肥胖和肥胖抵抗大鼠的正畸牙移動速率及壓力側(cè)骨改建差異研究

羅 虹 ，武紅彥 ，譚 璽 ，戴紅衛(wèi) , ，黃 蘭 ,

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，重慶401147；2. 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室，重慶401147；3. 重慶市高校市級口腔生物 醫(yī)學(xué)工程重點實驗室，重慶401147

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)顯示，2016 年有超過19 億的成年人超重，超過6.5 億的人患有肥胖[1]。個體對致肥胖環(huán)境的敏感性是由復(fù)雜因素決定的[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，排除遺傳因素后，飲食在致肥胖過程中可能起了關(guān)鍵作用，尤其是高脂飲食（high-fat diet，HFD）。但是，有人生活在致肥胖環(huán)境中，卻仍可保持苗條的身材。動物實驗也有類似現(xiàn)象。Levin 等[5]首先報道了在給SD 大鼠喂食HFD 后，一些大鼠發(fā)展成為HFD 誘導(dǎo)的肥胖（diet-induced obese，DIO）大鼠，而另一些則能在易致胖環(huán)境中保持體質(zhì)量并發(fā)展成為HFD 誘導(dǎo)的肥胖抵抗（diet-resistant，DR）大鼠。這些現(xiàn)象在其他研究中也被證實[6-7]。

肥胖與骨代謝之間的相互作用十分復(fù)雜，機制至今仍不清晰。越來越多的證據(jù)表明，HFD 誘導(dǎo)的肥胖會對骨骼質(zhì)量和骨骼健康產(chǎn)生不利影響[8-9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)HFD 可以通過增加破骨細胞和減少成骨細胞來破壞頜骨骨量和骨小梁結(jié)構(gòu)，并造成牙槽骨水平性骨吸收，但尚未有關(guān)于HFD 誘導(dǎo)的DR 大鼠牙槽骨研究的報道。在正畸牙移動過程中，機械應(yīng)力觸發(fā)牙周膜中的應(yīng)力/應(yīng)變分布改變，啟動信號級聯(lián)，實現(xiàn)了牙槽骨張壓力側(cè)或增殖或吸收的骨改建，從而使牙齒發(fā)生移動。而破骨細胞的數(shù)量和活性以及壓力側(cè)骨改建的快慢決定了牙齒牙移動的速率[11]。已有臨床報道[12-13]肥胖會影響正畸牙移動的速率。但是，目前關(guān)于肥胖與正畸牙移動的基礎(chǔ)研究很少，尤其關(guān)于在機械壓應(yīng)力環(huán)境下DR 大鼠牙槽骨發(fā)生的變化及可能的機制研究 更少。

本研究通過建立DIO 和DR 大鼠正畸牙移動模型，觀察DIO 和DR 大鼠正畸牙移動速率和壓力側(cè)骨改建中的變化，探索肥胖和肥胖抵抗?fàn)顟B(tài)對牙齒加力過程中的影響，進而探索其可能存在的機制，以期為肥胖和肥胖抵抗患者的臨床正畸治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只3 周齡SD 雄性大鼠，平均體質(zhì)量為（50±10） g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（渝）2013-0002。實驗方案和操作均獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2019 年倫審46 號）。

1.2 材料、試劑和設(shè)備

普通飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程公司），高脂飼料（美國Research Diets 公司），Micro-CT（瑞士SCANCO 公司），正畸鎳鈦螺旋拉簧（北京有研醫(yī)療器械有限公司），光固化樹脂（美國3M Unitek 公司），抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒（No.387，美國Sigma 公司），免疫組化檢測試劑盒（SP-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），骨鈣蛋白一抗（武漢塞維爾生物科技有限公司），顯微病理圖文分析系統(tǒng)（OLYMPUS BX41，日本Olympus 公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS，重慶蒙博生物科技有限公司），石蠟切片機（德國Leica 公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立肥胖和肥胖抵抗大鼠模型 選取40 只SD 大鼠，在第1 周給全部大鼠喂食普通飼料（normal diet，ND）以適應(yīng)新環(huán)境。1 周后，將40 只SD 大鼠隨機分為2 組：ND 組（n=10），給予普通飼料喂養(yǎng)；HFD 組（n=30），給予高脂飼料喂養(yǎng)。每周稱量1 次體質(zhì)量，測量1 次體長。經(jīng)過肥胖誘導(dǎo)期（8 周）后，將HFD 組大鼠按照體質(zhì)量增加量排序，體質(zhì)量增加量位于前1/3 的大鼠為DIO 組（n=10），體質(zhì)量增加量位于后1/3 的大鼠為DR組（n=10），體質(zhì)量增加量位于中1/3 的大鼠排除[14]。

1.3.2 建立正畸牙移動模型 將ND 組、DIO 組和DR 組分別建立正畸牙移動模型。將大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，用0.2 mm 結(jié)扎絲將正畸鎳鈦螺旋拉簧固定在大鼠上中切牙和左側(cè)上頜第一磨牙之間，以提供0.49 N 的持續(xù)牽引力，使左側(cè)上頜第一磨牙發(fā)生近中移動。為了加強固位，在上中切牙和左側(cè)上頜第一磨牙的牙頸部制備了約0.5 mm 的固位溝，并用光固化樹脂固定。未放置加力裝置的右上頜第一磨牙作為對照側(cè)。每天檢查1 次加力裝置是否有脫落，如發(fā)現(xiàn)有脫落或損壞，則立即重新結(jié)扎。

1.3.3 制備標(biāo)本 3 組大鼠放置加力裝置加力14 d，空腹過夜后處死。收集大鼠的上頜磨牙及其周圍牙槽骨、附睪脂肪和腎周脂肪。對附睪脂肪和腎周脂肪進行稱重，計算脂體比，脂體比=（附睪脂肪質(zhì)量+腎周脂肪質(zhì)量） /體質(zhì)量×100%。標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液中固定。計算Lee's 指數(shù)，Lee's 指數(shù)=（體質(zhì)量×103/體長）1/3。

1.3.4 Micro-CT 掃描與分析 使用Micro-CT 對3 組大鼠上頜磨牙及其周圍牙槽骨標(biāo)本進行掃描，掃描條件設(shè)置為：①圖像分辨率為15 μm。②電壓為70 kV。③114 μA的電流。每個標(biāo)本的平均掃描時間約20min。掃描結(jié)束后，使用Micro-CT 自帶的程序?qū)?biāo)本進行分析。通過測量CT 圖像上第一磨牙遠中最凸點與第二磨牙近中最凸點之間的距離來計算牙齒的移動距離。在上頜第一磨牙近中根近中側(cè)的根中1/3 處，距離牙根表面300 μm 處選取一個300 μm×300 μm×300 μm 的立方體，分析該處骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)。主要測量參數(shù)為：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數(shù)（percentage trabecular bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)（trabecular number，Tb. N）、骨小梁寬度（trabecular thickness，Tb. Th）和骨小梁間隙（trabecular separation，Tb. Sp）。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 3 組大鼠上頜骨標(biāo)本固定24 h 后，置于10% 的中性乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脫鈣6周。標(biāo)本依次進行脫水、透明和包埋，按平行于上頜第一磨牙近遠中的方向用石蠟切片機連續(xù)切片，切片厚度為7 μm。選取第一磨牙牙根及牙周組織完整的切片，經(jīng)過脫蠟透明后，按照抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒說明書中的步驟進行染色。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 將“1.3.5”制備的組織切片先進行脫蠟和水化。然后行抗原修復(fù)，再用免疫組化檢測試劑盒中的10%山羊血清封閉，以減少背景染色。甩去封閉液，將OCN 一抗按1:100 的比例稀釋，放入濕盒，4 ℃過夜孵育。然后用PBS 緩沖液沖洗，再滴加3%過氧化氫阻斷劑，PBS 沖洗，加入二抗孵育20 min。最后進行二氨基聯(lián)苯胺（3-3'-diaminobenzidine，DAB）顯色、復(fù)染胞核和脫水封片。

圖1 3 組大鼠體質(zhì)量、脂體比和Lee's 指數(shù)比較Fig 1 Comparison of body weight，adiposity index and Lee's index of rats in 3groups

1.3.7 圖像分析 采用OLYMPUS BX41 顯微病理圖文分析系統(tǒng)觀察計算圖像的平均光密度和壓力側(cè)牙槽骨表面的破骨細胞數(shù)。破骨細胞計數(shù)在上頜第一磨牙遠中頰根的近中即壓力側(cè)隨機選取3 個不重疊視野（400×）進行圖像采集；平均光密度選取壓力側(cè)牙周膜區(qū)域的視野（400×）進行測量。由同一實驗者在不同的時間點對每個樣本進行3 次測量后取平均值。

1.4 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行分析。定量數(shù)據(jù)用x—±s 表示。用單因素方差分析和Tukey 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠體質(zhì)量、脂體比和Lee's 指數(shù)比較

8 周的飲食干預(yù)后，3 組大鼠的比較結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：DIO 組的體質(zhì)量（521.70±6.27） g 明顯高于ND組（424.80±6.08）g 和DR 組大鼠（444.00±4.54）g，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，P=0.000）；DIO 組的脂體比明顯高于ND 組和DR 組（P=0.001，P=0.008）；DIO 組的Lee's 指數(shù)明顯高于ND 組和DR 組（P=0.000，P=0.007）。

2.2 3 組大鼠牙移動距離比較

放置加力裝置14d 后，ND、DIO 和DR 組大鼠的牙移動距離比較見圖 2。結(jié)果顯示：DR 組的牙移動距離（0.09±0.01）mm 與DIO 組（0.22±0.02）mm 和ND 組（0.17±0.02）mm 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，P=0.005）。

2.3 未加力時3 組大鼠牙槽骨近中側(cè)骨質(zhì)參數(shù)的比較

使用Micro-CT 觀察加力前3 組大鼠近中側(cè)牙槽骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果見圖 3。結(jié)果顯示： ND 組的BMD 高于DR 和DIO 組（P=0.029，P=0.001），BV/TV高于DR 和DIO 組（P=0.025，P=0.016）；Tb.Sp 均低于DR 和DIO 組（P=0.014，P=0.000）；DR 組的Tb.Sp 低于DIO 組（P=0.000）。

圖2 3 組大鼠牙移動距離的比較Fig 2 Comparison of the teeth movement distance of rats in3 groups

圖3 未加力時3 組大鼠骨質(zhì)參數(shù)的比較Fig 3 Comparison of bone parameters of rats in 3 groups without force application

2.4 3 組大鼠牙槽骨近中（壓力）側(cè)骨質(zhì)參數(shù)的變化

加力14d 后，3 組大鼠近中根壓力側(cè)骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化如圖 4 所示。Micro-CT 分析顯示：DR 組與ND 組的BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th，均高于DIO 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，P=0.007；P=0.000，P=0.000；P=0.005，P=0.014；P=0.000，P=0.001）；ND 組與DR 組的Tb.Sp 低于DIO 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，P=0.000）。加力14 d 后，DR 組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 為3 組中最高，而DIO 組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 為3 組中最低。

圖4 加力14 d 后3 組大鼠骨質(zhì)參數(shù)的比較Fig 4 Comparison of bone parameters of rats in 3 groups after 14 days of orthodontic tooth movemen

2.5 TRAP 染色結(jié)果

沿骨表面的多核TRAP 陽性細胞被認為是活性破骨細胞。加力前，ND 組、DIO 組和DR 組的壓力側(cè)少見或未見破骨細胞（圖5）。放置加力裝置14 d 后，DR 組的破骨細胞數(shù)量緩慢增加并低于DIO 組和ND 組（P=0.001，P=0.005）。而DIO 組的破骨細胞數(shù)量迅速增多，明顯高于ND 組和DR 組的破骨細胞數(shù)量（P=0.002，P=0.001）。

2.6 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）是鈣化相關(guān)蛋白中的一種，是成骨細胞的特異性標(biāo)志物，在成骨細胞分化末期表達。3 組OCN 比較結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示：加力前，DR 組OCN 的陽性表達多于DIO 組（P=0.004）。加力14 d 后，DIO 組OCN 的表達較ND 組增多（P=0.047）。

圖 5 TRAP 染色和破骨細胞數(shù)的變化（×400）Fig 5 TRAP staining and changes of the number of osteoclasts in each group (×400)

圖6 3 組大鼠OCN 免疫組織化學(xué)染色（×400）Fig 6 Immunohistochemistry staining of OCN in periodontal ligament in 3 groups of rats (×400)

3 討論

肥胖是骨質(zhì)疏松癥和骨穩(wěn)態(tài)失衡的一個獨立危險因素[15]。本研究中，在未加力時，Micro-CT 分析顯示HFD誘導(dǎo)的肥胖降低了頜骨骨密度和骨量，從而對骨質(zhì)量和骨骼健康產(chǎn)生有害影響，這與既往研究[16]的結(jié)果是一致的。本研究還發(fā)現(xiàn)同樣進食HFD 的DR 大鼠的骨密度和骨量也受到了損害，但是其受損程度較DIO 大鼠要輕一些。結(jié)果提示，HFD 會在一定程度上損害DR 大鼠頜骨的骨微結(jié)構(gòu)。研究[17]發(fā)現(xiàn)，長期喂養(yǎng)高脂飼料會顯著降低DR 小鼠的股骨性能參數(shù)如骨強度、直徑和股骨鈣質(zhì)量，本實驗結(jié)果與其一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，DR 大鼠壓力側(cè)骨改建的速度慢于DIO大鼠。Micro-CT 數(shù)據(jù)顯示，在加力14 d 后，DIO 組的Tb.N 和Tb.Th 顯著下降，導(dǎo)致Tb.Sp 迅速增大，從而引起B(yǎng)MD 和BV/TV 迅速降低，這表明在壓力側(cè)有大量的骨吸收發(fā)生。研究[11,18]表明破骨細胞在壓力側(cè)骨改建過程中起著至關(guān)重要的作用。在加力14 d 后，本實驗中DIO 組大鼠壓力側(cè)牙槽骨表面的破骨細胞數(shù)是最多的，并且顯著高于ND 和DR 組大鼠。既往研究[19]證實，HFD 可通過改變骨髓環(huán)境促進破骨細胞生成導(dǎo)致年幼小鼠骨質(zhì)流失。然而，DR 組大鼠壓力側(cè)破骨細胞數(shù)卻顯著低于ND 和DIO組，并且是3 組大鼠中破骨細胞數(shù)最少的。DR 組大鼠在加力14d 后的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)如BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 為3 組中最高，同時顯著高于DIO 組。因此，HFD可能是通過促進破骨細胞生成而引起DIO 大鼠壓力側(cè)發(fā)生明顯的骨吸收，從而導(dǎo)致了活躍的骨改建。DR 大鼠骨改建變得緩慢的原因可能是其抑制了破骨細胞的 生成。

破骨細胞是影響牙齒移動速率的關(guān)鍵因素[18]。本研究發(fā)現(xiàn)HFD 引起的肥胖或者肥胖抵抗可能通過促進或抑制破骨細胞生成影響骨骼重塑過程來增快或減慢牙移動速率。既往研究發(fā)現(xiàn)，在牙齒排齊階段的第1 周內(nèi)，肥胖患者的牙移動速率要明顯快于正常體質(zhì)量患者；但是在1 周后，各組之間的牙齒排齊速率卻沒有差異[12]。我們發(fā)現(xiàn)ND 組和DIO 組在第14 天的牙移動速率沒有統(tǒng)計學(xué)差異，原因可能是DIO 組成骨細胞分化和活性較ND 組增強。同時，DR 組在第14 天的牙移動速率顯著慢于DIO 組和ND組，并且其牙移動速率在3 組中是最慢的。

本研究中，DIO 大鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖傾向，相較于ND 組大鼠，其體質(zhì)量、脂體比和Lee's 指數(shù)顯著增加。同樣是進食HFD 8 周，DR 大鼠的相關(guān)指標(biāo)卻顯著低于DIO 大鼠。這與既往研究[20]結(jié)果一致。脂肪組織分泌的脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素等能影響破骨細胞的活性和數(shù)量以及成骨細胞和脂肪細胞的分化[21-22]。瘦素對骨代謝的影響是復(fù)雜多樣的，可以通過中樞和外周神經(jīng)途徑直接或間接地調(diào)控骨的形成[23]。脂聯(lián)素可以抑制破骨細胞的活性，還可通過誘導(dǎo)成骨細胞的分化和增殖來減少骨吸收[24-25]。抵抗素可通過促進成骨細胞增殖和破骨細胞分化來刺激骨骼重塑[26]。DIO 大鼠和DR 大鼠之間體脂質(zhì)量的差異，可能影響了相關(guān)脂肪因子的分泌，從而影響了破骨細胞的數(shù)量和活性，最終影響了2 組的牙移動 速率。

綜上所述，HFD 引起的肥胖或者肥胖抵抗可能通過促進或抑制破骨細胞生成，從而影響骨改建過程來增快或減慢牙移動速率。

參·考·文·獻

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