超微量核酸蛋白測(cè)定儀的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

【作 者】趙小玉，許俊杰

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 器材科，武漢市，430077

2 武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢市，430060

0 引言

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生命科學(xué)與生物技術(shù)成為我國(guó)發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一，基因治療、疾病診斷和藥物研制的研究將對(duì)我國(guó)社會(huì)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。核酸和蛋白質(zhì)是生物體中重要的有機(jī)物。核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，存儲(chǔ)生物體的全部遺傳信息，在遺傳、變異和生物體的合成中具有極其重要的作用[1]。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命[2]。核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)在基因工程、生物醫(yī)藥、醫(yī)療診斷、遺傳研究、農(nóng)業(yè)化工及食品等相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[3]。核酸蛋白測(cè)定儀作為對(duì)核酸濃度、純度和蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定的儀器，對(duì)現(xiàn)代生命科學(xué)和生物技術(shù)的相關(guān)研究具有重要的意義[4]。

在已有的多種核酸蛋白檢測(cè)方法中，紫外分光光度法[5]與熒光染料法[6]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[7]、數(shù)字PCR法[8]、流式細(xì)胞術(shù)[9]、共振光散射法[10]相比具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、選擇性好、精密度和準(zhǔn)確度高、無(wú)污染、無(wú)樣品損耗等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在食品、醫(yī)療、化工等行業(yè)的定量分析、純度分析、結(jié)構(gòu)分析、動(dòng)力學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)核酸蛋白檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了一些研究，樣品檢測(cè)量大都需要50～100 μL，不能進(jìn)行1～5 μL的超微量檢測(cè)，大都采用干涉濾色片提供單色光作為檢測(cè)光源，只能固定幾個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，不能進(jìn)行連續(xù)波長(zhǎng)全光譜的分光光度檢測(cè)?，F(xiàn)有商用產(chǎn)品目前只有美國(guó)賽默飛世爾公司的NanoDrop系列和德國(guó)艾姆帕拉恩公司的NanoPhometer系列能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，實(shí)現(xiàn)高效率、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的超微量連續(xù)波長(zhǎng)全光譜分析測(cè)定是核酸蛋白檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的最主要方向[5]。根據(jù)核酸蛋白超微量檢測(cè)的實(shí)際需求，我們基于紫外分光光度法設(shè)計(jì)了一種基于連續(xù)波長(zhǎng)全光譜分析的超微量核酸蛋白測(cè)定儀，獲得了良好的效果。

1 超微量核酸蛋白測(cè)定儀的方案設(shè)計(jì)

根據(jù)紫外分光光度法的原理，物質(zhì)對(duì)光譜具有選擇性吸收的特性，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)的吸光度與溶液濃度和厚度的乘積成正比，因此可以根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)單色光的吸收程度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[11]。我們?cè)O(shè)計(jì)的超微量核酸蛋白測(cè)定儀采用紫外分光光度法，利用核酸和蛋白質(zhì)分別對(duì)260 nm和280 nm的紫外光具有特征吸收的特點(diǎn)，可用260 nm和280 nm的吸光度比值評(píng)估核酸純度，用260 nm和280 nm的吸收差法對(duì)含有核酸的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)量[12]。

采用紫外分光光度法進(jìn)行核酸蛋白測(cè)定時(shí)，主要流程分為單色光生成、樣品檢測(cè)、結(jié)果輸出三部分。針對(duì)傳統(tǒng)核酸蛋白檢測(cè)儀需開(kāi)機(jī)預(yù)熱、檢測(cè)范圍窄、檢測(cè)樣品量偏大、檢測(cè)波長(zhǎng)固定的缺點(diǎn)，針對(duì)性設(shè)計(jì)了聚四氟乙烯圓柱形樣品池、嵌入光纖下載板，滿(mǎn)足超微量樣品檢測(cè)的需要，最低檢測(cè)容量為1 μL。以氙燈光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鎢鹵素?zé)?，無(wú)需預(yù)熱，即插即用。設(shè)計(jì)了光電信號(hào)檢測(cè)模塊，實(shí)現(xiàn)微弱光信號(hào)的采集。超微量核酸蛋白測(cè)定儀的設(shè)計(jì)方案如圖1所示。單色光發(fā)生器采用Czerny-Turner光學(xué)結(jié)[13]，由雙通道平面光柵、狹縫、準(zhǔn)直鏡、凹鏡、平面鏡構(gòu)成，光柵轉(zhuǎn)盤(pán)采用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)。光電信號(hào)檢測(cè)模塊采用高靈敏度光電傳感器和低噪聲、高帶寬運(yùn)算放大器、高精度A/D轉(zhuǎn)換器設(shè)計(jì)。人機(jī)交互控制系統(tǒng)采用觸摸屏設(shè)計(jì)。渦旋混勻器采用高轉(zhuǎn)速直流無(wú)刷電機(jī)驅(qū)動(dòng)，保證樣品均勻性。測(cè)試結(jié)果采用觸摸屏輸出。整個(gè)系統(tǒng)由嵌入式中央控制器控制。

圖1 超微量核酸蛋白測(cè)定儀的設(shè)計(jì)方案Fig.1 Design scheme of ultra-micro nucleic acid protein analyzer

2 核酸蛋白測(cè)定儀的硬件系統(tǒng)設(shè)計(jì)

根據(jù)設(shè)計(jì)方案，核酸蛋白測(cè)定儀的硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框架如圖2所示。

圖2 核酸蛋白測(cè)定儀的硬件系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框架Fig.2 Hardware system block diagram of nucleic acid protein analyzer

硬件系統(tǒng)由電源模塊、嵌入式中央控制器模塊、光電信號(hào)檢測(cè)模塊、光柵轉(zhuǎn)盤(pán)控制模塊、渦旋混勻器控制模塊、觸摸屏模塊等部分組成。

紫外單色光發(fā)生器產(chǎn)生的單色光經(jīng)石英光纖照射到樣品池嵌入式光纖下載板的樣品上，高靈敏度的光電傳感器將經(jīng)過(guò)樣品的透射光信號(hào)轉(zhuǎn)化為微弱電流信號(hào)。光電信號(hào)檢測(cè)模塊將微弱電流信號(hào)進(jìn)行放大、濾波、模數(shù)轉(zhuǎn)換后傳輸?shù)角度胧街醒肟刂破?。嵌入式中央控制器結(jié)合外圍電路控制光電信號(hào)檢測(cè)模塊實(shí)現(xiàn)透射光強(qiáng)度采集，結(jié)合軟件算法進(jìn)行核酸蛋白濃度和純度評(píng)估。其他功能如樣品混勻、人機(jī)交互、結(jié)果輸出等由嵌入式中央控制器控制相應(yīng)模塊實(shí)現(xiàn)。

2.1 嵌入式中央控制模塊設(shè)計(jì)

嵌入式中央控制模塊是核酸蛋白測(cè)定儀的核心，用于對(duì)光柵轉(zhuǎn)盤(pán)、渦旋混勻器、顯示屏、通信、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)進(jìn)行控制，同時(shí)還要對(duì)光電信號(hào)檢測(cè)模塊采集的傳感器數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算和軟件檢測(cè)算法處理。為了保證各模塊能夠正常穩(wěn)定工作且測(cè)定結(jié)果快速準(zhǔn)確，對(duì)嵌入式中央控制模塊采用的MCU提出了較高要求。STM32F407系列單片機(jī)是ST公司推出的高集成度、高性能的醫(yī)療、工業(yè)與消費(fèi)應(yīng)用的32位處理器單片機(jī)。它具有工作頻率為168 MHz的CortexTM-M4內(nèi)核，512 kB～1 MB Flash和192 kB SRAM，且具有浮點(diǎn)單元，具有6個(gè)速度高達(dá)11.25 Mb/s的USART、3個(gè)速度高達(dá)45 Mb/s的SPI、3個(gè)I2C、2個(gè)CAN和1個(gè)SDIO[14]。選用STM32F407系列的STM32F407VGT6芯片作為嵌入式中央控制模塊的MCU，該芯片滿(mǎn)足測(cè)定儀對(duì)直流電機(jī)、步進(jìn)電機(jī)的PWM控制、觸摸屏串口控制、數(shù)據(jù)采集和運(yùn)算的要求。

2.2 光電信號(hào)檢測(cè)模塊設(shè)計(jì)

核酸蛋白測(cè)定儀的關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)透射樣品的微弱光信號(hào)進(jìn)行采集和處理，經(jīng)MCU對(duì)采集的數(shù)據(jù)輔助測(cè)定算法進(jìn)行分析，才能準(zhǔn)確地檢測(cè)出核酸蛋白的濃度和純度。選用日本濱松公司生產(chǎn)的硅光電二極管S1226-18BQ為光電傳感器，該傳感器具有1.21 mm2的感光面積，190～1000 nm的光譜響應(yīng)范圍，最大暗電流為2 pA，響應(yīng)上升時(shí)間僅需0.15 μs。所設(shè)計(jì)核酸蛋白測(cè)定儀需要的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，該傳感器在此波段范圍內(nèi)靈敏度最小為0.1 A/W，典型值為0.36 A/W，具有優(yōu)越的紫外光檢測(cè)能力。因其具有響應(yīng)快、靈敏度高、性能穩(wěn)定、測(cè)量線(xiàn)性好、噪聲低的特點(diǎn)，極大降低了電路設(shè)計(jì)的難度和提高了準(zhǔn)確性。

經(jīng)過(guò)樣品的透射光是微弱信號(hào)，經(jīng)過(guò)硅光電二極管采集轉(zhuǎn)換后也很弱，通常只有微安級(jí)別，很難測(cè)量。因此要高精度、不失真的采集和分析硅光電二極管產(chǎn)生的電流信號(hào)，必須有后續(xù)的檢測(cè)電路設(shè)計(jì)[15]。

我們?cè)O(shè)計(jì)的光電檢測(cè)模塊采用I/V轉(zhuǎn)換電路將硅光電二極管采集的微弱電流信號(hào)轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，再經(jīng)差動(dòng)運(yùn)放電路進(jìn)行放大，之后經(jīng)可編程增益放大器再次放大，通過(guò)外圍電路進(jìn)行濾波去噪，然后通過(guò)AD轉(zhuǎn)換電路變成數(shù)字信號(hào)送STM32F407VGT6單片機(jī)進(jìn)行處理和分析，得到待測(cè)樣品的濃度和純度。圖3為光電信號(hào)檢測(cè)模塊功能結(jié)構(gòu)框架。

圖3 光電信號(hào)檢測(cè)模塊功能結(jié)構(gòu)框架Fig.3 Functional structure block diagram of photoelectric signal detection module

對(duì)透射樣品的微弱光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，需考慮電路的帶寬增益積、信噪比和穩(wěn)定性，元器件的選型對(duì)電路的抗干擾設(shè)計(jì)和噪聲抑制至關(guān)重要。I/V轉(zhuǎn)換芯片選用TI公司的LMP2011，它是一款低噪聲、低輸入偏置電流、低失調(diào)電壓、高帶寬、高共模抑制比的的單路、軌到軌運(yùn)放，可滿(mǎn)足需求。后置放大采用LMP2011和可編程增益放大器PGA112，PGA112是一款低偏置電壓、低噪聲、誤差小的可編程運(yùn)算放大器，采用SPI通信方式對(duì)增益進(jìn)行調(diào)整。AD轉(zhuǎn)換芯片選用TI公司的16位高精度、低功耗、微型CMOS轉(zhuǎn)換芯片TLC4545ID，該芯片采樣率為200 kSPS，采用3 Vpp/V噪聲、3 ppm/oC漂移精密電壓基準(zhǔn)芯片REF5025提供2.5 V參考電壓，采用SPI串行接口協(xié)議與STM32F407VGT6通信。

基于以上分析，利用Altium Designer軟件設(shè)計(jì)出一種具有低噪聲、高穩(wěn)定性的光電信號(hào)檢測(cè)電路，能夠?qū)⒐韫怆姸O管SS1296-18BQ輸出的幾個(gè)微安的光電流信號(hào)轉(zhuǎn)換為A/D轉(zhuǎn)換器能夠識(shí)別的電壓，主要電路，如圖4所示。

圖4 光電信號(hào)檢測(cè)模塊主要電路Fig.4 Main circuit of photoelectric signal detection module

2.3 光柵轉(zhuǎn)盤(pán)控制模塊設(shè)計(jì)

步進(jìn)電機(jī)作為光柵轉(zhuǎn)盤(pán)的執(zhí)行機(jī)構(gòu)，需要專(zhuān)門(mén)的運(yùn)動(dòng)控制器和驅(qū)動(dòng)器進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。采用德國(guó)Trinamic公司的電機(jī)運(yùn)動(dòng)控制芯片TMC4210和電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片TMC2660對(duì)光柵轉(zhuǎn)盤(pán)兩相步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行控制。TMC4210運(yùn)動(dòng)控制器內(nèi)設(shè)存儲(chǔ)器和寄存器，通過(guò)四線(xiàn)SPI接口與STM32F07VGT6進(jìn)行通信，TMC2660集成預(yù)驅(qū)動(dòng)器和功率MOSFET管，峰值輸出電流最大能夠達(dá)到4 A，芯片參數(shù)由STM32F407VGT6通過(guò)SPI進(jìn)行配置，通過(guò)Step/Dir方式驅(qū)動(dòng)最大能夠?qū)崿F(xiàn)256細(xì)分，能夠?qū)崿F(xiàn)高精度電機(jī)控制。光柵轉(zhuǎn)盤(pán)控制模塊電路框圖，如圖5所示。

圖5 光柵轉(zhuǎn)盤(pán)控制模塊電路框圖Fig.5 Block diagram of raster turntable control module circuit

2.4 渦旋混勻器控制模塊設(shè)計(jì)

無(wú)刷直流電機(jī)作為渦旋混勻器的執(zhí)行機(jī)構(gòu)，由德國(guó)Elmos公司的高集成度三相直流無(wú)刷電機(jī)控制芯片E523.52進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。該芯片集成16位RISC微控制器、4 kB RAM，硬件MAC及電壓分壓監(jiān)測(cè)電路，柵極驅(qū)動(dòng)器，可驅(qū)動(dòng)三相全橋MOSFET，每一相最大驅(qū)動(dòng)電流達(dá)200 mA，集成1 Mbps的12位ADC自主采樣序列引擎，可以對(duì)內(nèi)存直接存取，實(shí)現(xiàn)和PWM同步。得益于E523.52的高集成度，結(jié)合由6個(gè)MOS管構(gòu)成的電機(jī)驅(qū)動(dòng)橋、1個(gè)采用電阻及必要的基礎(chǔ)器件，系統(tǒng)通過(guò)STM32F407VGT6產(chǎn)生6個(gè)獨(dú)立PWM對(duì)渦旋混勻器的無(wú)刷直流電機(jī)進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)樣品混勻功能，其控制電路框架，如圖6所示。

圖6 渦旋混勻器控制模塊電路框架Fig.6 Block diagram of vortex mixer control module circuit

2.5 顯示模塊設(shè)計(jì)

采用5.6 in的TFT串口觸摸屏實(shí)現(xiàn)人機(jī)交互和測(cè)定結(jié)果顯示，顯示屏通過(guò)UART接口與STM32F407VGT6相連，能夠?qū)崿F(xiàn)文本、GUI、圖片、GIF動(dòng)畫(huà)的顯示和觸控功能，滿(mǎn)足測(cè)定儀人機(jī)交互控制設(shè)計(jì)需求。

2.6 電源模塊設(shè)計(jì)

電源模塊用來(lái)給儀器供電，該模塊由直流隔離模塊和穩(wěn)壓模塊組成。在系統(tǒng)電路設(shè)計(jì)中，電源采用12 V開(kāi)關(guān)電源為主電源，采用穩(wěn)壓芯片ADM7170提供5 V的穩(wěn)壓輸出。控制光柵轉(zhuǎn)盤(pán)的步進(jìn)電機(jī)和渦旋混勻器的無(wú)刷直流電機(jī)采用12 V供電，嵌入式中央控制模、光電信號(hào)檢測(cè)模塊、步進(jìn)電機(jī)和直流電機(jī)控制器、驅(qū)動(dòng)器采用5 V供電。

3 核酸蛋白測(cè)定儀的軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)

軟件設(shè)計(jì)包括測(cè)定儀觸摸操作主程序、系統(tǒng)初始化程序、測(cè)定流程控制程序、光柵轉(zhuǎn)盤(pán)控制程序、渦旋混均器控制程序、光電信號(hào)信號(hào)檢測(cè)程序、觸摸屏串口控制程序、定時(shí)程序、中斷程序、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)程序、AD數(shù)據(jù)采集程序、濃度純度計(jì)算程序等。系統(tǒng)軟件程序流程圖如圖7所示。

圖7 軟件程序流程圖Fig.7 Software program flow chart

根據(jù)實(shí)際測(cè)定流程編寫(xiě)程序流程，程序運(yùn)行開(kāi)始時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)初始化，包括STM32F407VGT6的時(shí)鐘系統(tǒng)、IO端口、直流電機(jī)模塊、步進(jìn)電機(jī)模塊、霍爾限位開(kāi)關(guān)引腳定義、串行通信接口、SPI通信接口等的初始化。初始化完成后，系統(tǒng)根據(jù)用戶(hù)在觸摸屏上操作對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)，根據(jù)朗伯比爾定律A=kcl（A為吸光度，k為消光系數(shù)，l為光程），已知物質(zhì)的消光系數(shù)，液層的厚度（固定的樣品室），就能利用其吸光度來(lái)計(jì)算出物質(zhì)的濃度。與此同時(shí)，還能通過(guò)計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計(jì)核酸的純度。

4 系統(tǒng)測(cè)試與結(jié)果

4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

系統(tǒng)測(cè)試主要分為樣機(jī)功能性測(cè)試、穩(wěn)定性測(cè)試和準(zhǔn)確性測(cè)試。功能性測(cè)試對(duì)所設(shè)計(jì)儀器是否能夠進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)量進(jìn)行評(píng)估。穩(wěn)定性測(cè)試對(duì)同一樣本在不同時(shí)刻多次測(cè)量的情況進(jìn)行評(píng)估。準(zhǔn)確性測(cè)試對(duì)不同樣本多次測(cè)量的情況進(jìn)行評(píng)估。在準(zhǔn)確性測(cè)試時(shí)通過(guò)同時(shí)使用德國(guó)IMPLEN NanoPhotometer商用核酸蛋白測(cè)定儀和設(shè)計(jì)的核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)儀器性能進(jìn)行評(píng)估。

4.2 穩(wěn)定性測(cè)試

儀器的精度是建立在儀器的穩(wěn)定性之上的，穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)其可靠性的基礎(chǔ)。用所設(shè)計(jì)核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)同一濃度樣品在不同時(shí)間進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，每種樣品各儀器測(cè)量9次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1%認(rèn)為無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，儀器測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定。

以為dsDNA為待測(cè)樣品，用移液器將2 μL樣品加入樣品池中，每間隔10 s用儀器對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)試。不同時(shí)刻測(cè)得的濃度曲線(xiàn)如圖8所示，重復(fù)測(cè)量濃度值無(wú)顯著變化。經(jīng)計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.25%，儀器具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 樣品在不同時(shí)刻的濃度Fig.8 The concentration of the sample at different times

4.3 準(zhǔn)確性測(cè)試

通過(guò)對(duì)10種濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)使用IMPLEN NanoPhotometer商用核酸蛋白測(cè)定儀和設(shè)計(jì)的核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定對(duì)比實(shí)驗(yàn)。圖9為兩種儀器在不同濃度下的誤差曲線(xiàn)。

圖9 測(cè)試誤差對(duì)比曲線(xiàn)Fig.9 Test error comparison curve

如圖9所示，兩款核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)不同濃度樣品的測(cè)定結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)核酸蛋白測(cè)定儀和商用核酸蛋白測(cè)定儀在低濃度時(shí)誤差偏大，但均小于3%，在樣品濃度較高時(shí)，誤差小于1%，儀器具有較好的準(zhǔn)確性。

5 結(jié)論

核酸蛋白測(cè)定儀已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、生命科學(xué)研究、化工、食品科學(xué)等行業(yè)。設(shè)計(jì)的核酸蛋白測(cè)定儀，根據(jù)紫外分光光度法及核酸蛋白測(cè)定原理，對(duì)儀器的紫外單色光模塊、光電信號(hào)檢測(cè)模塊、嵌入式中央控制器等方面進(jìn)行了研究，搭建了相關(guān)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，給出了儀器的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)方法。通過(guò)對(duì)比測(cè)試實(shí)驗(yàn)，對(duì)儀器的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與市場(chǎng)上相對(duì)成熟的核酸蛋白測(cè)定儀具有良好的一致性。所設(shè)計(jì)的儀器具有使用靈活、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，為核酸蛋白測(cè)定儀的設(shè)計(jì)和制造提供了參考價(jià)值。不過(guò)該檢測(cè)儀還需進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，使其具有產(chǎn)品應(yīng)用價(jià)值。