生物炭連續(xù)施用對(duì)農(nóng)田土壤氮轉(zhuǎn)化微生物及N2O排放的影響

董成，陳智勇，謝迎新，張陽(yáng)陽(yáng)，緱培欣，楊家蘅，馬冬云，王晨陽(yáng)，郭天財(cái)

生物炭連續(xù)施用對(duì)農(nóng)田土壤氮轉(zhuǎn)化微生物及N2O排放的影響

董成，陳智勇，謝迎新，張陽(yáng)陽(yáng)，緱培欣，楊家蘅，馬冬云，王晨陽(yáng)，郭天財(cái)

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，鄭州 450002）

【目的】研究連續(xù)添加生物炭6年后對(duì)農(nóng)田土壤氮轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物功能基因的影響，揭示生物炭影響作物產(chǎn)量和N2O排放的微生物學(xué)機(jī)制，并為生物炭的推廣使用提供理論依據(jù)?！痉椒ā?通過在潮土農(nóng)田設(shè)置0（BC0，對(duì)照)、2.25（BCL，低量）、6.75（BCM，中量）和11.25 t·hm-2（BCH，高量）4個(gè)秸稈生物炭量處理的田間定位試驗(yàn)，采用田間觀測(cè)、化學(xué)分析、熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，系統(tǒng)研究施用生物炭對(duì)氧化亞氮（N2O）排放、氨單加氧酶（）、亞硝酸還原酶（K、S）、氧化亞氮還原酶（Z）基因豐度及夏玉米產(chǎn)量的影響?！窘Y(jié)果】與對(duì)照BC0處理相比，施用生物炭可顯著提高夏玉米籽粒產(chǎn)量，且BCM處理籽粒產(chǎn)量達(dá)到最大值10 811 kg·hm-2，顯著降低夏玉米生育期N2O累積排放量，并以BCM處理減少N2O排放效果最優(yōu)。研究還發(fā)現(xiàn)，在夏玉米多個(gè)生育時(shí)期，與對(duì)照比較，生物炭施用可以顯著提高耕層土壤無(wú)機(jī)氮儲(chǔ)量和土壤含水量。此外，隨著生物炭施用量增加，土壤氨氧化古菌（AOA）基因拷貝數(shù)在夏玉米大喇叭口期和成熟期均表現(xiàn)為先上升后下降趨勢(shì)，且兩個(gè)時(shí)期均以BCM處理最高，而氨氧化細(xì)菌（AOB）基因拷貝數(shù)在夏玉米大喇叭口期和成熟期分別為BCH處理和BCM處理最高。與對(duì)照相比，中、高量生物炭施用（BCM、BCH處理）可顯著提高夏玉米大喇叭口期和成熟期土壤反硝化作用功能相關(guān)基因（K、S、Z）拷貝數(shù)。相關(guān)性分析表明，夏玉米成熟期土壤N2O排放通量與土壤硝態(tài)氮、土壤含水量、AOA、AOB、K、S、Z呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系?！窘Y(jié)論】施用生物炭通過增加土壤微生物氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度進(jìn)而降低土壤N2O排放，通過增加土壤耕層無(wú)機(jī)氮儲(chǔ)量和土壤水分含量進(jìn)而提高作物產(chǎn)量，并以中等用量（6.75 t·hm-2）施用效果最優(yōu)。

生物炭；農(nóng)田；土壤微生物；氮轉(zhuǎn)化功能基因；N2O排放；夏玉米

0 引言

【研究意義】生物炭具有含碳量高、比表面積較大、孔隙結(jié)構(gòu)豐富、養(yǎng)分含量高、碳穩(wěn)定性強(qiáng)等獨(dú)特的理化性質(zhì)[1-2]，使其近年來(lái)在固碳減排[3]、水土保持、減少養(yǎng)分流失[4]、提高作物產(chǎn)量[5]等方面具有良好的應(yīng)用潛力，但生物炭施用對(duì)農(nóng)田N2O排放和作物產(chǎn)量影響的具體微生物效應(yīng)機(jī)制尚未明確。因此，開展多年連續(xù)添加生物炭對(duì)農(nóng)田土壤氮轉(zhuǎn)化微生物功能基因豐度、N2O排放及作物產(chǎn)量影響方面的研究，可為生物炭在農(nóng)業(yè)方面的推廣使用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】施用生物炭對(duì)農(nóng)田N2O排放影響的研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，土壤硝化作用和反硝化作用作為農(nóng)田N2O排放的主要途徑[6]，但其研究機(jī)制存在較大爭(zhēng)議，且這種爭(zhēng)議主要集中在生物炭制備原材料、生產(chǎn)工藝及土壤類型等方面[7]。VERHOEVEN等[8]通過在14種不同類型土壤中施用9種不同材料得到的生物炭研究認(rèn)為，生物炭施用可提高土壤pH和減少土壤N2O排放。然而，CLOUGH等[9]研究發(fā)現(xiàn)，施用木質(zhì)生物炭對(duì)草地土壤N2O排放并無(wú)顯著影響。更有研究者發(fā)現(xiàn)在燥紅壤中施用生物炭后，也可顯著促進(jìn)土壤硝化作用，進(jìn)而導(dǎo)致土壤N2O在短時(shí)間內(nèi)集中排放[10]。另外，土壤硝化作用過程中氨氧化古菌（ammonia- oxidizing archaea，AOA）和氨氧化細(xì)菌（ammonia- oxidizing bacteria，AOB）的氨單加氧酶（）以及反硝化作用過程中對(duì)應(yīng)的亞硝酸鹽還原基因K、S和編碼氧化亞氮還原酶的唯一基因Z基因[11-13]被廣泛用作功能標(biāo)志基因來(lái)研究土壤硝化及反硝化過程，成為近些年來(lái)的研究熱點(diǎn)。王曉輝等[14]發(fā)現(xiàn)，土壤中加入生物炭后，AOA、AOB和K基因型反硝化細(xì)菌的基因豐度明顯增加，但對(duì)S和Z基因豐度沒有顯著影響。WARNOCK等[15]研究表明，施用生物炭可減少土壤硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的有效可用氮源，進(jìn)而起到減少N2O排放以及改變農(nóng)田氮循環(huán)的效果。DUAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮生物炭可提高酸性土壤中KZII和堿性土壤中KZI，降低堿性土壤AOB基因豐度，從而有效減少N2O排放量，但老化生物炭則會(huì)對(duì)兩種類型土壤硝化和反硝化作用均有顯著的促進(jìn)作用，且顯著增加N2O排放?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前，施用生物炭對(duì)土壤氮轉(zhuǎn)化微生物影響的研究也主要集中在與土壤碳、氮循環(huán)相關(guān)的幾種功能微生物，且其對(duì)土壤N2O排放及作物產(chǎn)量影響的報(bào)道還存在爭(zhēng)議，主要因?yàn)橐酝难芯慷酁槎唐诘奶镩g試驗(yàn)[17-19]或室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)[20-23]。中性或偏堿性的潮土作為中國(guó)分布面積最廣的農(nóng)田土壤對(duì)全國(guó)糧食產(chǎn)量的貢獻(xiàn)超過1/5，具有強(qiáng)烈的硝化作用[24]。然而，連續(xù)多年在潮土農(nóng)田施用生物炭后是否改變土壤氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度及土壤速效氮性質(zhì)，對(duì)土壤硝化作用和反硝化作用又會(huì)產(chǎn)生何種影響，且最終是否能對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生增產(chǎn)減排效果，這些問題仍沒有明確答案。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過設(shè)立連續(xù)多年生物炭添加農(nóng)田定位試驗(yàn)，以黃淮典型小麥-玉米輪作潮土農(nóng)田為研究對(duì)象，分析連續(xù)添加生物炭處理6年后不同生物炭施用量下夏玉米產(chǎn)量、土壤N2O排放的具體差異，探究連續(xù)多年施用生物炭的增產(chǎn)減排潛力及其影響作物產(chǎn)量和N2O排放的微生物學(xué)機(jī)制，從而揭示長(zhǎng)期連續(xù)施用生物炭對(duì)土壤氮循環(huán)微生物、N2O排放及作物生產(chǎn)的具體影響，為生物炭農(nóng)用和土壤科學(xué)管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和供試物料

試驗(yàn)地位于河南省封丘縣潘店鄉(xiāng)中國(guó)科學(xué)院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站（35°00′N，114°24′E），該地處黃淮海平原中部，毗鄰黃河，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫14℃，無(wú)霜期214 d左右，年平均降水量625 mm，年平均蒸發(fā)量1 860 mm。

土壤類型為潮土，2011年試驗(yàn)開始時(shí)初始土壤基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)（OM）11.2 g·kg-1、全氮（TN）0.79 g·kg-1、速效磷（P）8.6 mg·kg-1、有效鉀（K）92.1 mg·kg-1、pH為8.3（土水比1﹕2.5）。試驗(yàn)用生物炭為水稻秸稈在500℃條件下，以沼氣為能源的炭化爐下熱解自行制備[25]，其基本理化性質(zhì)為全氮（TN）10.3 g·kg-1、全碳（TC）514.8 g·kg-1、有效磷（P）1.71 g·kg-1、速效鉀（K）49.2 mg·kg-1、pH為10.5（炭水比1﹕10）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

試驗(yàn)起始于2011年10月，至2018年9月已完成7個(gè)小麥/玉米輪作種植周期（10月至次年6月為小麥季，6—9月為玉米季）。由于當(dāng)前生物炭在農(nóng)田的施用量并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通常情況下，我國(guó)小麥/玉米/水稻秸稈每公頃每季產(chǎn)量約為7.5 t，如將每季生產(chǎn)的秸稈在下季作物開始前全部炭化還田，按照秸稈炭化率30%計(jì)算得到的每公頃秸稈生物炭（500℃，4 h）量約為2.25 t[26]。因此，本研究從秸稈炭化還田的良性循環(huán)出發(fā)，圍繞每季秸稈全部炭化后還田的量（2.25 t·hm-2）設(shè)置不施秸稈生物炭0（BC0，對(duì)照）、2.25 t·hm-2（秸稈全量炭化還田，BCL，低量）、6.75 t·hm-2（3倍秸稈全量炭化還田，BCM，中量）和11.25 t·hm-2（5倍秸稈全量炭化還田，BCH，高量）4個(gè)處理，小區(qū)面積4 m×4 m，重復(fù)3次，隨機(jī)排列。各小區(qū)氮（N）、磷（P）、鉀（K）肥施用情況分別為N 200 kg·hm-2（常規(guī)尿素，含量46%）、P2O5150 kg·hm-2（重過磷酸鈣，44%）和K2O 90 kg·hm-2（硫酸鉀，50%）。其中，磷、鉀肥作為基肥在播種前一次性施用，氮肥分基肥和拔節(jié)肥兩次施用，基肥和追肥比例為6﹕4。生物炭與基肥在每次種植作物前均勻撒施于小區(qū)內(nèi)，使其與0—20 cm耕層土壤均勻混合。小麥播種期通常為每年10月10—15日，收獲期為每年6月1—5日；玉米播種期通常為每年6月6—10日，收獲期為每年9月13—25日。本研究主要為連續(xù)生物炭添加6年后的夏玉米季試驗(yàn)結(jié)果，夏玉米于2018年6月8日播種，2018年9月13日收獲。其他田間栽培管理措施同當(dāng)?shù)匾话戕r(nóng)田。

土壤樣品采用對(duì)角線5點(diǎn)取樣法分別于2018年6—9月玉米全生育期每小區(qū)進(jìn)行0—20 cm土層采集。同一小區(qū)處理新鮮土樣均勻混合，過2 mm篩后，一部分于-80℃保存用于微生物DNA提取及測(cè)定，另一部分于4℃冰箱中保存用于土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的測(cè)定。

1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 新鮮土壤樣品采用2 mol·L-1KCl溶液提取，土、溶液質(zhì)量體積比為1﹕5，在搖床上振蕩1 h，過濾后的提取液采用紫外分光光度計(jì)在雙波長(zhǎng)（220 nm，275 nm）下直接測(cè)定硝態(tài)氮濃度，采用靛酚藍(lán)比色法在單波長(zhǎng)（625 nm）下測(cè)定銨態(tài)氮濃度。鑒于土壤無(wú)機(jī)氮含量（土壤Nmin=硝態(tài)氮+銨態(tài)氮）可以有效表征土壤的供氮能力, 可作為推薦施氮的指標(biāo)[27]，因此，本試驗(yàn)也采用土壤Nmin作為表征多年連續(xù)施用生物炭后土壤肥力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

土壤含水量為采用重量烘干法測(cè)定，并根據(jù)已經(jīng)測(cè)定的土壤容重指標(biāo)將土壤重量含水量換算為土壤孔隙含水量[28-29]（water-filled pore space，WFPS）。

1.3.2 N2O氣體收集 N2O氣體通過密閉箱法（圖1）

圖1 田間土壤N2O取樣裝置

進(jìn)行采集，在每季玉米播種前整地時(shí)，將直徑為30 cm的圓形密閉氣體采集箱底座放置于小區(qū)固定位置兩行玉米之間。采樣時(shí)間為上午8：00—10：00，在放上密閉箱的第0、15、30和45小時(shí)用注射器抽取密閉箱內(nèi)氣體，并利用提前備好的真空瓶自動(dòng)采集氣體后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行N2O氣體測(cè)定。采集氣體的同時(shí)記錄氣溫、土溫及箱內(nèi)氣體溫度。N2O氣體用氣相色譜儀（Agilent7890A，Agilent Technologies，USA）測(cè)定。N2O排放通量計(jì)算如下[30]：

F = ρ × H × ΔC/Δt × 273 / (273 + T)

式中，F(xiàn)為溫室氣體排放通量（μg·m-2·h-1）；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O氣體的密度（1.25 kg·m-3）；H為密閉箱高（m）；ΔC/Δt為單位時(shí)間內(nèi)氣體濃度變化量（μg·h-1）；T為密閉箱內(nèi)平均溫度（℃）。N2O季節(jié)累積排放量按照排放通量，由時(shí)間加權(quán)法計(jì)算得到。

1.3.3 土壤微生物總DNA提取和熒光定量PCR分析 采用MP Biomedicals公司FastDNA ?SPIN Kit for Soil試劑盒提取土壤總DNA。每個(gè)樣品稱取0.5 g的土壤到Lysing Matrix E Tube。按照FastDNA ?SPIN Kit for Soil試劑盒方法和步驟進(jìn)行土壤總DNA提取。用核酸定量?jī)x（NanoDrop2000）檢測(cè)DNA的純度和濃度，用濃度為1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的完整性。各功能基因的PCR循環(huán)條件如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物及擴(kuò)增條件

S代表堿基G或C；K代表堿基G或T；M代表堿基A或C；R代表堿基A或G

S: Base G or C; K: Base G or T; M: Base A or C; R: Base A or G

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同處理間作物產(chǎn)量、土壤理化性質(zhì)以及氨氧化古菌、細(xì)菌基因、亞硝酸鹽還原菌（K、S）、氧化亞氮還原菌Z基因拷貝數(shù)采用 Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（＜0.05），并對(duì)不同生物炭處理下土壤N2O、NH4+、NO3-、WFPS與微生物基因豐度進(jìn)行相關(guān)性分析（Pearson，Two-tailed）。采用Excel 2010和origin 2017對(duì)土壤微生物基因豐度進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 施用生物炭對(duì)玉米產(chǎn)量的影響

由圖2可知，施用生物炭可顯著提高夏玉米籽粒產(chǎn)量，其中，2018年度夏玉米季籽粒產(chǎn)量BCL、BCM和BCH生物炭處理籽粒產(chǎn)量分別較BC0增6.4%、17.9%、15.4%，其中，BCM處理達(dá)到最高值10 811 kg·hm-2，但BCM處理與BCH處理間無(wú)顯著差異。此外，通過對(duì)各處理連續(xù)7年度（2011—2018）夏玉米季平均籽粒產(chǎn)量的影響比較發(fā)現(xiàn)，各生物炭處理也均顯著高于對(duì)照BC0處理，但各生物炭處理間差異不顯著。

2.2 施用生物炭對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮含量的影響

由圖3看出，各處理土壤無(wú)機(jī)氮（Nmin）含量整體變化趨勢(shì)基本相同，均表現(xiàn)為在施肥后或者灌水（或降雨）后含量有所上升，且添加生物炭處理Nmin含量明顯較未添加生物炭對(duì)照處理高。自2018年6月9日玉米播種至8月1日各處理Nmin含量波動(dòng)均較大，7月25日（玉米大喇叭口期）施肥后土壤Nmin持續(xù)上升，施肥4 d后（7月29日）達(dá)到峰值，之后逐漸下降，8月20日（玉米灌漿期）降到最低值，之后趨于平緩。其中，在夏玉米成熟期（9月13日），BCL、BCM和BCH處理的土壤Nmin含量顯著高于BC0處理，具體表現(xiàn)為BCH處理＞BCM處理＞BCL處理＞BC0處理。該結(jié)果表明，連續(xù)多年添加生物炭具有提高農(nóng)田無(wú)機(jī)氮含量的效果。

2.3 施用生物炭對(duì)土壤N2O排放及含水量的影響

由圖4可以看出，與土壤Nmin變化趨勢(shì)相似，在整個(gè)玉米生育期土壤N2O排放通量變化趨勢(shì)同樣均表現(xiàn)為在施肥后或者灌水（或降雨）后含量有所上升，且在多數(shù)生育期生物炭處理土壤N2O排放通量顯著低于對(duì)照BC0處理。在玉米大喇叭口追施氮肥時(shí)（7月25日）未添加生物炭對(duì)照BC0處理土壤N2O排放通量達(dá)到峰值456.45 μg·m-2·h-1，且顯著高于生物炭處理。到夏玉米成熟期，與BC0相比，3個(gè)生物炭處理顯著降低土壤N2O排放通量，并以BCM處理減少N2O排放幅度較大，具體表現(xiàn)為BC0處理＞BCL處理＞BCH處理＞BCM處理。該研究表明，生物炭施用具有降低土壤N2O排放的效果，但并非生物炭添加量越多效果越佳。

BC0、BCL、BCM、BCH分別代表對(duì)照、低量生物炭、中量生物炭和高量生物炭4種處理。相同年度不同處理圖柱上不同字母表示處理間存在顯著差異（P＜0.05）；柱形圖頂部“±”代表標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）。下同

實(shí)線箭頭所指代表施肥時(shí)期，虛線箭頭所指代表灌溉或降雨時(shí)期；同一取樣時(shí)期同列不同小寫字母表示不同處理在P＜0.05水平上差異顯著。下同

由圖4還可以看出，各處理土壤空隙含水量（WFPS）變化趨勢(shì)基本一致，均在施肥灌水后（6月9日和7月27日）和有效降雨后（8月20日）先升高后逐漸降低，且在多數(shù)監(jiān)測(cè)時(shí)期中量和高量生物炭處理（BCM和BCH）土壤WFPS顯著高于對(duì)照BC0處理。

此外，從圖5也可看出，不同處理在2018年整個(gè)夏玉米生育期和2011—2018年連續(xù)7個(gè)夏玉米季具有相似的土壤N2O累積排放規(guī)律，均表現(xiàn)為BCH、BCM處理顯著低于BC0處理，但BCL與BC0處理間差異不顯著。其中，在2018年玉米季，BCM和BCH處理土壤N2O累積排放量分別較BC0降低31.3%和16.9%，并以BCM處理降低幅度最大。該研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期連續(xù)施用生物炭具有降低農(nóng)田土壤N2O排放的效果。

2.4 施用生物炭對(duì)土壤AOA和AOB基因豐度的影響

圖6表明，土壤AOA基因拷貝數(shù)均顯著高于AOB基因。對(duì)于土壤AOA基因而言，在夏玉米大喇叭口期和成熟期均表現(xiàn)為隨生物炭施用量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在該兩個(gè)生育期均以BCM處理基因拷貝數(shù)較高。對(duì)于土壤AOB基因，大喇叭口期AOB基因拷貝數(shù)則表現(xiàn)為隨生物炭施用量的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，其中BCM和BCH處理分別較BC0顯著增加101.5%和421.2%。與土壤AOA變化趨勢(shì)相似，成熟期土壤AOB基因拷貝數(shù)也隨生物炭施用量增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，且BCM和BCH處理也顯著高于BC0處理，并以BCM處理最高。

圖4 不同生物炭處理土壤耕層（0—20 cm）N2O排放通量和水分含量動(dòng)態(tài)變化

圖5 不同處理玉米生育期N2O累積排放量

BS：大喇叭口期；MS：成熟期。下同

2.5 施用生物炭對(duì)土壤nirK、nirS和nosZ基因豐度的影響

圖7表明，各處理土壤S基因拷貝數(shù)均遠(yuǎn)高于K和Z基因拷貝數(shù)，前者比后者高出1—3個(gè)數(shù)量級(jí)。土壤K基因拷貝數(shù)在夏玉米大喇叭口期和成熟期均表現(xiàn)為隨著生物炭用量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在該兩生育期均以BCM處理數(shù)值最高。

圖7 生物炭對(duì)土壤nirK、nirS和nosZ基因豐度的影響

對(duì)于土壤S基因拷貝數(shù)，與BC0比較，大喇叭口期BCL、BCM和BCH處理分別顯著增加33.9%、31.9%和62.0%，成熟期BCM和BCH處理分別顯著提高40.4%和32.4%。而對(duì)于土壤Z基因，在夏玉米大喇叭口期和成熟期則表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，大喇叭口期，BCL、BCM和BCH處理土壤Z基因拷貝數(shù)分別較BC0顯著增加25.3%、34.5%和127.5%；成熟期，土壤Z基因拷貝數(shù)隨著生物炭施用量的增加則同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并以BCM處理數(shù)值最高。

2.6 土壤N2O排放與各氮循環(huán)相關(guān)功能基因豐度的相關(guān)性分析

對(duì)成熟期土壤理化性質(zhì)、N2O排放與各功能基因豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，由表2可知，N2O排放通量與土壤硝態(tài)氮、土壤含水量、AOA呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（＜0.05），與AOB、K、S、Z呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（＜0.01）。土壤銨態(tài)氮含量與其他理化指標(biāo)和基因拷貝數(shù)均未達(dá)到顯著性水平（＞0.05），土壤硝態(tài)氮含量與AOA和AOB呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01），與土壤K呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.05）；土壤空隙含水量（WFPS）與S、Z呈顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.05）；土壤AOA與AOB和K呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）；土壤AOB與K、S、Z呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）；土壤K與S呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與Z顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）；土壤S與Z呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（＜0.05）。

表2 土壤性質(zhì)、N2O排放與功能基因豐度的相關(guān)性分析

* 代表＜0.05，相關(guān)性顯著；** 代表＜0.01，相關(guān)性極顯著

*Represents a significant difference at the 0.05 level; **Represents a significant difference at the 0.01 level

3 討論

3.1 施用生物炭對(duì)作物產(chǎn)量的影響

關(guān)于生物炭對(duì)作物產(chǎn)量的影響，國(guó)內(nèi)外有不同報(bào)道，但總體上以正向效應(yīng)居多。UZOMA等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在砂質(zhì)土壤中施用生物炭，可顯著提高玉米產(chǎn)量，王江偉等[37]發(fā)現(xiàn)，施用生物炭能夠提高稻麥籽粒產(chǎn)量11.4%—60.5%。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施用生物炭6年后可顯著提高潮土農(nóng)田夏玉米籽粒產(chǎn)量，且以6.75 t·hm-2生物炭用量處理增產(chǎn)效果較好。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在玉米成熟期，施用生物炭可顯著提高土壤Nmin，表明連續(xù)施用秸稈炭可以提升土壤無(wú)機(jī)氮庫(kù)。生物炭較大的比表面積和豐富的微孔結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)土壤保墑能力[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)取樣時(shí)期，添加生物炭土壤含水量普遍顯著高于未添加生物炭對(duì)照處理，表明施用生物炭具有提高土壤有效水含量的效果，可對(duì)作物生長(zhǎng)產(chǎn)生積極影響。因此，本研究分析認(rèn)為，長(zhǎng)期連續(xù)添加生物炭提高土壤Nmin含量和土壤含水量可能是促進(jìn)作物產(chǎn)量提高的主要因素。

3.2 施用生物炭對(duì)N2O排放與氮功能基因豐度的影響

目前，關(guān)于生物炭對(duì)土壤N2O排放影響的研究較多，但結(jié)果不一，且其作用機(jī)制各研究者的觀點(diǎn)也不盡相同。有研究認(rèn)為，在我國(guó)北方旱地土壤，硝化過程是N2O的主要來(lái)源且主導(dǎo)了N2O排放，反硝化作用產(chǎn)生的N2O較少[39-40]；而在菜地土壤中，施用生物炭可顯著提高土壤pH和SOC，增加K和S基因豐度從而間接促進(jìn)N2O排放，同時(shí)增加Z基因豐度直接促進(jìn)N2O還原，綜合效應(yīng)表現(xiàn)為降低菜地土壤N2O排放[41]。關(guān)于AOA和AOB對(duì)土壤硝化作用影響N2O排放的貢獻(xiàn)存在很大爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤AOA占據(jù)土壤硝化作用相關(guān)功能基因主導(dǎo)地位時(shí)，施用生物炭會(huì)抑制氨氧化作用[42]。Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤AOA主導(dǎo)N2O排放，而堿性土壤N2O則由AOB主導(dǎo)。Wu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮生物炭和老化生物炭均可提高稻田土壤中AOA和AOB基因豐度，降低（SK）/Z比值，但對(duì)N2O的季節(jié)性排放沒有明顯的影響。本研究中，施用生物炭可顯著提高潮土農(nóng)田（堿性土壤）夏玉米成熟期AOA和AOB基因豐度，這一發(fā)現(xiàn)與前人研究結(jié)果一致[45]，但在本研究中施用生物炭可降低潮土農(nóng)田N2O排放。相關(guān)分析也表明，土壤AOA和AOB基因豐度與N2O排放量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明在本試驗(yàn)中土壤AOA和AOB基因豐度的增加可能引起基因豐度的增加促進(jìn)了土壤硝化作用的氨氧化過程，從而引起NO3-含量增加，最終導(dǎo)致N2O排放量降低。同時(shí)，土壤NO3-含量與AOA和AOB呈顯著正相關(guān)，而與N2O排放呈顯著負(fù)相關(guān)，也印證了本研究結(jié)果。但僅僅對(duì)比基因豐度的前后變化不足以說明氨氧化微生物對(duì)生物炭的響應(yīng)機(jī)制，未來(lái)針對(duì)土壤中AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)變化，及其如何影響氨氧化過程仍需進(jìn)一步研究。

賀超卉等[46]研究發(fā)現(xiàn)，向土壤中施用少量生物炭可促進(jìn)N2O向N2的轉(zhuǎn)化過程，增加S和Z反硝化基因豐度。WANG等[47]發(fā)現(xiàn)，土壤S和Z基因在控制N2O排放中起關(guān)鍵作用。HARTER等[48]研究表明，在中性和堿性土壤中N2O排放量主要受Z基因調(diào)控，而Z基因在反硝化作用中的主要功能是編碼氧化亞氮還原酶，將N2O催化還原為N2，其基因豐度增加有助于促進(jìn)反硝化作用過程，從而導(dǎo)致N2O排放量降低，這也部分解釋了本文研究結(jié)果。與前人研究類似，在本研究發(fā)現(xiàn)，土壤N2O排放與KS、Z呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，施用生物炭可顯著提高土壤Z基因豐度，進(jìn)而導(dǎo)致N2O排放量降低。

綜上所述，本研究通過長(zhǎng)期定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在黃淮潮土農(nóng)田連續(xù)多年施用生物炭可以更好的吸附儲(chǔ)存水分及無(wú)機(jī)氮素養(yǎng)分，為土壤微生物提供良好的棲息環(huán)境，進(jìn)而提高土壤的硝化作用和反硝化作用，多因素協(xié)同作用最終降低土壤N2O排放量。然而，由于土壤微生物種類及群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，不同類型土壤對(duì)生物炭的響應(yīng)機(jī)制也不盡相同，關(guān)于生物炭如何調(diào)控土壤硝化反硝化相關(guān)微生物功能基因豐度來(lái)減少N2O排放仍需更深入研究。另外，截至目前，本生物炭長(zhǎng)期定位試驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行接近8周年，而有關(guān)生物炭在研究地區(qū)土壤連續(xù)施用作物所能承受的飽和點(diǎn)（或閾值）仍未發(fā)現(xiàn)，今后仍需繼續(xù)觀測(cè)，生物炭施用達(dá)到閾值后對(duì)作物產(chǎn)量和溫室氣體減排的影響也是今后需要重點(diǎn)關(guān)注的方向。

4 結(jié)論

生物炭在保墑增產(chǎn)、養(yǎng)分儲(chǔ)存以及N2O減排效應(yīng)方面具有長(zhǎng)期累積效應(yīng)。土壤保墑能力和農(nóng)田無(wú)機(jī)氮含量提高可能是施用生物炭促進(jìn)夏玉米產(chǎn)量提高的主要原因。連續(xù)多年施用生物炭通過促進(jìn)參與土壤N2O排放的硝化作用（AOA、AOB）和反硝化作用（Z）相關(guān)功能基因豐度的提高，改變了土壤氮素循環(huán)狀況，進(jìn)而起到降低潮土農(nóng)田土壤N2O排放的效果，但過量施用生物炭（11.25 t·hm-2），土壤N2O排放量則略有增加?？傮w而言，中等生物炭用量（6.75 t·hm-2）對(duì)實(shí)現(xiàn)潮土農(nóng)田夏玉米籽粒產(chǎn)量提高和土壤N2O減排效果最優(yōu)。

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Effects of Successive Biochar Addition to Soil on Nitrogen Functional Microorganisms and Nitrous Oxide Emission

DONG Cheng, CHEN ZhiYong, XIE YingXin, ZHANG YangYang, GOU PeiXin, YANG JiaHeng, MA DongYun, WANG ChenYang, GUO TianCai

(College of Agronomy, Henan Agricultural University/National Engineering Research Center for Wheat, Zhengzhou 450002)

【Objective】In recent years, the biochar has been widely concerned due to its some positive roles in soil improvement, agricultural production, and carbon sequestration and emission reduction. The purpose of this experiment was to reveal the microbiological mechanism of biochar on crop yield and nitrous oxide (N2O) emission and to provide a theoretical basis for extending application of biochar in agriculture.【Method】A fixed field experiment with successive straw-based biochar amended at 0 (BC0, CK), 2.25 (BCL, low rate), 6.75 (BCM, medium rate), and 11.25 t·hm-2(BCH, high rate) was carried out in the typical farmland with fluvo-aquic soil in Huanghuai area of China. Effect of successive biochar addition after six year on nitrous oxide (N2O) emission, nitrogen (N) functional genes and grain yield of summer maize were studied by field observation, chemical analysis and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) in laboratory.【Result】Compared to BC0, biochar application significantly increased grain yield of summer maize with the maximum value (10 811 kg·hm-2) under BCM treatment, and also significantly reduced N2O emissions with the better performance for BCM during summer maize season. Compared with BC0, biochar application could significantly improve inorganic nitrogen storage and moisture content in topsoil. In addition, following biochar application rate, the soil AOA gene abundance increased first and then decreased with the highest gene copy number in BCM treatment at the bellmouth stage and maturity stage of summer maize, while the higher AOB gene abundance under BCH and BCM treatment presented respectively at the bellmouth stage and maturity stage of summer maize. Similar to nitrification function related genes (AOA and AOB), compared with BC0, the medium and high-rate biochar application (BCM, BCH) also significantly increased the copy number of denitrification function related genes (K,S,Z) at the bellmouth stage and maturity stage of summer maize. Correlation analysis indicated that the significantly negative correlation was found between N2O emissions, NO3-, moisture content (MO) and the expression of the AOA, AOB,K,S, andZ genes in topsoil at maturity of summer maize.【Conclusion】Successive biochar addition could reduce N2O emission by increasing the gene abundance of soil N transformation, and increase crop yield by improving inorganic nitrogen storage and moisture content in topsoil. Overall, the treatment with 6.75 t·hm-2biochar led to the best comprehensive performance in the study region.

biochar; farmland; soil microbial; N functional genes; N2O emission; summer maize

2019-12-17；

2020-02-16

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD26B00）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0300707）、國(guó)家自然科學(xué)基金（41771338）

董成，E-mail：897591853@qq.com。通信作者謝迎新，E-mail：xieyingxin@henau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）