海洋來(lái)源雜色曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抗植物病原細(xì)菌活性

付兵，王美，劉建陽(yáng)，林偉，張成省，趙棟霖

海洋來(lái)源雜色曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抗植物病原細(xì)菌活性

付兵1,2，王美1，劉建陽(yáng)2，林偉2，張成省1，趙棟霖1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心，山東青島 266101；2福建省煙草公司南平市公司，福建南平 353000）

【目的】針對(duì)植物細(xì)菌病害日趨嚴(yán)重，并缺少有效防治藥劑的問題，從前期篩選獲得的具有抗菌活性且次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的海洋雜色曲霉（）D5發(fā)酵提取物中分離純化單體化合物，分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行抗菌活性評(píng)價(jià)，闡明目標(biāo)真菌的抗菌活性成分，為新穎結(jié)構(gòu)抗細(xì)菌生物農(nóng)藥的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物?！痉椒ā烤C合運(yùn)用正/反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析和半制備高效液相色譜（HPLC）等方法分離純化單體化合物，采用核磁、質(zhì)譜等現(xiàn)代波譜分析方法對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；采用微量稀釋法對(duì)化合物進(jìn)行抗6種植物病原細(xì)菌燕麥?zhǔn)乘峋ǎ⒑}卜軟腐歐文氏菌（）、密執(zhí)安棒形桿菌（）、丁香假單胞菌（）、青枯雷爾氏菌（）和野油菜黃單胞菌（）活性評(píng)價(jià)，獲得活性化合物的最小抑菌濃度（MIC）?！窘Y(jié)果】從海洋雜色曲霉D5馬鈴薯葡萄糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙酸乙酯提取物中分離鑒定了12個(gè)化合物，包括4個(gè)2-羰基-4-苯基喹啉生物堿，viridicatin（1）、3--methylviridicatin（2）、3,6--dimethylviridicatin（3）和3--methylviridicatol（4）；2個(gè)雙氧代哌嗪生物堿，（+）-cyclopenol（5）和（?）-cyclopenol（6）；3個(gè)喹唑啉fumiquinazolines生物堿及其衍生物，versicoloid A（7）、chrysopiperazine C（8）和cottoquinazoline A（9）；以及3個(gè)蒽醌類化合物，versiconol（10）、averufin（11）和noraverufanin（12）。抗菌活性結(jié)果表明，2-羰基-4-苯基喹啉生物堿3,6--dimethylviridicatin（3）具有顯著的抗植物病原細(xì)菌活性，對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的MIC分別為50和100 μg·mL-1。初步的構(gòu)效關(guān)系分析表明，C-6位置的甲氧基可能是該類化合物發(fā)揮抗植物病原細(xì)菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)?！窘Y(jié)論】海洋雜色曲霉D5代謝產(chǎn)物豐富，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的生物堿和蒽醌類化合物。從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了9個(gè)生物堿類化合物和3個(gè)蒽醌類化合物，其中3,6--dimethylviridicatin（3）對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌具有顯著的抗菌活性，有開發(fā)成為抗細(xì)菌生物農(nóng)藥的潛力。

海洋真菌；雜色曲霉；生物堿；蒽醌；結(jié)構(gòu)鑒定；植物病原細(xì)菌

0 引言

【研究意義】隨著世界人口數(shù)量的不斷增長(zhǎng)，避免饑餓、保障糧食安全顯得尤為重要，因此，需要控制植物病害的發(fā)生，增加和保證糧食的產(chǎn)量[1-2]。植物病原細(xì)菌在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)歷史上曾經(jīng)多次造成重大影響，作物細(xì)菌病害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、人口數(shù)量下降和社會(huì)動(dòng)蕩的客觀因素之一[3]。已知的植物病原細(xì)菌有200多個(gè)屬，其中最重要的包括假單胞菌屬（）、雷爾氏菌屬（）、農(nóng)桿菌屬（）、黃單胞菌屬（）、歐文氏菌屬（）、木質(zhì)部小菌屬（）和果膠桿菌屬（）[4-6]。目前防治植物細(xì)菌病害的方法主要是采用抗病品種、加強(qiáng)田間管理和輪作等方式，但效果有限[4]；防治的藥劑主要為化學(xué)農(nóng)藥，容易造成環(huán)境污染、食品安全和病原抗性等一系列問題[4,7]。一直以來(lái)，農(nóng)用硫酸鏈霉素都是我國(guó)農(nóng)作物細(xì)菌病害防治的主力軍，而隨著我國(guó)停止使用農(nóng)用硫酸鏈霉素，植物細(xì)菌病害的防治面臨巨大挑戰(zhàn)。隨著國(guó)家大力推行發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，更加注重環(huán)境友好，研發(fā)新型高效低毒的抗細(xì)菌生物農(nóng)藥迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】眾所周知，海洋真菌由于生活在高鹽、高壓、低溫、低氧、少光和寡營(yíng)養(yǎng)的海洋環(huán)境中，擁有獨(dú)特的生存策略，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化演變形成了不同于陸地真菌的特殊代謝機(jī)制，能夠產(chǎn)生種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因而近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)[8]。許多海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有明顯的抗細(xì)菌活性，顯示出了作為新型抗細(xì)菌農(nóng)藥的巨大開發(fā)潛力[9]。然而，對(duì)于這些化合物的抗細(xì)菌活性研究大多集中在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，關(guān)于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用還很少，但僅有的少量研究展現(xiàn)了極其可觀的研究?jī)r(jià)值和前景。UCHIDA等[10]從一株未鑒定的海洋真菌發(fā)酵粗提物中分離獲得了兩個(gè)聚酮類化合物chlorogentisylquinone和gentisylquinone，它們?cè)?0 μg/disk的濃度下對(duì)水稻黃單胞菌（）的抑菌圈分別為9和10 mm，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性；SWatHI等[11]對(duì)海洋來(lái)源的一株曲霉（sp.）發(fā)酵提取物進(jìn)行抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)野油菜黃單胞菌（）具有較強(qiáng)的抑菌活性，在100 μg·mL-1的濃度下抑菌圈達(dá)到12 mm，有望從中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)活性抗菌化合物；SILBER等從一株海水來(lái)源的真菌sp. KF525發(fā)酵液中分離獲得了一個(gè)二十四元大環(huán)內(nèi)酯類化合物calcaride A，其對(duì)野油菜黃單胞菌顯示了中等強(qiáng)度的抑菌活性，最小抑菌濃度（MIC）為5.5μmol·L-1[12]；隨后，該小組發(fā)現(xiàn)分離自波羅的海和南極海域的兩株Lindgomycetaceae所產(chǎn)聚酮類化合物lindgomycin和ascosetin，對(duì)野油菜黃單胞菌的IC50分別為17.8和14.8 μmol·L-1[13]；HENRIQUEZ等[14]從南極海域采集的海綿中分離獲得了101株真菌，發(fā)現(xiàn)其中11株真菌的發(fā)酵提取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌（）具有抑菌活性，22株真菌的提取物對(duì)野油菜黃單胞菌表現(xiàn)出了明顯的抑菌活性；NIU等[15]對(duì)分離自深海來(lái)源真菌sp. MCCC 3A00308的多酚類化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)spiromastols A和C表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗植物病原細(xì)菌活性，對(duì)野油菜黃單胞菌、假單胞菌（）、根癌農(nóng)桿菌（）和青枯雷爾氏菌（）的MIC達(dá)到0.25—0.5 μmol·L-1，活性強(qiáng)于陽(yáng)性藥氯霉素，具有開發(fā)成為抗細(xì)菌農(nóng)藥的潛力；WANG等[16]對(duì)一株海膽來(lái)源的亮白曲霉（）HDf2進(jìn)行研究，從中獲得了兩個(gè)具有抗菌活性的刺孢青霉酸類化合物spiculisporic acid F和G，它們對(duì)青枯雷爾氏菌顯示了中等強(qiáng)度的抑菌活性；CHEN等[17]對(duì)一株海藻來(lái)源的格孢腔菌（sp.）所產(chǎn)混源萜類次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)pleosporallins D和E對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌顯示了中等活性的抑菌活性，MIC為9.48 μg·mL-1?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組在前期研究中，從山東沿海和海南海洋特殊紅樹林生境中分離純化了200余株海洋真菌，通過(guò)初步的形態(tài)學(xué)排重后，對(duì)其進(jìn)行了種屬鑒定。對(duì)其中近80株真菌進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，測(cè)試其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物的抗植物病原細(xì)菌活性，篩選得到多株抗菌活性顯著的海洋真菌[18-19]。其中，一株海藻來(lái)源的雜色曲霉（）D5，其發(fā)酵提取物對(duì)青枯雷爾氏菌等植物病原細(xì)菌表現(xiàn)出了明顯的抗菌活性。HPLC指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，D5次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富，結(jié)構(gòu)類型多樣，產(chǎn)量較大，有望從中發(fā)現(xiàn)抗菌活性化合物?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從雜色曲霉D5發(fā)酵產(chǎn)物中分離、純化單體化合物，并采用多種譜學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)而對(duì)單體化合物進(jìn)行抗植物病原細(xì)菌活性測(cè)試并分析構(gòu)效關(guān)系，闡明目標(biāo)菌株的活性成分及活性化合物的關(guān)鍵作用基團(tuán)，為海洋真菌來(lái)源高效低毒生物農(nóng)藥的研發(fā)提供化合物基礎(chǔ)。

4.創(chuàng)新活動(dòng)載體。要提高黨組織的凝聚力和戰(zhàn)斗力，創(chuàng)新活動(dòng)載體、保證活動(dòng)成效十分關(guān)鍵。結(jié)合社會(huì)組織主要分布在油田各行各業(yè)、在職黨員具有較強(qiáng)的業(yè)務(wù)知識(shí)等特點(diǎn)，引導(dǎo)社會(huì)組織“適時(shí)、適宜、適度”地參與油田各項(xiàng)建設(shè)，引導(dǎo)他們參與油田的各項(xiàng)便民利民服務(wù)，如定期不定期舉辦法律、醫(yī)療保健，家庭理財(cái)?shù)确矫娴淖稍兎?wù)等，并通過(guò)建立服務(wù)志愿者隊(duì)伍，把參與結(jié)果作為吸收入黨、評(píng)選先進(jìn)的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)，吸引更多的新社會(huì)組織從業(yè)人員投入到油田發(fā)展，使越來(lái)越多的員工群眾從中受益。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2019年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心/灘涂生物資源保護(hù)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)完成。

Monographic report: Screening and prevention of chronic kidney disease in Shanghai

1.1 儀器與試劑

核磁共振波譜儀Agilent DD2 500（美國(guó)安捷倫公司）；質(zhì)譜儀ESI-MS Q-TOF Ultima Global GAA076（美國(guó)Waters公司）和Q-TOF maXis（美國(guó)Bruker公司）；高效液相色譜儀（日本日立公司）；C18柱：（5 μm，10 mm×250 mm，美國(guó)Waters公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Hei-VAP Industrial-glassware set R（德國(guó)Heidoph公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；正相柱層析硅膠100—200、200—300目（青島海洋化工廠）；凝膠Sephadex LH-20（美國(guó)GE公司）；正相TLC預(yù)制板（煙臺(tái)匯有硅膠開發(fā)有限公司）；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；HPLC用甲醇和乙腈為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)），其他試劑均為分析純。

1.2 菌株發(fā)酵與培養(yǎng)

化合物3為白色晶體，ESIMS質(zhì)譜中在m/z 282.1 [M + H]+處給出分子離子峰，結(jié)合氫譜和碳譜，推測(cè)分子式為C17H15NO3，不飽和度為11。仔細(xì)分析其1H-NMR和13C NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)3的核磁數(shù)據(jù)與2十分相似。與2相比，3少了1個(gè)芳香氫信號(hào)，同時(shí)增加了1個(gè)甲氧基信號(hào)H3.67，C55.5，提示該分子中的1個(gè)芳香氫被甲氧基取代。經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物3為3,6--dimethylviridicatin[23]（圖1）。

1.2.2 菌株發(fā)酵與培養(yǎng) 500 mL的發(fā)酵瓶中倒入250 mL馬鈴薯葡萄糖水（PDW）培養(yǎng)基，滅菌。挑取生長(zhǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上的目標(biāo)菌株加入其中，共發(fā)酵10瓶。搖床（180 r/min，28℃）振蕩培養(yǎng)72 h，獲得種子液。將400 mL PDW培養(yǎng)基加入容量為1 L的發(fā)酵瓶中，加入粗海鹽使其濃度為3%，滅菌，共發(fā)酵80 L。取種子液5 mL分別加入400 mL PDW培養(yǎng)基中，于28℃靜置培養(yǎng)30 d。

加強(qiáng)“吃住行游購(gòu)?qiáng)省庇布O(shè)施建設(shè)，優(yōu)化健康旅游服務(wù)軟環(huán)境，構(gòu)筑全區(qū)域、全方位、全覆蓋、全過(guò)程的配套服務(wù)體系。推進(jìn)“互聯(lián)網(wǎng)+健康旅游”，打造智慧旅游服務(wù)，實(shí)現(xiàn)信息數(shù)據(jù)共享，建立標(biāo)準(zhǔn)化電子健康檔案，保障游客享受旅游服務(wù)的延續(xù)性。構(gòu)建“快進(jìn)慢游”交通網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用北斗、大數(shù)據(jù)分析等技術(shù)，開展旅游交通精準(zhǔn)信息服務(wù)，依托高鐵、民航、高等級(jí)公路等建立“快進(jìn)”網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)通達(dá)性和便捷性；建設(shè)風(fēng)景道、自行車道、步行道等“慢游”設(shè)施，打造健康主題線路[17]。

1.3 化合物分離純化

化合物9為淡黃色粉末，ESIMS：m/z 430.2 [M + H]+，結(jié)合其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C23H19N5O4。1H-NMR在H8.10（1H，d，=8.0 Hz），7.83（1H，t，=7.5 Hz），7.72（1H，d，=8.0 Hz），7.52（1H，t，=7.0 Hz）給出信號(hào)，以及7.39（1H，d，=7.5 Hz），7.27（2H，m），7.07（1H，dd，=7.0，4.5 Hz）給出信號(hào)，提示分子中存在2個(gè)1,2-二取代苯環(huán)。13C-NMR中C167.8、165.6和159.4給出3個(gè)酰胺碳信號(hào)；低場(chǎng)區(qū)給出13個(gè)芳香碳信號(hào)；此外還給出了4個(gè)次甲基信號(hào)，1個(gè)亞甲基信號(hào)和1個(gè)甲基信號(hào)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物9為cottoquinazoline A[26]（圖1）。

1.4 抗菌活性測(cè)定

病原細(xì)菌：燕麥?zhǔn)乘峋ǎ?、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（）、密執(zhí)安棒形桿菌、丁香假單胞菌（）、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌。

Divas’ Dream超薄三問腕表采用極其纖薄的37毫米18K玫瑰金表殼，精巧靈動(dòng)，而圓潤(rùn)飽滿的扇形表耳則平添了溫婉韻致。表耳上排布著明亮式切割鉆石更顯雍容矚目。18K玫瑰金表冠上鑲嵌著華美的多面切割鉆石，與柔和溫婉的線條相映成輝。這款精美的珠寶腕表，傳承了Divas’ Dream系列以美學(xué)技法與精致格調(diào)為主題不斷演化的魅力，自然需配以華彩奪目的表盤。

采用微量稀釋法，測(cè)試化合物對(duì)幾種植物病原細(xì)菌的MIC[20]。病原菌振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，并稀釋至106cfu/mL。將待測(cè)化合物用DMSO配成10 mg·mL-1母液。每種病原菌采用單獨(dú)的96孔板進(jìn)行測(cè)試。在96孔板第1列的第1孔加198 μL菌液，余下2—8孔各加100 μL菌液。吸取2 μL化合物母液加入第1孔，混合均勻。采用二倍稀釋法將1—8孔依次稀釋，即從第一孔中吸取100 μL含藥菌液加入第2孔混勻后，從第2孔吸取100 μL含藥菌液加入第3孔，并混勻，以此類推。到第8孔混勻后，移除100 μL含藥菌液，使每孔都含有100 μL含藥菌液，后再每孔加入100 μL菌液，使每孔體積達(dá)到200 μL。每個(gè)化合物重復(fù)3列。用無(wú)菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照，并設(shè)立未加化合物的菌液對(duì)照，DMSO作陰性對(duì)照，空白對(duì)照和陰性對(duì)照分別做3個(gè)孔，硫酸鏈霉素做陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試方法與化合物相同。將96孔板放入生物培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀600 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，并結(jié)合肉眼觀察，以吸光度出現(xiàn)大幅度變化，且最后一個(gè)澄清的孔對(duì)應(yīng)的濃度，作為化合物MIC值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H12.11（1H，s，NH-1），7.53（2H，t，=7.5 Hz，H-13，H-15），7.47（1H，t，=7.5 Hz，H-14），7.41（1H，d，=8.5 Hz，H-8），7.37（2H，m，H-12，H-16），7.07（1H，dd，=8.5，2.5 Hz，H-7），6.65（1H，d，=2.5 Hz，H-5），3.83（3H，s，3-OCH3），3.67（3H，s，6-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C160.3（C-2），155.2（C-6），145.7（C-3），138.9（C-4），133.5（C-11），129.9（C-9），129.3（C-12，C-16），128.5（C-13，C-15），128.3（C-14），121.7（C-10），117.5（C-7），117.0（C-8），108.6（C-5），60.3（3-OCH3），55.5（6-OCH3）；ESIMS：m/z 282.1 [M + H]+。

（3）注意整個(gè)施工過(guò)程的維護(hù)工作，尤其是進(jìn)行防滲漏施工時(shí)，涂刷好防水涂料后必須要進(jìn)行一定的防護(hù)，防止后期出現(xiàn)其他問題，影響施工質(zhì)量。

12月13日上午，省自然資源廳召開慶祝改革開放40周年座談會(huì)，回顧自然資源工作歷程，展望發(fā)展前景。省自然資源廳黨組書記、廳長(zhǎng)李琥參加會(huì)議并講話。廳一級(jí)巡視員王桂鵬主持。廳領(lǐng)導(dǎo)、廳機(jī)關(guān)和各直屬事業(yè)單位主要負(fù)責(zé)同志、退休老干部及基層代表共130余人參加會(huì)議。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）：H7.34（2H，m，H-7，H-8），7.31（1H，d，=8.0 Hz，H-15），7.24（1H，d，=8.0 Hz，H-6），7.11（1H，m，H-5），6.87（1H，m，H-14），6.80—6.82（2H，m，H-12，H-16）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）：C160.5（C-2），158.7（C-13），143.0（C-3），136.1（C-4），134.3（C-9），130.6（C-11），128.0（C-15），127.3（C-7），126.3（C-5），123.8（C-6），123.0（C-10），122.1（C-16），117.9（C-12），116.5（C-8），116.0（C-14）；ESIMS：m/z 254.1 [M + H]+。

他在云游時(shí)曾發(fā)現(xiàn)，江浙一帶部分僧人宗教生活的全部就是幫人做法事，明碼標(biāo)價(jià)，談攏動(dòng)身，缽滿盈滿的他們不喜歡公開，最直接的一條理由無(wú)關(guān)貪腐，而是數(shù)目之咋舌，可能會(huì)帶來(lái)競(jìng)爭(zhēng)，“都來(lái)當(dāng)和尚怎么辦？”

化合物2為白色晶體，ESIMS：m/z 252.1 [M + H]+，結(jié)合其氫譜和碳譜，推測(cè)分子式為C16H13NO2，不飽和度為11。1H NMR譜H12.66處給出1個(gè)酰胺氫特征信號(hào)，低場(chǎng)區(qū)給出了9個(gè)芳香氫信號(hào)，以上信息結(jié)合TLC特征，推測(cè)2與1為同系列化合物。在13C-NMR中，C161.1提示酰胺碳的存在；在低場(chǎng)區(qū)給出了14個(gè)碳信號(hào)，包括5個(gè)季碳和9個(gè)叔碳；C60.4處的信號(hào)提示分子中存在1個(gè)甲氧基。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比，確定化合物2為3-- methylviridicatin[22]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H12.66（1H，s，NH-1），7.53（2H，t，=7.5 Hz，H-13，H-15），7.49（1H，d，=7.5 Hz，H-14），7.45（1H，t，=7.5 Hz，H-7），7.38（2H，d，=7.5 Hz，H-12，H-16），7.23（1H，d，=7.5 Hz，H-5），7.12（1H，t，=7.5 Hz，H-6），3.85（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C161.1（C-2），145.2（C-3），139.4（C-4），135.5（C-9），133.5（C-11），129.4（C-12，C-16），128.8（C-14），128.4（C-13，C-15），128.2（C-7），126.4（C-5），122.6（C-6），120.9（C-10），116.0（C-8），60.4（3-OCH3）；ESIMS：m/z 252.1 [M + H]+。

1.2.1 菌株來(lái)源 海洋真菌分離自山東青島沿海一種未鑒定的海藻，通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定方法確定為雜色曲霉D5。菌種于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 15386。

化合物1為白色晶體，質(zhì)譜ESIMS給出分子離子峰m/z 254.1 [M + H]+，結(jié)合其氫譜和碳譜，推測(cè)其分子式為C15H11NO3，不飽和度為11。在1H NMR中給出了8個(gè)芳香氫信號(hào)，提示分子中存在2個(gè)苯環(huán)。在13C NMR中，低場(chǎng)區(qū)給出了14個(gè)芳香碳和烯碳信號(hào)以及1個(gè)酰胺碳信號(hào)C160.5，其中包括2個(gè)連氧的sp2雜化碳信號(hào)C158.7和143.0，結(jié)合其分子式，提示分子中存在2個(gè)羥基。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物viridicatol數(shù)據(jù)一致[21]，故鑒定化合物1為 viridicatol（圖1）。

除了在磷石膏綜合利用方面的協(xié)同發(fā)展外，何光亮還提到兩家企業(yè)還會(huì)在磷礦石開采進(jìn)行協(xié)同發(fā)展，他說(shuō)：“把開磷的采礦技術(shù)和甕福的選礦技術(shù)結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)造的價(jià)值將成倍增長(zhǎng)。”同時(shí)，甕福集團(tuán)的氟提取技術(shù)也會(huì)在開磷集團(tuán)應(yīng)用，提高開磷集團(tuán)在氟化工方面的效益。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.07（1H，s，NH-1），9.64（1H，s，15-OH），7.41（1H，t，=7.5 Hz，H-7），7.34（1H，d，=7.5 Hz，H-8），7.30（1H，t，=7.5 Hz，H-13），7.09（1H，t，=7.5 Hz，H-6），7.04（1H，d，=7.5 Hz，H-5），6.85（1H，d，=7.5 Hz，H-14），6.71（1H，d，=7.5 Hz，H-12），6.68（1H，s，H-16），3.69（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C158.5（C-2），157.3（C-15），144.9（C-3），137.6（C-4），135.7（C-9），134.7（C-11），129.5（C-13），128.6（C-7），125.8（C-5），121.9（C-6），119.9（C-10），119.7（C-12），116.0（C-16），115.1（C-8），115.0（C-14），59.5（3-OCH3）；ESIMS：m/z 268.1 [M + H]+。

化合物5為白色晶體，ESIMS：m/z 311.1 [M + H]+，結(jié)合化合物1H和13C NMR，推斷分子式為C17H14N2O4，不飽和度為12。1H-NMR中給出了8個(gè)芳香氫信號(hào)，1個(gè)連氧次甲基H4.07和1個(gè)氮甲基信號(hào)H3.19；13C-NMR中給出12個(gè)芳香碳信號(hào)包括1個(gè)連氧芳香碳信號(hào)，提示分子中存在2個(gè)苯環(huán)；另外還給出2個(gè)酰胺碳信號(hào)C168.6和168.4以及1個(gè)氮甲基碳信號(hào)C31.7。以上數(shù)據(jù)表明化合物5為dioxopiperazine類衍生物，經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物5為（+）-cyclopenol[24]（圖1）。

化合物4為白色粉末，ESIMS：m/z 268.1 [M + H]+，結(jié)合氫譜和碳譜，推測(cè)其分子式為C16H13NO3。1H-NMR中H12.07和9.64處給出2個(gè)活潑氫信號(hào)，分別對(duì)應(yīng)酰胺氫和羥基氫；低場(chǎng)區(qū)給出8個(gè)芳香氫信號(hào)；H3.69信號(hào)提示分子中存在1個(gè)甲氧基。1C-NMR中C158.5和157.3證明了酰胺碳和連氧芳香碳的存在；C59.5證明了甲氧基的存在。化合物4與2十分相似，不同之處在于多了1個(gè)苯環(huán)上的羥基。經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，確定化合物4為3--methylviridicatol[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）：H7.55（1H，m，H-8），7.15（3H，m，H-6，H-7，H-9），7.01（1H，t，=7.5 Hz，H-17），6.71（1H，d，=7.5 Hz，H-16），6.12（2H，m，H-14，H-18），5.48（1H，s，15-OH），4.07（1H，s，H-10），3.19（3H，s，H-19）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）：C168.6（C-2），168.4（C-5），158.4（C-15），136.4（C-11），134.0（C-8），133.5（C-13），132.2（C-6），130.2（C-17），128.0（C-12），126.1（C-7），122. 3（C-9），118.5（C-18），117.0（C-16），113.9（C-14），71.6（C-3），65.9（C-10），31.7（C-19）；ESIMS：m/z 311.1 [M + H]+。

化合物6為白色晶體，HRESIMS：m/z 311.1028 [M + H]+，分子式為C17H14N2O4，不飽和度為12。1H NMR中H7.52（1H，dt，=8.0，1.5 Hz），7.14（1H，d，=8.0 Hz），7.09（1H，dt，=8.0，1.0 Hz），7.01（1H，dd，=8.0，1.0 Hz）提示分子中存在1,2-二取代苯環(huán)；H6.97（1H，t，=8.0 Hz），6.66（1H，dd，=8.0，1.5 Hz），6.11（1H，m），6.00（1H，d，=8.0 Hz）提示分子中存在1,3-二取代苯環(huán)；13C NMR中給出2個(gè)酰胺碳信號(hào)C166.0和165.4，1個(gè)氮甲基信號(hào)即與氫譜對(duì)應(yīng)的芳香碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與化合物5極為相似，且分子量相同，仔細(xì)與文獻(xiàn)比對(duì)其核磁數(shù)據(jù)，確定化合物6為（-）-cyclopenol[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H7.52（1H，dt，=8.0，1.5 Hz，H-8），7.14（1H，d，=8.0 Hz，H-9），7.09（1H，dt，=8.0，1.0 Hz，H-7），7.01（1H，dd，=8.0，1.0 Hz，H-6），6.97（1H，t，=8.0 Hz，H-17），6.66（1H，dd，=8.0，1.5 Hz，H-16），6.11（1H，m，H-14），6.00（1H，d，=8.0 Hz，H-18），4.23（1H，s，H-10），3.06（3H，s，H-19）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C166.0（C-2），165.4（C-5），156.9（C-15），135.1（C-11），132.4（C-8），132.3（C-13），130.5（C-6），128.9（C-17），126.5（C-12），124.3（C-7），121.1（C-9），117.0（C-18），115.7（C-16），112.8（C-14），70.1（C-3），63.8（C-10），30.9（C-19）；HRESIMS：m/z 311.1028 [M + H]+，333.0849 [M + Na]+。

化合物7為黃色粉末，結(jié)合其ESIMS、1H和13C NMR，判斷分子式為C19H25N3O4，不飽和度為9。1H NMR中H7.54（1H，s）給出1個(gè)NH信號(hào)，6.16（1H，d，=6.0 Hz，H-8），5.77（1H，s，H-11），5.49（1H，d，=6.0 Hz，H-9），給出3個(gè)芳香氫信號(hào)；H5.10給出1個(gè)連氮?dú)湫盘?hào)；H3.69給出1個(gè)甲氧基氫信號(hào)；H1.13、1.11、0.98和0.84處給出4個(gè)甲基信號(hào)。13C-NMR給出2個(gè)酰胺碳信號(hào)C167.3和161.4，4個(gè)季碳信號(hào)，7個(gè)次甲基碳信號(hào)，1個(gè)亞甲基碳信號(hào)，1個(gè)甲氧基碳信號(hào)和4個(gè)甲基碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的versicoloid A極為相似，仔細(xì)對(duì)比核磁數(shù)據(jù)，確定化合物7為versicoloid A[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H7.54（1H，s，NH-2），6.16（1H，d，=6.0 Hz，H-8），5.77（1H，s，H-11），5.49（1H，d，=6.0 Hz，H-9），5.10（1H，d，=5.5 Hz，H-15），4.46（1H，s，H-3），3.69（3H，s，H-20），2.62（1H，m，H-16），2.26（1H，m，H-21），1.20（2H，m，H-17），1.13（3H，d，=7.5 Hz，H-19），1.11（3H，d，=7.0 Hz，H-23），0.98（3H，d，=7.0 Hz，H-22），0.84（3H，t，=7.0 Hz，H-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C167.3（C-1），161.4（C-13），159.6（C-6），156.8（C-10），152.9（C-4），144.3（C-8），115.5（C-9），109.3（C-12），94.8（C-11），60.6（C-15），59.2（C-3），55.1（C-20），36.9（C-16），32.4（C-21），23.0（C-17），20.0（C-22），17.8（C-23），15.8（C-19），12.0（C-18）；ESIMS：m/z 360.2 [M + H]+。

化合物8為白色粉末，根據(jù)HRESIMS數(shù)據(jù)，判斷分子式為C20H27N3O4?；衔?的核磁數(shù)據(jù)與7很相似，主要的區(qū)別在于2個(gè)化合物的1,2,4-三取代芳香環(huán)（8：C/HC/H-7，C/H-8，C/H-10，129.6/7.65， 125.1/7.38，106.4/7.657：C/H-8，C/H-9，C/H-11，144.3/6.16，115.5/5.49，94.8/5.77）。同時(shí)，化合物8中多了1個(gè)甲氧基信號(hào)C/HC/H-7，51.1/3.92。進(jìn)一步仔細(xì)分析其核磁數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物8為chrysopiperazine C[25]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H7.65（2H，d，=9.0 Hz，H-7，H-10），7.38（1H，d，=9.0 Hz，H-8），6.99（1H，s，NH-2），5.23（1H，d，=9.0 Hz，H-14），3.92（3H，s，H-22），3.27（3H，s，H-23），2.96（1H，m，H-18），2.53（1H，m，H-15），1.27（1H，m，H-20b），1.23（3H，m，H-17），1.10（3H，d，= 7.0 Hz，H-19），1.04（1H，m，H-20a），0.95（6H，m，H-16，H-21）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C170.3（C-1），161.5（C-12），159.2（C-9），144.9（C-4），140.6（C-6），129.6（C-7），125.1（C-8），121.5（C-11），106.4（C-10），88.7（C-3），60.9（C-14），56.0（C-22），51.1（C-23），36.4（C-18），33.6（C-15），25.3（C-20），20.2（C-17），19.8（C-16），12.6（C-21），11.1（C-19）。HRESIMS：m/z 374.2078 [M + H]+，396.1897 [M + Na]+。

將發(fā)酵提取物進(jìn)行減壓硅膠柱層析，以乙酸乙酯-石油醚（0—100%）、甲醇-乙酸乙酯（0—100%）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分為7個(gè)組分（Fr.1—Fr.7）。Fr.2（1.6 g）經(jīng)ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫（甲醇-水，60%—100%），后經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）得到Fr.2-1—Fr.2-5。Fr.2-5經(jīng)反相HPLC（70%乙腈-水加0.1%三氟乙酸，2 mL·min-1）純化制備后得到11（28.1 mg）和12（11.5 mg）。Fr.3（4.5 g）經(jīng)正相硅膠柱層析（乙酸乙酯-石油醚，5%—100%）分離，后經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫，流動(dòng)相采用30%—100%甲醇-水，得到Fr.3-1—Fr.3-6。Fr.3-2經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1），得到6（236.3 mg）。Fr.3-4經(jīng)過(guò)與Fr.3-2相同的分離步驟后，得到1（38.1 mg）。Fr.3-5經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1），后經(jīng)過(guò)100﹕1二氯甲烷/甲醇正相硅膠柱層析純化，得到Fr.3-5-1—Fr.3-5-3。Fr.3-5-1經(jīng)HPLC（60%甲醇-水，2 mL·min-1）分離純化后得到7（46.7 mg）。Fr.3-5-2和Fr.3-5-3分別在二氯甲烷-甲醇=1/1溶液中重結(jié)晶，得到2（13.6 mg）和3（5.4 mg）。Fr.3-6經(jīng)過(guò)反復(fù)的正相硅膠柱層析，最后通過(guò)HPLC制備，流動(dòng)相為75%甲醇-水，得到8（14.0 mg）。Fr.4（3.3 g）經(jīng)過(guò)30%—90%甲醇-水ODS反相硅膠柱梯度洗脫，后經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）純化，得到Fr.4-1—Fr.4-4。Fr.4-2在二氯甲烷-甲醇混合液中重結(jié)晶，得到5（118.4 mg）。Fr.4-3經(jīng)過(guò)HPLC純化，流動(dòng)相為45%甲醇-（水+0.1%三氟乙酸），得到4（5.1 mg）。Fr.4-3經(jīng)HPLC 50%甲醇-水制備，得到10（35.8 mg）。Fr.5（2.4 g）經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫（甲醇-水，30%—90%），然后通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）分離，最后經(jīng)反相HPLC（55%甲醇-水，2 mL·min-1）制備，得到9（48.0 mg）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H9.05（1H，d，=4.0 Hz，NH-2），8.10（1H，d，=8.0 Hz，H-10），7.83（1H，t，=7.5 Hz，H-8），7.72（1H，d，=8.0 Hz，H-7），7.52（1H，t，=7.0 Hz，H-9），7.39（1H，d，=7.5 Hz，H-27），7.27（2H，m，H-24，H-25），7.07（1H，dd，=7.0，4.5 Hz，H-26），5.57（1H，s，17-OH），5.24（2H，m，H-3，H-14），4.85（1H，s，H-18），4.07（1H，q，=6.5 Hz，H-20），3.05（1H，dd，=15.0，5.0 Hz，H-15b），2.40（1H，d，=15.0 Hz，H-15a），1.47（3H，d，=6.5 Hz，H-29）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C167.8（C-1），165.6（C-21），159.4（C-12），147.5（C-4），146.7（C-6），139.8（C-28），136.0（C-23），134.5（C-8），129.3（C-25，C-26），127.3（C-7），127.2（C-9），126.2（C-10），124.4（C-27），120.7（C-11），113.8（C-24），79.8（C-18），74.1（C-17），65.5（C-3），63.4（C-20），53.9（C-14），36.1（C-15a），14.8（C-29）；ESIMS：m/z 430.2 [M + H]+。

發(fā)酵結(jié)束后，用紗布將菌體和發(fā)酵液過(guò)濾分開，發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取兩遍，濃縮至干；菌體采用乙酸乙酯浸泡菌體一次，后采用二氯甲烷﹕甲醇=1﹕1浸泡一遍，濃縮后，將未干的溶液用乙酸乙酯萃取3遍，濃縮至干，與菌液提取物合并，得到發(fā)酵提取物26.8 g。

化合物10為橘紅色粉末，質(zhì)譜中在m/z 361.1處給出 [M + H]+分子離子峰，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C18H16O8，不飽和度為11。其HPLC吸收與TLC特征提示該10為蒽醌類化合物。1H-NMR中低場(chǎng)區(qū)給出3個(gè)芳香氫信號(hào)，高場(chǎng)區(qū)給出1個(gè)亞甲基、1個(gè)次甲基信號(hào)和1個(gè)甲基信號(hào)，同時(shí)給出2個(gè)連氧亞甲基信號(hào)。13C-NMR中給出2個(gè)羰基碳信號(hào)，12個(gè)芳香碳信號(hào)，2個(gè)連氧碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物10為versiconol[27]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.74（1H，s，1-OH），12.09（1H，s，8-OH），11.17（2H，s，3-OH，6-OH），7.14（1H，s，H-5），7.02（1H，s，H-4），6.50（1H，s，H-7），3.67（2H，m，H-1′），3.45（1H，m，H-2′），3.28（2H，m，H-4′），1.90（2H，s，H-3′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C189.0（C-9），181.3（C-10），165.0（C-6），164.2（C-8），163.5（C-3），163.1（C-1），135.0（C-11），132.2（C-14），122.9（C-2），108.8（C-4），108.6（C-5，C-8a），108.2（C-9a），108.1（C-7），62.8（C-1′），60.1（C-4′），35.3（C-2′），32.6（C-3′）；ESIMS：m/z 361.1 [M + H]+。

(1)標(biāo)題序號(hào)：引言部分序號(hào)為0。正文標(biāo)題序號(hào)分別用阿拉伯?dāng)?shù)字依次編寫，如“1”“1.1”“1.1.1”,四級(jí)以下可用(1)，①等劃分層次。

化合物11為橘紅色粉末，通過(guò)HRESIMS：m/z 367.0819 [M - H]?，判斷分子式為C20H16O7，不飽和度為13。其HPLC吸收提示11與10為同系列蒽醌化合物，但不飽和度和碳個(gè)數(shù)均多了2。1H-和3C-NMR顯示2個(gè)化合物蒽醌骨架一致，區(qū)別僅在于11的分子中多了2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)（C101.1（C-5′），66.1（C-1′），35.2（C-2′），27.4（C-4′），26.9（C-6′），15.4（C-3′）H5.15（H-1′），1.40—1.92（H-2′，3′，4′），1.50（H-6′））。仔細(xì)分析其核磁數(shù)據(jù)，確定化合物11為averufin[27]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.29（1H，s，1-OH），11.92（1H，s，8-OH），11.30（1H，s，6-OH），6.95（1H，s，H-5），6.83（1H，s，H-4），6.46（1H，s，H-7），5.15（1H，s，H-1′），1.40—1.92（6H，m，H-2′，3′，4′），1.50（3H，s，H-6′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C188.6（C-9），180.5（C-10），165.2（C-8），164.2（C-1），159.8（C-6），158.1（C-3），134.6（C-4a），132.9（C-10a），115.9（C-2），108.9（C-5），108.4（C-9a），108.2（C-8a），107.9（C-7），107.1（C-4），101.1（C-5′），66.1（C-1′），35.2（C-2′），27.4（C-4′），26.9（C-6′），15.4（C-3′）。HRESIMS：m/z 367.0819 [M - H]?。

中藥學(xué)是研究中藥的基本理論和常用中藥的性能、功效與臨床應(yīng)用規(guī)律等知識(shí)的一門學(xué)科。中藥學(xué)在高等中醫(yī)藥院校課程體系中具有承前啟后的獨(dú)特作用和地位[1]，是學(xué)生由理論基礎(chǔ)邁向臨證實(shí)踐的橋梁課，其授課水平將對(duì)學(xué)生今后的從醫(yī)之路產(chǎn)生較為直接而深遠(yuǎn)的影響。中藥學(xué)體系完整、內(nèi)容豐富、縱貫古今，對(duì)主講教師而言是一個(gè)可以“大有作為”的重要平臺(tái)。筆者認(rèn)為，在著力提升中藥學(xué)教學(xué)質(zhì)量的問題上，授課教師應(yīng)盡全力打造精彩、非凡、卓越的中藥課堂，使學(xué)生收獲知識(shí)、思維、技能、文化等多方面、多層次的情感體驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)專業(yè)教育與德育的“雙豐收”，為進(jìn)一步提升教育教學(xué)水平提供有益的嘗試和探索。

化合物12為橘紅色粉末，通過(guò)高分辨質(zhì)譜，推斷其分子式為C20H18O7，不飽和度為12。仔細(xì)分析12的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其也是一個(gè)蒽醌類化合物，比10多了1個(gè)不飽和度，碳個(gè)數(shù)比10多了2個(gè)，提示10比12多了1個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)?；衔?2蒽醌骨架的核磁數(shù)據(jù)與10十分相似，不同之處在于兩個(gè)化合物的高場(chǎng)區(qū)。經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物12為noraverufanin[28]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.78（1H，s，1-OH），12.10（1H，s，8-OH），11.27（1H，s，6-OH），10.72（1H，s，3-OH），7.11（1H，s，H-5），7.09（1H，s，H-4），6.58（1H，s，H-7），4.96（1H，d，=14.0 Hz，H-1′），3.61（1H，m，H-5′），1.30—1.97（6H，m，H-2′，3′，4′），1.16（3H，d，=7.5 Hz，H-6′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C188.8（C-9），181.1（C-10），165.1（C-6），164.2（C-8），162.7（C-3），161.6（C-1），134.9（C-10a），133.3 （C-4a），120.0（C-2），108.8（C-5），108.7（C-9a），108.7（C-8a），108.4（C-4），108.1（C-7），74.6（C-1′），73.0（C-5′），32.4（C-2′），28.2（C-4′），23.4（C-3′），21.9（C-6′）。HRESIMS：m/z 369.0987 [M - H]?。

2.2 抗菌活性

對(duì)化合物1—12進(jìn)行抗燕麥?zhǔn)乘峋}卜軟腐歐文氏菌密執(zhí)安棒形桿菌丁香假單胞菌青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在初篩濃度為200和100 μg·mL-1濃度下，僅3,6--dimethylviridicatin（3）對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌表現(xiàn)出了顯著的抗植物病原細(xì)菌活性。進(jìn)一步測(cè)試其MIC，化合物3對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的MIC分別為50和100 μg·mL-1（表1），陽(yáng)性藥硫酸鏈霉素的MIC為25 μg·mL-1。3,6--dimethylviridicatin（3）對(duì)其余4種植物病原細(xì)菌沒有明顯的抑菌活性。

圖1 化合物1—12的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

3 討論

本研究從一株海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物中分離鑒定了12個(gè)化合物，包括4個(gè)2-羰基-4-苯基喹啉生物堿（1—4）、2個(gè)雙氧代哌嗪生物堿（5—6）、3個(gè)喹唑啉fumiquinazolines生物堿及其衍生物（7—9）和3個(gè)蒽醌類化合物（10—12）。曲霉是重要的海洋真菌類群，在海洋真菌中占有很大比例，天然產(chǎn)物研究最多的海洋真菌是海洋曲霉。海洋曲霉源天然產(chǎn)物的研究始于1992年，NUMATA等[29]報(bào)道了首例海洋曲霉來(lái)源的新天然產(chǎn)物fumiquinazolines A-C，至2014年8月，已報(bào)道512個(gè)海洋曲霉來(lái)源的新天然產(chǎn)物。此后，越來(lái)越多的化合物從海洋曲霉中分離出來(lái)。2015—2018年，共報(bào)道了389個(gè)海洋曲霉來(lái)源新化合物，這不包括紅樹林來(lái)源的海洋曲霉，這些化合物結(jié)構(gòu)類型多樣，包括聚酮、生物堿、萜類、甾體、肽類等，且有多種生物活性，包括抗菌、細(xì)胞毒、抗氧化等[8,30-32]。本文所獲得的4種結(jié)構(gòu)類型化合物在海洋曲霉中均有過(guò)報(bào)道。

自然界中的2-羰基-4-苯基喹啉生物堿只由真菌產(chǎn)生，生源途徑是由鄰氨基苯甲酸衍生而來(lái)，目前發(fā)現(xiàn)的該類化合物大部分來(lái)自于青霉菌，亞熱帶、溫帶、寒帶環(huán)境的青霉中均發(fā)現(xiàn)了該類化合物的存在，其中也包括海洋青霉[33]。2-羰基-4-苯基喹啉生物堿的生物活性報(bào)道較少，多數(shù)研究沒有發(fā)現(xiàn)其明顯的生物活性，但該類化合物抗腫瘤活性顯著。Wei等[21]從一株紅樹來(lái)源的青霉sp.發(fā)酵提取物中分離鑒定了一個(gè)新的2-羰基-4-苯基喹啉生物堿viridicatol，通過(guò)核磁及單晶衍射確定了其結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、人白血病細(xì)胞K56具有顯著的抑制活性，IC50在16.5—80.0 μg·mL-1；He等[34]從一株海水來(lái)源的楊奇青霉（）中獲得了4種化合物，測(cè)試了它們對(duì)8種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，其中3*,4*-dihydroxy-4-(4′-methoxyphenyl)- 3,4-dihydro-2(1)- quinolinone對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3表現(xiàn)出了中等的毒性，quinolinonepeniprequinolone表現(xiàn)出了強(qiáng)的非選擇性細(xì)胞毒活性。也有研究報(bào)道了2-羰基-4-苯基喹啉生物堿對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌中等的抑制活性，Pan等[35]從螃蟹來(lái)源的雜色曲霉XZ-4發(fā)酵物中分離鑒定出3,6-odimethylviridicatin和9-hydroxy-3- methoxyviridicatin，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)大腸桿菌（）具有中等的抗菌活性，MIC為32 μg·mL-1。在本研究中所獲得的4個(gè)2-羰基-4-苯基喹啉生物堿中，只有3,6--dimethylviridicatin（3）表現(xiàn)了顯著的抗植物病原細(xì)菌活性。分析其結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，3與1、2、4結(jié)構(gòu)上的不同之處主要體現(xiàn)在C-6多了1個(gè)甲氧基，該甲氧基可能是化合物發(fā)揮抗植物病原細(xì)菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)。同時(shí)，文獻(xiàn)中報(bào)道了9-hydroxy-3- methoxyviridicatin對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，表明8-OH可能也是該類化合物發(fā)揮抗菌作用的重要基團(tuán)。

表1 化合物3對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌抑菌數(shù)據(jù)

未加藥菌液OD600分別為0.4733（青枯雷爾氏菌）、1.1362（野油菜黃單胞菌）The OD600of un-treated bacteria solution is 0.4733 () and 1.1362 (), respectively；空白對(duì)照OD600分別為0.0711（青枯雷爾氏菌）、0.0763（野油菜黃單胞菌）The OD600of blank control is 0.0711 () and 0.0763 (), respectively?！啊保何礈y(cè)試No test喹唑啉fumiquinazolines生物堿是一類結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特的化合物，結(jié)構(gòu)特征為包含一個(gè)pyrazino [2,1-b] quinazoline-3,6-dione母核，并連接一個(gè)吲哚。自1992年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前共發(fā)現(xiàn)了80多個(gè)該類化合物，主要由陸地和海洋真菌代謝產(chǎn)生，這類化合物及其前體具有十分顯著的生物活性，包括抗腫瘤、抗菌，尤其是在化療藥物方面具有顯著療效[36]。本研究獲得了一個(gè)喹唑啉fumiquinazolines生物堿（9）和兩個(gè)未連吲哚的喹唑啉生物堿（7、8），據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其中8和9的生物活性顯著，而并未發(fā)現(xiàn)7明顯的生物活性。Fremlin等[26]從澳大利亞海沙來(lái)源的雜色曲霉中分離獲得化合物9，通過(guò)核磁及Marfey反應(yīng)確定了它的結(jié)構(gòu)，活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)了其抗菌作用；Wang等[23]從一株深海來(lái)源的雜色曲霉發(fā)酵液中獲得了化合物8和9，對(duì)幾種植物病原菌尖孢炭疽菌（）、稻瘟病菌（）和尖鐮孢（）表現(xiàn)出了顯著的抑菌活性，特別是化合物8對(duì)尖孢炭疽菌的抑制效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥放線菌酮。本研究發(fā)現(xiàn)，所獲得的喹唑啉fumiquinazoline生物堿及其衍生物均沒有抗植物病原細(xì)菌活性，該類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，新穎度高，且文獻(xiàn)報(bào)道了它們的抗植物病原真菌活性。因此，值得繼續(xù)挖掘該類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，從中發(fā)現(xiàn)抗真菌生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物。

4 結(jié)論

從一株海藻來(lái)源的雜色曲霉D5發(fā)酵培養(yǎng)基中分離鑒定了9個(gè)生物堿類化合物（1—9）和3個(gè)蒽醌類化合物（10—12）。其中，2-羰基-4-苯基喹啉生物堿3,6--dimethylviridicatin（3）對(duì)青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌等植物病原細(xì)菌具有顯著的抗菌活性，6-OCH3可能是該類化合物抗菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)。

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Secondary Metabolites from a Marine-Derived Fungusand Their Anti-Phytopathogenic Bacterial Activity

FU Bing1,2, WANG Mei1, LIU JianYang2, LIN Wei2, ZHANG ChengSheng1, ZHAO DongLin1

(1Marine Agriculture Research Center, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong;2Nanping Branch, Fujian Tobacco Company, Nanping 353000, Fujian)

【Objective】Plant bacterial diseases are becoming more and more serious, and lack of control pesticides. The objective of this study is to isolate bioactive compounds from the previously obtained marine-derived fungusD5 with antibacterial activity and abundant secondary metabolites, identify their chemical structures, evaluate their anti-phytopathogenic bacterial activity, so that to clarify the antibacterial components of the target fungus. This research will provide lead compounds for the discovery of new antibacterial pesticides.【Method】The compounds were isolated by silica gel column chromatography (CC), octadecylsilyl silica gel CC, Sephadex LH-20 CC, and semipreparative HPLC, and were identified by modern spectral analysis methods including NMR and MS spectra. In addition, the actibacterial activity of the isolated compounds towards six phytopathogenic bacteria, including,,,,and, was evaluated by double dilution method to obtain the minimum inhibitory concentration (MIC).【Result】Twelve compounds were isolated and identified from the ethyl acetate extract of the marine-derived fungusD5 fermented by potato dextrose water media, including four 4-aryl-quinolin-2-one alkaloids, viridicatin (1), 3--methylviridicatin (2), 3,6--dimethylviridicatin (3), and 3--methylviridicatol (4), two dioxopiperazine alkaloids, (+)-cyclopenol (5) and (-)-cyclopenol (6), three fumiquinazolines alkaloids and their derivatives, versicoloid A (7), chrysopiperazine C (8), and cottoquinazoline A (9), and three anthraquinone derivatives, versiconol (10), averufin (11), and noraverufanin (12). Among them, a 4-aryl-quinolin-2-one alkaloid, 3,6--dimethylviridicatin (3) exhibited an obvious antibacterial activity againstandwith MIC values of 50 and 100 μg·mL-1, respectively. The structure activity relationship analysis revealed that the methoxy group at C-6 might play an important role in anti-phytopathogenic bacterial activity.【Conclusion】The metabolites ofD5 are abundant, which can produce alkaloids and anthraquinones with various structures. Among them, nine alkaloids and three anthraquinones were obtained from cultures of D5. 3,6--dimethylviridicatin (3) exhibited clear antibacterial activities towardsand.

marine-derived fungus;; alkaloid; anthraquinone; structural identification; phytopathogenic bacteria

2020-02-29；

2020-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（41806194）、山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（SD2019ZZ002）、福建省農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目（201735070024072，201735000024112）

付兵，E-mail：fb1501@163.com。通信作者趙棟霖，E-mail：zhaodonglin@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）