潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清miR-23a-3p 和miR-27a-3p 的表達 水平及其作用的研究

陳 巍，韓 崢，鄒艷麗，黃莎莎，田 霞

武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）消化內(nèi)科，武漢 430060

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種消化道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為結(jié)腸和直腸彌漫性、連續(xù)性淺表炎癥，并伴隨著相應(yīng)的組織學(xué)變化[1]。臨床上常表現(xiàn)為出血性腹瀉、腸運動時腹部痙攣等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[2-3]。UC 發(fā)病原因及機制并不十分明確，其治療方法也較為局限[4]。腸上皮細胞作為腸黏膜屏障中的主要組成部分，其凋亡水平影響腸黏膜屏障功能的維持。UC 嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)可使腸道屏障通透性增加，腸上皮細胞凋亡加劇，腸道穩(wěn)態(tài)被破壞，甚至促發(fā)癌變[5]。因此，了解UC 中腸上皮細胞凋亡機制，對于維持腸道穩(wěn)態(tài)具有一定的意義，也可為緩解UC 癥狀提供新的治療方向。

通過生物信息學(xué)方法，篩選出UC 致病相關(guān)基因，并進行全面分析，找出與疾病相關(guān)的核心基因，有利于為UC 的研究提供新的思路[6]。研究[7]表明，miRNA 在腸道黏膜中的差異表達對炎癥性腸病的腸道屏障功能具有重要的調(diào)控作用。在前期研究中，對比分析UC 腸黏膜和正常腸黏膜GEO（gene expression omnibus）芯片數(shù)據(jù)，篩選出了35 個差異miRNA 及其對應(yīng)的靶基因，其中miR-23a-3p 和miR-27a-3p 可能分別對過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PPARGC1A）和PH 域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2，PHLPP2）基因具有調(diào)控作用（尚未發(fā)表）。而PPARGC1A 和PHLPP2 皆與線粒體途徑介導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān)[8-9]。因此，本研究擬通過小鼠UC 模型探究miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在UC 小鼠血清中的表達水平及在UC 中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20 只雄性SPF 級C57BL/6 小鼠購自三峽大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2017-0012，6 ～7 周齡，飼養(yǎng)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司模型動物研究院SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK（鄂）2018-0104，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。飼養(yǎng)條件：溫度22 ～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照每日明暗各12 h。本動物實驗操作符合《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium，DSS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨購自美國Sigma 公司；糞便隱血檢測試劑盒購自安徽深藍醫(yī)療科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；SYBR Green PCR 試劑盒購自美國KAPA Biosystems 公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore 公司；蛋白質(zhì)標(biāo)志物購自美國Thermo公司；白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA 試劑盒，兔抗鼠PPARGC1A、PHLPP2、B 淋巴細胞瘤2 蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、細胞色素C（cytochrome c， CYT-C）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗鼠胱天蛋白酶3 剪切體（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases，cleavedcaspase-3）抗體購自英國Abcam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型構(gòu)建 將20 只C57BL/6 小鼠隨機分為對照組和模型組，每組10 只。模型組小鼠自由飲用每日新鮮配制的5% DSS 溶液[10]，對照組正常飲水。每日記錄小鼠體質(zhì)量、進食情況、精神狀態(tài)等一般情況，觀察小鼠糞便形態(tài)并采用糞便隱血檢測試劑盒檢測糞便隱血情況。DSS 誘導(dǎo)7 d 后，收集小鼠全血，分離血清，然后將小鼠頸椎脫臼處死，剖腹取出小鼠結(jié)腸，觀察結(jié)腸病理變化，并測量其長度，稱取質(zhì)量（濕重），取遠端結(jié)腸于4%中性甲醛中固定，剩余結(jié)腸組織于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 小鼠疾病活動指數(shù)評分 根據(jù)小鼠糞便性狀、隱血情況以及體質(zhì)量下降百分比計算小鼠疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）[11]，評分等級：①糞便性狀正常為0 分，軟便（不黏附于肛門的半成形糞便）為1 ～2 分， 腹瀉（可黏附于肛門的不成形糞便）為3 ～4 分。 ②糞便隱血陰性為0 ～1 分（陰性為0 分，當(dāng)同時出現(xiàn)軟便或體質(zhì)量下降1%～5%為1 分），隱血陽性為2 ～3分，肉眼血便為4 分。③體質(zhì)量無下降為0 分，體質(zhì)量下降≤ 5%為1 分，下降>5%且≤ 10%為2 分，下降>10% 且≤ 15%為3 分，下降>15%為4 分。DAI= （糞便性狀計分+糞便隱血計分+體質(zhì)量下降計分） /3，通過DAI 評估造模后小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)腸組織病理形態(tài) 取出固定的結(jié)腸組織，進行脫水、浸蠟包埋后，切成厚度為4 μm 的組織切片。水浴中展片，將切片貼附于載玻片上，然后烤片。將組織切片脫蠟至水，經(jīng)過蘇木精染液染色5 min，伊紅染液染色3 min，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察拍照。采用Geboes 分級指數(shù)[11]評估結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.3.4 ELISA 檢測血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平 采用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 濃度，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 qRT-PCR 檢測血清中miR-23a-3p 和miR-27a-3p表達 提取小鼠血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA 為模板進行PCR 擴增，以U6 為內(nèi)參基因，采用2－??CT法計算miR-23a-3p、miR-27a-3p 相對表達量（表1）。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.6 Western blotting 檢測PPARGC1A、PHLPP2、BAX、BCL-2、CYT-C 和cleaved-caspase-3 蛋白表達 RIPA 裂解液裂解小鼠結(jié)腸組織，提取總蛋白。蛋白質(zhì)定量后，以20 μg 蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，加入一抗稀釋液（抗PPARGC1A、PHLPP2、BAX、BCL-2、CYT-C、GAPDH 抗體稀釋比1:1 000，抗cleaved-caspase-3 抗體稀釋比1:5 000），濕盒中室溫孵育1 h。洗膜后，加入經(jīng)HRP 標(biāo)記的二抗（稀釋比1:20 000），濕盒中室溫孵育1 h。洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影，置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，讀取條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料用x—±s 表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠DAI 評估分析

在DSS 誘導(dǎo)期間，對照組小鼠的采食、毛發(fā)以及日?；顒忧闆r均正常，而模型組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、采食減少、體質(zhì)量減輕、腹瀉、肛周毛發(fā)被污染，肉眼血便等現(xiàn)象。對2 組小鼠的體質(zhì)量下降比例、糞便性狀及隱血情況進行評分，結(jié)果顯示，與對照組（DAI=0）比較，模型組DAI 評分（3.84±0.21）顯著升高（P=0.000）。

2.2 小鼠結(jié)腸濕重及長度比較

DSS 誘導(dǎo)后，小鼠結(jié)腸長度縮短、濕重減輕，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000，見圖1、 表2）。

圖1 對照組（A）和模型組（B）小鼠的結(jié)腸組織長度Fig 1 Lengths of colon tissues in control group (A) and model group (B)

表2 對照組和模型組結(jié)腸組小鼠織濕重及長度比較Tab 2 Comparison of wet weights and lengths of colon tissues between control group and model group

2.3 小鼠結(jié)腸組織病理觀察

通過蘇木精-伊紅（H-E）染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸組織中出現(xiàn)炎癥細胞嚴(yán)重浸潤的現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)被破壞，局部出現(xiàn)糜爛和潰瘍（圖2）。統(tǒng)計2 組結(jié)腸組織的Geboes 分級指數(shù)，對照組為0.83±0.31，模型組為10.53±2.80，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。

2.4 小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較

與對照組比較結(jié)果見表3，模型組小鼠血清中IL-1β、 IL-6 及TNF-α 濃度均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000）。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（H-E 染色，×400）Fig 2 Histopathological changes of the colons in mice observed (H-E staining, ×400)

表3 對照組和模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較Tab 3 Comparison of levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in mice sera between control group and model group

2.5 小鼠血清中miR-23a-3p、miR-27a-3p 表達的變化

與對照組比較結(jié)果見圖3，模型組小鼠血清中miR-23a-3p 和miR-27a-3p 表達水平均顯著降低（P=0.001，P=0.007）。

2.6 小鼠結(jié)腸組織中PPARGC1A、PHLPP2 蛋白表達變化

與對照組比較，模型組PPARGC1A 和PHLPP2 的蛋白表達水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000，圖4）。

圖3 對照組和模型組小鼠血清中miR-23a-3p、miR-27a-3p 表達水平的比較Fig 3 Comparison of the expression levels of miRNA-23a-3p and miRNA-27a-3p in mice sera between control group and model group

2.7 小鼠結(jié)腸組織中線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達變化

檢測小鼠結(jié)腸組織中線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組BAX、CYT-C 和cleaved-caspase-3 表達水平顯著升高，而BCL-2 表達顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000，圖5）。

圖4 Western blotting 檢測小鼠結(jié)腸組織中PPARGC1A 和PHLPP2 蛋白的表達Fig 4 Expressions of PPARGC1A and PHLPP2 in mice colons detected by Western blotting

圖5 Western blotting 檢測小鼠結(jié)腸組織中BAX、BCL-2、CYT-C 和cleaved-caspase-3 蛋白的表達Fig 5 Expressions of BAX, BCL-2, CYT-C and cleaved-caspase-3 in mice colons detected by Western blotting

3 討論

DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠模型，簡單易操作，被廣泛應(yīng)用于實驗研究中[11]。本研究采用5% DSS 連續(xù)自由飲用7 d 構(gòu)建UC 模型，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、腹瀉、便血等癥狀，DAI 評分顯著升高，結(jié)腸長度縮短，濕重減輕，提示模型構(gòu)建成功。腸黏膜屏障主要由黏膜基底膜、上皮細胞層及細胞分泌的黏液層構(gòu)成，是腸道發(fā)揮正常功能，抵御外來抗原入侵的重要防線[13]。腸黏膜屏障完整性受損是UC 等炎癥性腸病的主要特征之一，本研究結(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸中出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，黏膜出現(xiàn)潰瘍、糜爛等現(xiàn)象，符合UC 病理特征。炎癥細胞因子作為炎癥介質(zhì)在UC 腸黏膜病理性損傷中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用，IL-1β[14]、IL-6[15]、 TNF-α[16]等促炎因子引起腸道炎癥反應(yīng)，誘發(fā)或加重UC[17]。檢測UC 小鼠血清中細胞因子水平，IL-1β、IL-6及TNF-α 水平均顯著高于對照組正常小鼠，說明UC 小鼠機體內(nèi)炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，與病理觀察結(jié)果一致。

miRNA 是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在機體正常生理以及疾病發(fā)生、發(fā)展等方面均具有重要的調(diào)控作用，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[18]。miRNA 通過與目標(biāo)mRNA 的3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）區(qū)域結(jié)合后將其降解，抑制mRNA 翻譯，從而發(fā)揮對靶基因特異性調(diào)控的功能[19]。大量研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，miRNA 可通過調(diào)控腸上皮細胞功能，影響腸黏膜屏障，因此研究UC 差異表達的miRNA 可能為UC 的治療提供更多的可能。miR-23a 在UC 中的調(diào)控作用已有相關(guān)文獻報道[22]，且miR-23a-3p 在UC 臨床診斷中具有重要意義，是一種潛在的診斷和預(yù)后指標(biāo)[23]，但miR-23a-3p 在UC 中具體作用并不明確。在本研究中，我們探究了通過生物信息技術(shù)篩選出與UC 相關(guān)的miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在正常小鼠和UC 小鼠血清中的表達水平，及其可能調(diào)控基因PPARGC1A、PHLPP2 在結(jié)腸組織中的表達水平，結(jié)果顯示miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在模型組小鼠血清中的表達均明顯低于正常小鼠，而PPARGC1A 和PHLPP2 在結(jié)腸組織中的表達顯著升高。根據(jù)已有文獻[24]報道，miR-23a和miR-27a 可通過caspase 依賴或caspase 非依賴途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，且PPARGC1A 和PHLPP2 均與細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)[8-9]，因此我們推測miR-23a-3p 和miR-27a-3p可能是UC 潛在的標(biāo)志物，其在血清中表達下調(diào)，調(diào)控的靶基因PPARGC1A 和PHLPP2 在結(jié)腸組織中的表達升高，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，介導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞凋亡，破壞腸黏膜屏障完整性，從而參與UC 的病程進展。

BCL-2/BAX 在線粒體途徑介導(dǎo)的caspase 依賴性凋亡中發(fā)揮重要的作用，BCL-2 為抑凋亡蛋白，BAX 為促凋亡蛋白，BAX 轉(zhuǎn)移至線粒體膜，可降低線粒體膜電位，改變膜通透性，導(dǎo)致CYT-C 從線粒體中釋放，觸發(fā)caspase-3 凋亡級聯(lián)反應(yīng)[25]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中BAX、CYT-C 及cleaved-caspase-3 表達上調(diào)，而BCL-2 表達下調(diào)，提示UC 小鼠結(jié)腸組織中線粒體凋亡途徑被激活，驗證了上述PPARGC1A 和PHLPP2 表達上調(diào)引發(fā)線粒體凋亡途徑的推論。

綜上所述，miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在UC 小鼠血清中表達下調(diào)，可能降低了對PPARGC1A 和PHLPP2 的抑制調(diào)控，觸發(fā)結(jié)腸組織中線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，破壞腸黏膜屏障，從而參與了UC 的發(fā)生和發(fā)展。但本研究未對幾個分子之間的相互關(guān)系進行驗證，因此有待進一步的實驗加以證實。此外，本研究的UC 模型小鼠血清中miR-23a-3p 呈低表達，與Wu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)的miR-23a在UC 患者組織中表達增加的結(jié)果存在差異，可能是由于所檢測的miRNA 亞型不同所導(dǎo)致。由于miR-23a-3p 在UC 中的具體作用機制尚不明確，后期我們將從臨床研究出發(fā)進行驗證與深入探討。

參·考·文·獻

[1] Ford AC, Paul M, Hanauer SB. 譚蓓, 譯. 潰瘍性結(jié)腸炎[J]. 英國醫(yī)學(xué)雜志中文版, 2017, 20(7): 387-392.

[2] Baumgart DC, Sandborn WJ. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies[J]. Lancet, 2007, 369(9573): 1641-1657.

[3] Stawowczyk E, Kawalec P. A systematic review of the cost-effectiveness of biologics for ulcerative colitis[J]. Pharmacoeconomics, 2018, 36(4): 419-434.

[4] 孫健, 高文艷, 林一帆. 潰瘍性結(jié)腸炎病因和發(fā)病機制研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2017, 19(4): 94-97.

[5] 周海新, 方健松, 張濤, 等. miR-21 介導(dǎo)腸上皮細胞凋亡維持腸道穩(wěn)態(tài)參與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌變研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2017, 52(4): 523-527.

[6] 夏守兵, 許春杰, 蔣春暉, 等. 潰瘍性結(jié)腸炎及其惡性并發(fā)癥的生物信息學(xué)分析和潛在治療藥物篩選[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）, 2020, 40(3): 317-325.

[7] Chen WX, Ren LH, Shi RH. Implication of miRNAs for inflammatory bowel disease treatment: systematic review[J]. World J Gastrointest Pathophysiol, 2014, 5(2): 63-70.

[8] Zhang G, Wan Y, Zhang Y, et al. Expression of mitochondria-associated genes (PPARGC1A, NRF-1, BCL-2 and BAX) in follicular development and atresia of goat ovaries[J]. Reprod Domest Anim, 2015, 50(3): 465-473.

[9] Saxena S, Shukla S, Kakkar P. Berberine induced modulation of PHLPP2-Akt-MST1 kinase signaling is coupled with mitochondrial impairment and hepatoma cell death[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2018, 347: 92-103.

[10] 郝微微, 溫紅珠, 馬貴同, 等. 人參皂苷Rg1 對DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠凝血功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2013, 21(5): 238-242.

[11] 丁洋, 丁康, 譚妍妍, 等. 潰結(jié)改良方改善DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠腸道炎癥反應(yīng)的機制研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2019, 35(3): 297-302.

[12] Geboes K, Riddell R, Ost A, et al. A reproducible grading scale for histological assessment of inflammation in ulcerative colitis[J]. Gut, 2000, 47(3): 404-409.

[13] 倪杰明. 腸黏膜屏障損傷在潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究進展[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2018, 53(5): 815-818.

[14] Sugawara R, Lee EJ, Jang MS, et al. Small intestinal eosinophils regulate Th17 cells by producing IL-1 receptor antagonist[J]. J Exp Med, 2016, 213(4): 555-567.

[15] Nigar S, Yamamoto Y, Okajima T, et al. Synergistic oligodeoxynucleotide strongly promotes CpG-induced interleukin-6 production[J]. BMC Immunol, 2017, 18(1): 44.

[16] Fischer S, Rath T, Geppert CI, et al. Long-term combination therapy with anti-TNF plus vedolizumab induces and maintains remission in therapy-refractory ulcerative colitis[J]. Am J Gastroenterol, 2017, 112(10): 1621-1623.

[17] 崔暢婉, 孫崢嶸. 潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制研究進展[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2019, 39(1): 77-81.

[18] Paul P, Chakraborty A, Sarkar D, et al. Interplay between miRNAs and human diseases: a review[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(3): 2007-2018.

[19] Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNAmediated gene silencing[J]. Nat Rev Genet, 2015, 16(7): 421-433.

[20] Wang H, Chao K, Ng SC, et al. Pro-inflammatory miR-223 mediates the crosstalk between the IL23 pathway and the intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J]. Genome Biol, 2016, 17: 58.

[21] He C, Yu T, Shi Y, et al. MicroRNA 301A promotes intestinal inflammation and colitis-associated cancer development by inhibiting BTG1[J]. Gastroenterology, 2017, 152(6): 1434-1448.e15.

[22] Feng J, Gao Q, Liu Q, et al. Integrated strategy of differentially expressed genes associated with ulcerative colitis[J]. Mol Med Rep, 2017, 16(5): 7479-7489.

[23] Polytarchou C, Oikonomopoulos A, Mahurkar S, et al. Assessment of circulating microRNAs for the diagnosis and disease activity evaluation in patients with ulcerative colitis by using the nanostring technology[J]. Inflamm Bowel Dis, 2015, 21(11): 2533-2539.

[24] 聶明月, 楊曉葵. miR-23a 和miR-27a 在卵巢中的生理和病理作用[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志, 2014, 33(5): 367-369.

[25] Wang QQ, Zhang LL, Yuan XD, et al. The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons[J]. PLoS One, 2016, 11(10): e0163327.

[26] Wu F, Zikusoka M, Trindade A, et al. MicroRNAs are differentially expressed in ulcerative colitis and alter expression of macrophage inflammatory peptide-2α[J]. Gastroenterology, 2008, 135(5): 1624-1635.e24.