4體外抗氧化活性測(cè)定
1) DPPH清除能力測(cè)定.將第一次和第四次凍干提取物用80 %乙醇溶解成相應(yīng)濃度.根據(jù)Marsden的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力[17].30 μL樣液與170 μL DPPH乙醇溶液(0.8 mM)混勻，黑暗處放置15 min.于517 nm處測(cè)定吸光值.DPPH自由基清除率根據(jù)以下公式計(jì)算：
其中，A1為樣品處理組吸光值，A0為乙醇代替樣品空白組吸光值.
2) 總還原能力測(cè)定.將第1次和第4次凍干提取物用80%乙醇溶解成相應(yīng)濃度.根據(jù)Liyana等的方法測(cè)定總還原能力[18].0.5 mL樣液與0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液(m/V)和0.5 mL PBS(0.2 mol·L-1)混勻，50 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 10 %三氯乙酸溶液(m/V)，冷卻5 min.取上清液0.5 mL加入0.1 mL 0.1 %三氯化鐵溶液(m/V)和0.5 mL蒸餾水，混勻后在700 nm處測(cè)定吸光值.吸光值越大表示總還原能力越強(qiáng).
1.2.5抑菌活性測(cè)定
1) 菌種準(zhǔn)備.枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)系保種.取菌種加入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下200 r·min-1搖菌24 h.接種環(huán)蘸取菌懸液在LB固體培養(yǎng)基上劃線.放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r·min-1搖菌24 h獲得活化菌懸液.
2) 抑菌圈測(cè)定.采用牛津杯法測(cè)定抑菌圈[19].將第一次和第四次凍干提取物用DMSO溶解成相應(yīng)濃度，DMSO最終含量低于0.05%.根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定活化菌懸液菌濃度，并調(diào)整為1×107CFU·mL-1.取0.5 mL菌液均勻鋪滿培養(yǎng)基表面，待液體吹干后放置滅菌過(guò)的牛津杯，在牛津杯中加入200 μL不同濃度的藥物.100 μg·mL-1氨芐青霉素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，0.05% DMSO溶液作為空白對(duì)照.將培養(yǎng)基放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h測(cè)定抑菌圈大小.
1.2.6抑癌活性測(cè)定 Hela和A549細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系惠贈(zèng).Hela細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%FBS和0.1%雙抗)，A549細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%FBS和0.1%雙抗)在含5%二氧化碳37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次.待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化細(xì)胞并用PBS緩沖液沖洗兩次，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL-1，取90 μL細(xì)胞懸浮液到96孔板中，邊緣用100 μL PBS填充.培養(yǎng)12 h后加入10 μL不同濃度的藥物.培養(yǎng)24和48 h后用100 μL新鮮培養(yǎng)基代替舊培養(yǎng)基，并加入10 μLCCK-8培養(yǎng)30 min，在450 nm處測(cè)定吸光值.細(xì)胞抑制率根據(jù)以下公式計(jì)算：
其中，A1為加入藥物組的吸光值，A0為空白組的吸光值.
1.3數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±相對(duì)誤差(mean±SD)表示.采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2結(jié)果與分析
2.1沉淀分級(jí)溶解法提高三萜純度
從圖1中可以看出提取物中總?cè)坪枯^高，說(shuō)明峨眉巖白菜中富含三萜類化合物.從表1中可以看出，第1次凍干的樣品提取率為38.13%，提取物中總?cè)坪繛?8.58%(圖1).經(jīng)4次凍干后，樣品提取率有所下降，為26.79%，而提取物中總?cè)坪匡@著提高，為70.99%.說(shuō)明在沉淀分級(jí)溶解過(guò)程中，提取率下降表示不溶于醇的雜質(zhì)被過(guò)濾掉，顯著提高峨眉巖白菜提取物中總?cè)坪?凍干3次和4次的樣品提取率無(wú)顯著差異，提取物中總?cè)坪恳矡o(wú)顯著變化.因此，可以用沉淀分級(jí)溶解的方法對(duì)峨眉巖白菜總?cè)七M(jìn)行純化.
2.2純化前后體外抗氧化活性比較
從圖2A中可以看出純化前即第1次凍干總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基最大清除率為90.91%，IC50為0.32 mg·mL-1.純化后即第4次凍干總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基的最大清除率為94.45%，IC50為0.27 mg·mL-1.IC50越小代表抗氧化能力越強(qiáng)，純化后，能降低總?cè)铺崛∥飳?duì)DPPH自由基的IC50，由此可見(jiàn)經(jīng)純化后峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)DPPH自由基的清除率顯著提高.從圖2(b)中可以看出，在0.2到1.0 mg·mL-1之間，純化后總?cè)频目傔€原能力高于純化前.蔡天嬌等人發(fā)現(xiàn)紅棗三萜酸經(jīng)純化后，對(duì)ABTS自由基清除能力增強(qiáng)，IC50由1.18 mg·mL-1變?yōu)?.73 mg·mL-1[21].本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频捏w外抗氧化能力提高，說(shuō)明有效成分經(jīng)沉淀分級(jí)溶解純化后達(dá)到了富集的效果.
圖1 多次凍干后總?cè)坪孔兓疐ig.1 The content of triterpenes in extract after repeatedly freeze-dried times
表1 不同次數(shù)凍干后樣品提取率
圖2 純化前后體外抗氧化活性比較Fig.2 The comparison of antioxidant abilities before and after purification
2.3純化前后抑菌活性比較
植物三萜提取物被證實(shí)具有一定的抑菌能力，例如金銀花總?cè)茖?duì)7種常見(jiàn)致病菌均有較強(qiáng)的抑制能力，而關(guān)于峨眉巖白菜總?cè)埔志钚匝芯繄?bào)道較少[7].從表2中可以看出純化前后的峨眉巖白菜總?cè)苹衔飳?duì)枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌均有一定的抑制能力(抑菌圈均大于8 mm).抑菌圈為10～14 mm時(shí)，表明藥物對(duì)致病菌為輕度敏感；抑菌圈為15～20 mm時(shí)，藥物對(duì)致病菌為中度敏感.純化前峨眉巖白菜總?cè)圃?～8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌均具有輕度敏感(抑菌圈均在10～14 mm內(nèi)).純化后在4 mg·mL-1濃度下峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)兩種菌為輕度敏感，8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌為中度敏感(抑菌圈均在15～20 mm內(nèi)).說(shuō)明經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频囊志钚缘玫教岣?
表2 純化前后抑菌活性比較Tab.2 The comparison of antimicrobial abilities before and after purification
2.4純化前后對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力比較
多種植物三萜提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑癌活性.靈芝三萜和金絲小棗三萜對(duì)前列腺癌細(xì)胞均具有較好的抑制能力[22-23].劉素君等人發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞和小鼠腹水瘤細(xì)胞有較好的抑制能力[24].從圖3(a)中可以看出，純化前峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞具有較好的抑制能力，24 h和48 h的IC50分別為102.5和69.00 μg·mL-1.從圖3(b)中可以看出純化后三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力顯著提高，24 h和48 h的IC50分別為59.01和28.56 μg·mL-1.說(shuō)明經(jīng)過(guò)重結(jié)晶純化后，能顯著提高峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)Hela細(xì)胞的抑制能力.
圖3 純化前后抑癌活性比較Fig.3 The comparison of anticancer ability before and after purification
2.5純化前后對(duì)A549細(xì)胞的抑制能力比較
從圖4中可以看出峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞具有一定的抑制能力.未純化前隨著三萜提取物濃度升高，抑制率也逐漸上升，48 h最高抑制率達(dá)到55.80 %，24和48 h的IC50分別為238.90 μg·mL-1和172.00 μg·mL-1(圖4(a)).從圖4(b)中可以看出，純化后的三萜提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制能力提高，當(dāng)濃度高于200 μg·mL-1時(shí)，抑制率趨于平穩(wěn)，48 h最高抑制率為66.21 μg·mL-1，24和48 h的IC50分別為84.32 μg·mL-1和65.99 μg·mL-1.經(jīng)純化后，能顯著降低對(duì)A549的IC50，說(shuō)明經(jīng)過(guò)重結(jié)晶純化后，能顯著提高峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)A549細(xì)胞的抑制能力.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)峨眉巖白菜總?cè)凭哂休^強(qiáng)的抑癌活性，因此表明峨眉巖白菜提取物中抑癌活性成分可能為總?cè)?
圖4 純化前后抑癌活性比較Fig.4 The comparison of anticancer ability before and after purification
3結(jié)論
峨眉巖白菜中含有較豐富的總?cè)?經(jīng)沉底分級(jí)溶解純化后，樣品提取率從38.13%降低到26.79%，提取物中總?cè)坪繌?8.58%升高到70.99%，說(shuō)明沉底分級(jí)溶解法能有效提高峨眉巖白菜中總?cè)坪?經(jīng)純化后，峨眉巖白菜總?cè)频目傔€原能力增強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的IC50由0.32 mg·mL-1降低到0.27 mg·mL-1.抑菌結(jié)果表明峨眉巖白菜總?cè)茖?duì)銅綠假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制能力，在4～8 mg·mL-1濃度下，對(duì)兩種菌為輕度敏感.經(jīng)純化后，在8 mg·mL-1濃度下對(duì)兩種菌為中度敏感.并且總?cè)铺崛∥锬苡行б种艸ela細(xì)胞增殖，純化前處理24 h和48 h后的IC50分別為102.5 μg·mL-1和69.00 μg·mL-1.純化后IC50降小為59.01 μg·mL-1和28.56 μg·mL-1.對(duì)A549肺癌細(xì)胞有一定的抑制能力，純化后能顯著降低IC50為84.32 μg·mL-1和65.99 μg·mL-1.說(shuō)明經(jīng)純化后，能提高峨眉巖白菜總?cè)频囊职┗钚?因此沉淀分級(jí)溶解法可適用于峨眉巖白菜總?cè)频募兓?，純化后的總?cè)?體外抗氧化、抑菌活性和抑癌活性均有一定程度的提高.
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