經(jīng)靜脈注射的單鏈9 型腺相關病毒介導基因在星形膠質(zhì)細胞表達

王曉丹，楊 釗，沈帆霞,

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院北院，上海201801；2. 美國加州大學舊金山分校麻醉與圍術期醫(yī)學系腦血管研究中心，舊金山94110，美國

腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體是一種單鏈DNA 病毒，屬于非致病的、輔助病毒依賴型的細小病毒家族成員。與其他病毒載體相比，AAV 具有免疫原性較低、能夠感染分裂和非分裂細胞、介導目的基因在宿主體內(nèi)長期表達等特點[1]。AAV 可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究和基因治療理想的重組病毒載體。

AAV 載體有多種血清型，然而大多數(shù)血清型由于不能通過血腦屏障（brain blood barrier，BBB），僅能通過立體定向注射等方法將其直接注射至腦中。經(jīng)靜脈給藥的9 型AAV（AAA serotype 9，AAV9）能有效通過新生小鼠和非人靈長類動物的BBB 而受到廣泛的關注[2]。然而經(jīng)靜脈注射的AAV9 不僅介導基因在腦部表達，也可能在其他外周器官如肝臟和心臟表達。因此如何調(diào)控目的基因在病變部位表達已成為近年來基因治療領域的研究熱點之一。組織出現(xiàn)缺氧時，低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）與低氧反應元件（hypoxia-responsive element，HRE）相互作用，可以誘導一系列缺氧響應相關基因表達，如促紅細胞生成素和血管內(nèi)皮生長因子。因此在啟動子區(qū)加入9 個拷貝HRE 作為調(diào)控元件的AAV 載體能控制目的基因在缺血、缺氧區(qū)表達[3]。

自身互補AAV9（self-complementary AAV9，scAAV9）能夠介導目的基因在新生小鼠腦中穩(wěn)定表達，但當目的基因的互補DNA（complementary DNA，cDNA）片段大于2.1 kb，則無法構建scAAV。因而，本研究用單鏈AAV9（single-stranded AAV9，ssAAV9） 構建載體，探討通過靜脈注射含9 個拷貝HRE 的ssAAV9（AAV9-H9LacZ）是否能有效控制目的基因LacZ [β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）編碼基因]在成年小鼠腦缺血區(qū)表達，并研究其可轉(zhuǎn)染的腦細胞類型，以期為腦血管病的基因治療提供新的方法和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡CD-1 雄性小鼠購自美國Charles River 實驗室，動物飼養(yǎng)和實驗步驟均符合加州大學舊金山分校動物倫理委員會的要求。小鼠在清潔級動物房飼養(yǎng)，每籠5 只，溫度控制在（25.0±1.0）℃。

1.2 AAV9-H9LacZ 構建和病毒包裝

AAV9 載體購自Vector Biolabs（美國），其中含β-gal編碼基因的啟動子（pβgal）。載體以Sma Ⅰ和Hind Ⅲ 為酶切位點進行酶切，在2 個末端反向重復序列（inverted terminal repeats，ITRs）之間插入LacZ cDNA 質(zhì)粒，并將9 個拷貝HRE 作為啟動子用來控制LacZ 基因表達[4]。AAV9-H9LacZ 病毒的包裝采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法（helperfree AAV 包裝系統(tǒng)）。2 個輔助質(zhì)粒（其中一個攜帶腺病毒的VA、E2A 和E4 區(qū)，另一個攜帶AAV 的Rep 和Cap基因）和AAV9-H9LacZ 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細胞，包裝AAV 重組病毒載體。采用氯化銫梯度離心純化病毒。通過DNA 斑點雜交分析確定病毒滴度[5]。

1.3 實驗分組

取12 只小鼠，隨機分為假手術組和腦缺血組，每組6 只。在遠端大腦中動脈閉塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）模型建立1 d 和5 d 后處死。取小鼠新鮮腦組織提取蛋白用于Western blotting，并制備石蠟切片用于免疫組織化學染色。

另外取12 只小鼠，全部建立dMCAO 模型，隨機分為對照組和AAV9-H9LacZ 組，每組6 只。dMCAO 模型建立后1 h 分別靜脈注射生理鹽水和AAV9-H9LacZ 病毒。模型建立5 d 后處死，取小鼠新鮮腦組織制備冰凍切片用于免疫熒光染色，取腦組織和肝臟組織用于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal）染色。

1.4 dMCAO 模型建立

1.5%異氟烷吸入麻醉小鼠。手術顯微鏡下，在右側眼眶和耳屏間切1 cm 切口。移除約2 mm2的頭骨后，用電凝阻塞大腦中動脈。后將骨板、顳肌復位并縫合皮膚。在手術過程中用熱毯將體溫保持在（37.0±0.5）℃。用激光多普勒血流儀（Vasamedics 公司，美國）監(jiān)測小鼠表面腦血流（surface cerebral blood flow，sCBF），如小鼠缺血核心區(qū)的sCBF 超過基線的15%則除外。

1.5 AAV9-H9LacZ 的靜脈注射

AAV9-H9LacZ 組在小鼠dMCAO 模型建立后1 h，經(jīng)頸靜脈注射溶解在200 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的AAV9-H9LacZ [1×1012GC，GC為基因組拷貝（genome copy）]。對照組經(jīng)頸靜脈注射等量的生理鹽水。

1.6 Western blotting 檢測

利用BCA（bicinchoninic acid）法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)7%～12%梯度凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，抗HIF-1α 抗體（1:500 稀釋；Novus 公司，美國）室溫孵育1 h，PBS清洗后，辣根過氧化物酶標記的抗體（1:2 000 稀釋；Amersham 公司，美國）孵育。使用增強型化學發(fā)光反應試劑盒（Amersham 公司，美國），曝光，顯影。用Image J 1.63 軟件定量分析蛋白條帶。

1.7 免疫組織化學染色

腦組織切片以抗HIF-1 抗體 （1:500 稀釋；Chemicon 公司，美國）孵育60 min，PBS 洗滌，滴加生物素化的二抗，PBS 洗滌，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染細胞核。

1.8 免疫熒光染色

dMCAO 模型建立5 d 后處死小鼠，腦組織迅速冷凍保存在－80℃。然后置恒冷冰凍切片機，由嘴側向尾側行序列冰凍切片，腦冠狀切片厚20 μm。免疫熒光染色所需特異性抗體為血小板 - 內(nèi)皮細胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗體（1:50 稀釋；AbD Serotec 公司，英國）、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1:500 稀釋；Sigma-Aldrich 公司，美國）、神經(jīng)元特異核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗體（1:500 稀釋；Chemicon 公司，美國）和β-gal 抗體（1:500 稀釋；Abcam公司，美國）。樣本在一抗溶液中孵育90 min，在二抗Alexa 594 抗小鼠IgG 和Alexa 488 抗兔IgG（1:500 稀釋；Invitrogen 公司，美國）中孵育60 min 后，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的防熒光淬滅封片劑（vectashield）封片。以PBS 代替一抗作陰性對照。用德國Leica DMLS 熒光顯微鏡采集圖像，每張切片在腦梗死周邊區(qū)選取2 個高倍視野。各組所選部位相同，用Image J 1.63 軟件對β-gal 陽性細胞定量分析。

1.9 X-gal 染色

腦和肝臟組織制備20 μm 厚冠狀切片，用0.5%戊二醛固定 10 min 后，在X-gal 溶液（5 mmol/L 鐵氰化鉀、5 mmol/L 亞鐵氰化鉀、2 mmol/L 氯化鎂、0.01%脫氧膽酸鈉、1 mg/mL X-gal）中孵育2 h。梯度乙醇脫水，封片，腦片掃描。藍色所示為β-gal 陽性區(qū)，淺紅色為腦缺血區(qū)。定量分析結果以β-gal 陽性區(qū)面積占腦缺血區(qū)面積的百分比表示。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，定量數(shù)據(jù)以x—±s 表示。組間比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腦缺血區(qū)HIF-1 的表達

免疫組織化學染色結果顯示，dMCAO 模型建立1 d和5 d 后 HIF-1 在腦缺血區(qū)陽性表達（圖1A）。Western blotting 結果見圖1B，局灶性腦缺血1 d 和5 d 后，小鼠缺血病灶局部HIF-1 的表達水平較假手術組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049，P=0.007）。

圖1 HIF-1 在腦缺血區(qū)的表達Fig 1 Expression of HIF-1 in the ischemic area

2.2 腦缺血區(qū)β-gal 的表達

在dMCAO 模型建立1 h 后，將AAV9-H9LacZ 經(jīng)頸靜脈注入小鼠體內(nèi)。dMCAO 模型建立后第5 日，處死小鼠，取腦組織制備切片。AAV9-H9LacZ 組和對照組可見左側大腦中動脈區(qū)域出現(xiàn)缺血灶，提示造模成功。X-gal染色結果顯示，AAV9-H9LacZ 組的腦缺血區(qū)周圍（缺血半暗帶區(qū)）可見深藍色的β-gal 陽性表達，在缺血區(qū)中心可見少量的β-gal 表達，在其他區(qū)域偶見β-gal 表達，而對照組在腦缺血區(qū)周圍和其他區(qū)域均未檢測到β-gal 表達（圖2A）。定量分析結果見圖2B，2 組β-gal 陽性區(qū)占腦缺血區(qū)面積的百分比的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。提示經(jīng)靜脈注射的AAV9-H9LacZ 能通過BBB 進入腦部，并主要在缺血區(qū)周圍表達。

圖2 X-gal 染色檢測β-gal 在腦缺血區(qū)的表達Fig 2 Expression of β-gal in the ischemic area detected by X-gal staining

2.3 腦缺血區(qū)β-gal 陽性表達的細胞類型

免疫熒光結果顯示，腦缺血5 d 后大量β-gal 陽性細胞存在于腦缺血區(qū)周圍。β-gal 陽性細胞主要表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，少部分β-gal 陽性細胞表達神經(jīng)元標志物NeuN，幾乎未見β-gal 陽性細胞表達上皮細胞標志物CD31（圖3A）。隨機選取2 個視野（圖3B），定量分析β-gal/GFAP 共表達、β-gal/NeuN 共表達以及β-gal/CD31 共表達的細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)β-gal/GFAP 共表達的細胞數(shù)最多（P=0.000），見圖3C。

圖3 腦缺血區(qū)β-gal 陽性表達的細胞類型Fig 3 Types of β-gal positive cells in the cerebral ischemic area

2.4 肝臟組織中β-gal 的表達

在小鼠的肝臟組織中，AAV9-H9LacZ 組及對照組未檢測到明顯的β-gal 表達（圖4）。

圖4 肝臟組織β-gal 的表達（X-gal 染色）Fig 4 Expression of β-gal in the liver tissue (X-gal staining)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的關鍵是載體能夠介導目的基因通過BBB 或者直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。AAV 有多種血清型，許多AAV 載體不能通過正常的BBB，只能通過立體定向注射等有創(chuàng)方法將病毒注射至腦部。直接注射是一種侵入性的方法，可導致患者的額外傷害，因而制約了AAV 載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療中的運用。

經(jīng)靜脈注射AAV9 載體能通過BBB，介導目的基因在腦部表達。但中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的器官如肝臟、心臟、腎臟和骨骼肌等，也有目的基因的高表達。鑒于基因的過度表達會給宿主帶來危害，因此如何調(diào)控基因的表達及其時間是基因治療的關鍵。

既往研究[3]顯示腦缺血模型建立1 h，用立體定向注射AAV1-H9LacZ 至腦缺血邊緣區(qū)域能介導LacZ 基因在局部表達，注射至正常腦組織則無LacZ 基因表達。提示HRE 能控制目的基因僅僅在缺血和缺氧的條件下表達，為條件性地控制基因表達并進行治療提供了新的方法。

本研究結果顯示選用AAV9-H9LacZ（1×1012GC）這一劑量，能使目的基因主要在腦缺血部位有效表達。我們的研究顯示在dMCAO 模型建立1 h 后靜脈注射AAV9-H9LacZ 能通過BBB，介導LacZ 基因在缺血區(qū)及周圍區(qū)表達。而正常腦組織和外周器官并未見到明顯的LacZ 基因表達，提示AAV9-H9LacZ 不能介導目的基因在正常組織表達。因此，通過非侵入性地靜脈注射AAV9-H9LacZ可以介導目的基因在腦部表達。dMCAO 模型建立1 d和5 d 后，小鼠腦缺血組織局部HIF-1 的表達增高，提示HRE 能限制基因在腦缺血區(qū)周圍的表達，即9 拷貝的HRE 能控制治療基因局限在缺血區(qū)及周邊區(qū)域表達。

AAV9 能介導目的基因通過BBB[6]。主動轉(zhuǎn)運在促進AAV9 跨越BBB 方面的作用機制已被證實[7]。在dMCAO模型建立后10 min 之內(nèi)BBB 通透性增加，并持續(xù)至少24 h 至數(shù)日。本研究發(fā)現(xiàn)缺血周圍區(qū)LacZ 基因表達明顯高于腦的其他部位，提示除了AAV9 通過主動轉(zhuǎn)運來通過BBB，腦缺血后的BBB 通透性增加可能也在其中起作用。

通過免疫熒光雙染色，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射的scAAV9 所介導的LacZ 基因主要轉(zhuǎn)染GFAP 陽性細胞，少數(shù)NeuN 陽性細胞有LacZ 基因的表達，幾乎無CD31 陽性細胞有LacZ 基因的表達。盡管其他研究表明靜脈注射的scAAV9 能通過新生小鼠的BBB，主要轉(zhuǎn)染神經(jīng)元[8]，以及星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等[9]。但在成年小鼠中，scAAV9 能轉(zhuǎn)染星型膠質(zhì)細胞[10-11]。由于腦梗死后，星型膠質(zhì)細胞迅速活化，活化的星形膠質(zhì)細胞發(fā)生重要的形態(tài)學改變，如增生和肥大，形成膠質(zhì)瘢痕，圍繞損傷區(qū)形成物理和功能的壁壘[12]。鑒于腦缺血后局部神經(jīng)元死亡，星形膠質(zhì)細胞活化，我們推測在本研究中經(jīng)靜脈注射的ssAAV9 主要轉(zhuǎn)染至GFAP 陽性的星形膠質(zhì)細胞，而非神經(jīng)元，這可能與腦缺血區(qū)大量神經(jīng)元的死亡有關。

既往研究[5]顯示靜脈注射AAV9 和生理鹽水組相比較，腦缺血體積無差異，提示靜脈注射AAV 載體并不加重腦缺血損傷。AAV 具有能夠在宿主細胞長期穩(wěn)定表達、安全性高并與人類疾病無相關性、病毒本身穩(wěn)定性好等多種優(yōu)點[13]。

總之，本研究表明靜脈注射ssAAV9 可介導基因通過成年小鼠BBB 通透性增加的相關區(qū)域。腦缺血后靜脈注射ssAAV9 介導的基因主要在星形膠質(zhì)細胞表達，部分在神經(jīng)元表達。此外通過與調(diào)控元件HRE 的結合，目的基因可以被局限在腦損傷區(qū)域表達，以減少由于目的基因在全身其他器官表達所導致的不良反應。與調(diào)控元件結合的ssAAV9 可作為缺血性卒中及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的安全、有效的載體。

參·考·文·獻

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