珠蛋白生成障礙性貧血異常-α3.7 缺失條帶的基因型研究

顧燕英，吳蓓穎，林 琳，蔡 剛#，顧鳴敏

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2. 上海交通大學基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心，上海 200025

珠蛋白生成障礙性貧血是由于珠蛋白基因發(fā)生突變或缺失導致珠蛋白生成障礙而引起的遺傳性溶血性貧血，臨床上以α 和β 珠蛋白生成障礙性貧血最為常見。其中，α 珠蛋白生成障礙性貧血主要分為缺失型和非缺失型 2 類，以東南亞缺失（--sea）、右向缺失（-α3.7）和左向缺失（-α4.2）為主，且該3 種缺失類型約占廣東省α 珠蛋白生成障礙性貧血的96%[1-2]。目前，多數臨床采用常用的商品化診斷試劑盒即跨越斷裂點聚合酶鏈反應（gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR）法檢測上述3 種常見的基因缺失，而該方法對于罕見的α 珠蛋白基因缺失則易產生漏檢或誤檢。本研究就4 238 例患者先行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測、再行Gap-PCR 和Sanger 測序法，對異常-α3.7條帶的樣本做進一步檢測并行家系分析，以期為臨床提供更準確的基因診斷結果及遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年6 月—2019 年9 月于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院兒科、血液科和婦產科就診的行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的患者4 238 例，其中男性1 491 例、女性2 747 例，年齡1 d ～95 歲。

本研究經上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會批準[審批號：（2019）臨倫審第（54）號]，所有研究對象或監(jiān)護人均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血常規(guī)檢查 抽取患者靜脈血3 mL，以乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝。隨后，采用XS-800i 全自動血液分析儀（Sysmex，日本）對患者各項紅細胞參數進行檢測，包括紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、 紅細胞平均血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）等。上述參數的參考區(qū)間參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3 版）》，即MCV 正常參考區(qū)間為男（83.9 ～99.1）fL、 女（82.6 ～99.1）fL，MCH 正常參考區(qū)間為男（27.8 ～ 33.8）pg、女（26.9 ～33.3）pg，Hb 正常參考區(qū)間為男（131 ～172）g/L、女（113 ～151）g/L。

1.2.2 基因組DNA 提取 采用基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]對EDTA-K2 抗凝血行DNA 提取，方法依據說明書步驟進行。

1.2.3 常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 采用Gap-PCR 法檢測α 珠蛋白基因3 種常見的缺失（--sea、-α3.7和-α4.2）。采用反向斑點雜交法（reverse dot blot，RDB）檢測3 種常見的非缺失α 珠蛋白基因點突變[分別為αWestmeadα（αWS）、αQuongSzeα（αQS）和αConstantSpringα（αCS）] 和17種β 珠蛋白基因突變[分別為CD41-42（-TTCT），IVS-Ⅱ-654（C →T），-28（A →G），CD17（AAG →TAG），CD71-72（+A），βE（GAG →AAG），-29（A →G），CD43（GAG →TAG），CD27/28（+C），CD14-15（+G），CD31（-C），-32（C →A），-30（T →C），IVS-Ⅰ-1（G →T），IVS- Ⅰ-5（G →C），5'UTR; +43-40（-AAAC），initiation condon（ATG →AGG）]?；蛟\斷試劑由亞能生物技術（深圳）有限公司提供，并按照試劑說明書進行操作及結果判讀。

1.2.4 罕見型珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 選擇異常-α3.7缺失條帶的樣本，即常規(guī)Gap-PCR 法檢測缺失型α 珠蛋白生成障礙性貧血時擴增出-α3.7條帶（弱條帶）及αα 條帶，或同時擴增出-α3.7條帶、αα 條帶及--sea條帶，送至亞能生物技術（深圳）有限公司進行罕見型珠蛋白生成障礙性貧血檢測。該檢測方法采用Gap-PCR 法通過特異引物進一步檢測X1/X2 融合片段及αααanti4.2片段，判斷是否為香港型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因（Hong Kong αα，HKαα）；若檢測結果為陰性，則采用Sanger 測序法行α1、α2 基因測序，并在HbVar 數據庫（http://globin.bx.psu.edu/hbvar）中查找測序結果的突變位點。

1.2.5 家系分析 珠蛋白生成障礙性貧血是一種常染色體隱性遺傳的單基因遺傳病，遺傳方式符合孟德爾定律。本研究根據孟德爾分離定律和自由組合定律（子代的2 個等位基因分別來自父親與母親，即只有父親或母親攜帶HKαα 與-α3.7基因，子代才可能出現HKαα/-α3.7基因型），對2 個家系的基因型進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2016 及SAS 8.2 軟件對研究數據進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以x—±s 表示，符合非正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示。定性資料以百分率表示。在不同基因類型的血常規(guī)參數中，以Hb 取自然對數后（為正態(tài)分布）行單因素方差分析，基因型間比較采用獨立樣本t 檢驗；MCV 和MCH（為非正態(tài)分布）采用多獨立樣本的秩和檢驗。基因型間比較采用兩獨立樣本的秩和檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果

采用Gap-PCR 和RDB 法對常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變和缺失進行檢測，結果（表1、圖1）顯示，在4 238 例患者中共檢出-α3.7缺失條帶者109 例，其基因型被初步判斷為88 例-α3.7/αα、19 例-α3.7/αα 復合β 珠蛋白生成障礙性貧血、1 例-α3.7/αQS，及1 例-α3.7、αα、--sea3 條帶（未確定）；同時在檢出的109 例中，有14 例-α3.7條帶較αα 條帶細弱，有1 例同時出現-α3.7、αα、--sea3 個條帶，因此將該15 例用于罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測。

表1 109 例-α3.7 缺失條帶患者中珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因診斷結果及檢出率Tab 1 Genetic diagnosis results and detection rate of common mutations of thalassemia in 109 cases with -α3.7 deletion bands

圖1 Gap-PCR 法檢測結果的電泳圖 Fig 1 Electrophoretogram of Gap-PCR results

2.2 罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結果

將上述14 例出現-α3.7弱條帶和1 例同時出現-α3.7、αα、--sea3 個條帶的樣本（共計15 例）送至亞能生物技術（深圳）有限公司進行罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血檢測，即采用Gap-PCR 檢測HKαα 基因及Sanger 測序法進行α1、α2 基因測序。結果（表2）顯示，有13例為HKαα/αα 或HKαα/-α3.7，1 例為HKαα/--sea，1 例為NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812 bp 罕見缺失；且經與HbVar 數據庫比對發(fā)現，該罕見缺失尚未記錄。通過進一步的Gap-PCR 和Sanger 測序法檢測，罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因的總誤檢率為0.35%（15/4 238），在-α3.7缺失中誤檢率為13.76%（15/109）；HKαα 基因的總檢出率為0.33%（14/4 238），在-α3.7缺失中誤檢率為12.84%（14/109）。

表2 15 例罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因檢測結果Tab 2 Gene detection results of 15 patients with rare α-thalassemia

2.3 HKαα 的家系分析

由于采用Gap-PCR 法檢測HKαα 基因未能區(qū)分HKαα/αα 或HKαα/-α3.7等基因型，且本研究中存在2 個HKαα 的家系（家系1 來自上海、家系2 來自甘肅），因此可通過家系分析進一步區(qū)分其基因型。結果（表3）發(fā)現，家系2 中母親和孩子的基因型確定為HKαα/αα，但家系1 中父親和家系2 中外婆的基因型仍不能區(qū)分。

表3 2 個HKαα 家系的基因型分析Tab 3 Genotype analysis of two HKαα families

2.4 不同α 珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的血常規(guī)參數比較

通過對不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血患者進行血常規(guī)檢查與統(tǒng)計分析，結果（表4）顯示，HKαα/αα 或HKαα/-α3.7基因型的MCV 和MCH 水平高于-α3.7/αα 基因型（P=0.031，P=0.007），而Hb 水平間差異則無統(tǒng)計學意義；NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812bp 基因型的MCV、MCH 和Hb 水平分別為76.7 fL、24.6 pg 和139.0 g/L， 其中Hb 水平在正常參考區(qū)間內，而MCV、MCH 水平較HKαα/αα or HKαα/-α3.7基因型有所下降。

表4 不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血患者的血常規(guī)參數比較Tab 4 Comparison of blood routine parameters from the patients with different types of α-thalassemia

3 討論

α 珠蛋白生成障礙性貧血是由于α 珠蛋白基因缺陷導致α 珠蛋白肽鏈合成受到部分或完全抑制所致。α 珠蛋白基因簇位于16 號染色體16p13.3 位點，其基因在基因簇上的排列順序為5'-ζ-Ψζ-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ-3'。該基因簇包括2 個高度同源的基因，即α 1和α 2，在減數分裂時同源染色體發(fā)生錯配和不等交換則會產生-α3.7缺失型和對側重復αααanti3.7三聯(lián)體，或-α4.2缺失型和對側重復αααanti4.2三聯(lián)體等[3-4]。目前，臨床上常用的Gap-PCR 法可同時檢測α 珠蛋白的3 種常見缺失（即--sea、-α3.7和-α4.2），但對于罕見的缺失型易漏檢或誤檢。

本研究通過對4 238 例患者行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測發(fā)現，15 例樣本出現了異常-α3.7缺失條帶，通過進一步行Gap-PCR 法檢測發(fā)現14 例為HKαα 基因。HKαα 是一種罕見的α 珠蛋白生成障礙性貧血基因，是由α 珠蛋白基因簇的重組和不等交換形成的含有-α3.7和αααanti4.2片段的重組基因，包含一個正常的α2 基因、一個由α1 與α2 形成的融合基因（-α3.7缺失基因片段）和一個由X1 與X2 形成的融合基因[5]，因此HKαα 基因用Gap-PCR 法能夠擴增出正常的αα 條帶和-α3.7缺失條帶。本研究發(fā)現HKαα 基因型能夠擴增出-α3.7缺失條帶，但是相比αα 條帶較為細弱，而-α3.7/αα 基因型的正常αα 條帶和-α3.7缺失條帶的亮度、粗細基本一致；繼而猜測，可能是由于HKαα 基因包含正常的α2 基因與-α3.7基因片段，而-α3.7缺失基因只含有-α3.7基因片段，兩者的-α3.7缺失基因和正常αα 基因的拷貝數不同，導致擴增產物的量亦不同，因此電泳結果中-α3.7與αα 條帶的亮度及粗細均存在差異。因此，經Gap-PCR 法獲得的-α3.7/αα 電泳條帶，其可能是-α3.7/αα、HKαα/αα 或者HKαα/-α3.7，應在臨床工作中加以重視。另外，針對同時出現-α3.7、αα、--sea3 個條帶的異常結果，臨床上也應考慮其是否為HKαα 基因型，以避免誤檢或漏檢。

本研究發(fā)現，11 例HKαα/αα 或HKαα/-α3.7基因型患者的MCV 和MCH 均高于-α3.7/αα 基因型，與文獻[6-9]報道結果一致，但2 種基因型的Hb 水平間差異無統(tǒng)計學意義；本研究還發(fā)現，MCV 與MCH 參數對于不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血的區(qū)分相較于Hb 更敏感，可能與貧血時紅細胞代償性增多而使Hb 水平增加有關；同時，在本研究中1 例HKαα/--sea患兒為6 周，其Hb 為100 g/L， MCV 和MCH 介于--sea/αα 基因型與-α3.7/--sea基因型，但由于HKαα/--sea基因型只有1 例且年齡較小，其血常規(guī)參數難以與--sea/αα 與-α3.7/--sea進行比較。有文獻[9-10]報道HKαα/--sea臨床癥狀明顯輕于-α3.7/--sea，若夫妻雙方分別攜帶HKαα 和--sea，該家庭則可選擇保住胎兒，以減輕家庭的經濟與心理負擔。因此，避免將HKαα/--sea誤診為-α3.7/--sea， 將有助于提供正確的產前診斷和遺傳咨詢。

目前有關于HKαα 的報道主要集中在兩廣地區(qū)，廣西地區(qū)人群中HKαα 的攜帶率為0.07%[6]，廣東地區(qū)的-α3.7攜帶者中HKαα 的檢出率為2.27%，且其在人群中的攜帶率為0.07%[11]。同時，也有文獻[8]對福建省進行研究顯示HKαα 在福建籍人群中的檢出率為0.36%，在-α3.7攜帶者中的檢出率為7.27%。陳文璟等[9]對-α3.7/αα 樣本進行檢測發(fā)現，HKαα 漏診率為16%。本研究共檢出HKαα 基因14 例，總檢出率為0.33%，在-α3.7攜帶者中檢出率為12.84%；且2 個家系分別來自甘肅和上海，均為珠蛋白生成障礙性貧血的非高發(fā)地區(qū)。本實驗檢出的HKαα 基因比例較高，有助于增加臨床對HKαα 基因的認識，從而進行更準確的遺傳咨詢。

目前，檢測HKαα 基因的方法有巢式PCR 技術、Southern 印跡雜交、測序技術等，其中以兩輪巢式PCR方法最為多見[7-10]，可以對HKαα 基因型進行診斷。本實驗采用Gap-PCR 法通過特異性引物分別檢測X1/X2 融合片段（HKαα 和αααanti4.2都包含此片段）及αααanti4.2片段（αααanti4.2特異性存在），但結果并未能區(qū)分HKαα/αα 或HKαα/-α3.7，因此還需通過家系分析來進行確定。

在由Gap-PCR 檢測的15 例異常-α3.7條帶中，1 例為HKαα 基因型陰性，經進一步測序發(fā)現其α 珠蛋白基因序列為NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812 bp，該缺失在HbVar 數據庫上尚未見記錄。其中-α3.7細弱條帶的產生，可能是由于該缺失與-α3.7（NG_000006.1:g.34164_37967 del 3 804 bp）的缺失片段近，且在引物設計時-α3.7缺失的上下游引物間的缺失片段不同，導致擴增效率降低所致；同時，該條帶比HKαα 基因型的相應條帶更為細弱，因此在臨床工作中可能會被誤診為-α3.7/αα 或αα/αα，需引起重視。另外，本研究還發(fā)現該病例的Hb 水平在正常參考區(qū)間內，MCV、MCH 水平低于HKαα/αα or HKαα/-α3.7基因型，或可通過MCV 和MCH 進行簡單的區(qū)分。綜上，我們發(fā)現并非出現細弱-α3.7條帶的基因型都是HKαα 基因型；因此在臨床檢測中，當出現異常-α3.7條帶時建議醫(yī)師先進行HKαα 基因檢測，如果為陰性可再行α 珠蛋白基因測序，以減少錯檢與漏檢。

目前，臨床所用的檢測技術涵蓋了絕大部分的珠蛋白生成障礙性貧血類型，除血常規(guī)與常規(guī)基因檢測外，血紅蛋白毛細管電泳分析技術也是當前該貧血篩查的技術之一，且方法簡單易行，對于罕見類型具有良好的提示作用[12]。因此，在臨床工作中醫(yī)師可通過聯(lián)合檢測以及經驗的積累來減少對罕見型珠蛋白生成障礙性貧血的誤檢和漏檢。本研究總結了臨床常規(guī)檢測中發(fā)現的異常-α3.7缺失條帶的罕見類型和特征，但由于珠蛋白基因的復雜性和方法的局限性使得某些結果的解釋存在不足。隨著今后基因檢測水平的增加和臨床檢測經驗的累積，如何在常規(guī)檢測工作中減少漏檢與誤檢將有待更進一步的深入研究。

參·考·文·獻

[1] Xu XM, Zhou YQ, Luo GX, et al. The prevalence and spectrum of α and thalassaemia in Guangdong Province: implications for the future health burden and population screening[J]. J Clin Pathol, 2004, 57(5): 517-522.

[2] Li ZS, Li FF, Li M, et al. The prevalence and spectrum of thalassemia in Shenzhen, Guangdong Province, People's Republic of China[J]. Hemoglobin, 2006, 30(1): 9-14.

[3] Michelson AM, Orkin SH. Orkin. Boundaries of gene conversion within the duplicated human α-globin genes. Concerted evolution by segmental recombination[J]. J Biol Chem, 1983, 258(24): 15245-15254.

[4] Farashi S, Harteveld CL. Molecular basis of α-thalassemia[J]. Blood Cells Mol Dis, 2018, 70: 43-53.

[5] Wang W, Chan AY, Chan LC, et al. Unusual rearrangement of the α-globin gene cluster containing both the -α3.7and αααanti-4.2crossover junctions: clinical diagnostic implications and possible mechanisms[J]. Clin Chem, 2005, 51(11): 2167-2170.

[6] Shang X, Li Q, Cai R, et al. Molecular characterization and clinical presentation of HKαα and anti-HKαα alleles in southern Chinese subjects[J]. Clin Genet, 2013, 83(5): 472-476.

[7] 黃海龍, 林娜, 李英, 等. 產前診斷罕見HKαα 復合東南亞缺失型α-地中海貧血一例[J]. 中華圍產醫(yī)學雜志, 2014, 17(7): 488-490.

[8] 張敏, 黃海龍, 陳梅環(huán), 等. 福建人群香港型地中海貧血的基因變異檢測[J]. 中華醫(yī)學遺傳學雜志, 2019, 36(4): 297-300.

[9] 陳文璟, 溫旺榮, 蘇運欽, 等. 用巢氏PCR 檢測防止香港型地中海貧血漏診[J]. 臨床檢驗雜志, 2014, 32(9): 713-715.

[10] 鐘良英, 汪芳, 陳培松, 等. HKαα 合并東南亞型缺失地中海貧血的基因型與血液學分析[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2018, 98(2): 117-121.

[11] Wu MY, Li J, Li SC, et al. Frequencies of HKαα and anti-HKαα alleles in Chinese carriers of silent deletional α-thalassemia[J]. Hemoglobin, 2015, 39(6): 407-411.

[12] 吳蓓穎, 江岑, 王也飛, 等. 血常規(guī)、血清鐵及血紅蛋白電泳聯(lián)合檢測在地中海貧血非高發(fā)地區(qū)的篩查意義[J]. 中華血液學雜志, 2016, 37(10): 908-911.