利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析

陳向英 楊志華 洪美華

廣東省中山市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東中山 528401

利尿合劑為本醫(yī)院中藥自制制劑（批號(hào)文號(hào)：粵藥制字Z20071008），是本院臨床治療泌尿系感染常規(guī)用藥。由葉下珠、白花蛇舌草、海金沙、一點(diǎn)紅、金砂藤、甘草等藥味組成，具有清熱祛濕、解毒通淋的作用，臨床用于泌尿系感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利等癥[1]，為了控制利尿合劑的質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法對(duì)制劑中的白花蛇舌草、葉下珠進(jìn)行了定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)制劑中甘草酸進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，能有效控制利尿合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀；電子天平（BS224S，Sartorius）；超聲波清洗劑（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）；薄層色譜攝影儀（Good see-I，上?？普苌萍加邢薰荆还枘zG 板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

利尿合劑（中山市中醫(yī)院制劑室提供，每瓶100ml，樣品批號(hào)：20191107，20191122，20191211）；白花蛇舌草（批號(hào)：121183-201404）、葉下珠（批號(hào)：121563-201805）、熊果酸（批號(hào)：110748-201706），對(duì)照藥材與對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甘草酸（日本松浦藥業(yè)株式會(huì)社）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 白花蛇舌草 取供試品利尿合劑40mL，蒸干，殘?jiān)右掖?0mL 使溶解，作為供試品溶液。另取白花蛇舌草對(duì)照藥材1g，加乙醇10mL，超聲處理30min，趁熱濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取熊果酸對(duì)照品，加乙醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。陰性樣品按供試品同法處理，制成陰性供試液，照薄層色譜法（中國(guó)藥典一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～ 60℃）- 苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。見圖1。

圖1 （T ：28℃，RH ：65%）

圖2 （T ：28℃，RH ：65%）

2.1.2 葉下珠 取供試品利尿合劑20mL，加乙酸乙酯30mL 振搖提取，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為供試品溶液。另取葉下珠對(duì)照藥材2g，加水煎煮30min，濾過，濾液濃縮至約20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取陰性樣品20mL，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015 年版一部附錄）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60℃）-苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，對(duì)照色譜則無(wú)此斑點(diǎn)。并經(jīng)28℃，相對(duì)濕度（RH）35%，65%，88%；8℃下RH60% 等條件下的方法學(xué)考察，均顯示出穩(wěn)定的結(jié)果。見圖2。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX XDB-C18柱（4.6mm×250mm 5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2mol/L 醋酸銨溶液- 冰醋酸（55 ∶45 ∶1）梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1.00mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量為20μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘草酸對(duì)照品5.406mg 置于50mL 量瓶中，加50% 甲醇至刻度作為甘草酸對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，稱取3mL 儲(chǔ)備液加入10mL 容量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度作為對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取利尿合劑30mL，精密加入流動(dòng)相50mL，混合均勻，超聲處理10min，放冷，用流動(dòng)相補(bǔ)足溶劑量，搖勻，過濾，取濾液20mL，作為供試品溶液。

3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

按處方中藥味除去甘草，其余藥味按成方的生產(chǎn)工藝及供試品溶液的制備方法，作為陰性對(duì)照品溶液。

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取甘草酸對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液1、2、3、4、5mL，分別置10mL 容量瓶中，加50% 甲醇至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣（采用20μL 進(jìn)樣環(huán)滿刻度進(jìn)樣），按上述條件測(cè)定。計(jì)算回歸方程得：Y=419503.8X-6314，r=0.9997，甘草酸在 0.2162 ～ 1.081μg 范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

3.6 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一批（20191122）供試品溶液，每間隔1h 進(jìn)樣測(cè)定，RSD 為0.78%，n=6，說明供試品溶液在5h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次，RSD 為0.48%，表明儀器精密度良好。

3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（20191122）溶液5 份，按照“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得甘草酸平均含量為0.6339mg/mL，RSD 為 0.506%，n=5。

3.9 加樣回收試驗(yàn)

精密吸取已知含量的樣品（批號(hào)20191122），分別精密加入對(duì)照品0.6437mg，按照供試品溶液準(zhǔn)備方法制備，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果平均回收率98.60%，RSD 為0.522%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.10 含量測(cè)定

分別精密吸取3 批樣品各3 份，按供試品溶液制備方法制備，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定甘草酸含量。見表2。

表2 樣品中甘草酸含量測(cè)定（n=3）

4 討論

利尿合劑是本醫(yī)院中藥自制制劑，由葉下珠、白花蛇舌草、海金沙、一點(diǎn)紅、金砂藤等藥味組成，是泌尿系感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利等疾病治療的常規(guī)用藥。本課題前期研究表明，利尿合劑用于泌尿系感染患者104 例，臨床有效率為99.04%，明顯優(yōu)于寧泌泰膠囊對(duì)照組的92.15%（P ＜0.05），尿急、尿頻癥狀消失時(shí)間和尿常規(guī)檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)好轉(zhuǎn)時(shí)間較對(duì)照組減少[2]。黃新凱等[3]觀察利尿合劑治療妊娠期泌尿系感染的療效，治療52 例治愈率為88%，療效明顯優(yōu)于寧泌泰膠囊，治療后尿路刺激征消失時(shí)間和尿細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰數(shù)均優(yōu)于寧泌泰膠囊對(duì)照組。潘佩嬋等[4]應(yīng)用間歇導(dǎo)尿+ 口服利尿合劑預(yù)防脊髓損傷所致泌尿系感染效果顯著。雷素云等[1]應(yīng)用利尿合劑治療慢性腎炎、膀胱炎等泌尿系感染，臨床總有效率為99.3%。臨床用于治療泌尿系統(tǒng)感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利有顯著的療效。本研究對(duì)利尿合劑中的主要中藥材白花蛇舌草、葉下珠進(jìn)行了薄層色譜鑒別研究，結(jié)果顯示薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，并經(jīng)多溫度、濕度、多種色譜板等條件考察，均顯示出清晰可分的色譜圖譜，方法穩(wěn)定可靠，該方法可用于利尿合劑的薄層色譜鑒別[5-8]。

本品為復(fù)方制劑，甘草酸作為甘草藥材及含甘草制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分，在此選擇了甘草酸的含量測(cè)定對(duì)利尿合劑進(jìn)行質(zhì)量控制。參考《中國(guó)藥典》2015 版一部中甘草藥材項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，對(duì)制劑中甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，白花蛇舌草、葉下珠的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。甘草酸在0.2162 ～1.081μg（r=0.9997）線性范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，肯定了本方法的應(yīng)用價(jià)值。分析原因，本類檢測(cè)方法利用固定波長(zhǎng)對(duì)薄層展開的各斑點(diǎn)進(jìn)行掃描圖譜分析，具有更為客觀準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，重現(xiàn)性更高[9-11]，且可同時(shí)分析多個(gè)樣品，并進(jìn)行分離，分離效率高，且其靈敏及準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)也適用于利尿合劑的質(zhì)量控制。圖像易于保存，各種優(yōu)勢(shì)的存在肯定了其綜合的臨床應(yīng)用效果[12-15]。綜上所述，該方法適宜于該制劑中甘草酸的含量測(cè)定，色譜峰分離度高、峰型好，且陰性無(wú)干擾。