長鏈非編碼RNA AC073046.25 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感基因TET3 表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用

徐 寧，周 甜，侯國俊，沈 南，唐元家

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病科，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海 200127

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復(fù)雜的自身免疫病，主要表現(xiàn)為自身抗體的分泌、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的異常活化[1]。有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，除了產(chǎn)生自身抗體的B 細(xì)胞外，單核/巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等均與SLE 密切相關(guān)。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度在200 bp 以上的、不具有蛋白翻譯功能的RNA[4]。其曾被認(rèn)為是沒有功能的轉(zhuǎn)錄組暗物質(zhì)，但越來越多的研究[5-6]發(fā)現(xiàn)lncRNA 可在體內(nèi)病理生理代謝反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。不僅如此，lncRNA 還可以作為增強(qiáng)子RNA（enhancer RNA，eRNA）參與基因的表達(dá)調(diào)控。eRNA 常轉(zhuǎn)錄自基因編碼區(qū)以外的增強(qiáng)子區(qū)域[7]，以順式（cis-）或反式（trans-）調(diào)控作用參與基因表達(dá)[8-9]。由于eRNA 轉(zhuǎn)錄自增強(qiáng)子區(qū)域，故可根據(jù)增強(qiáng)子的表觀遺傳學(xué)修飾信號(hào)即組蛋白H3 第4 位賴氨酸單甲基化（H3K4me1）和組蛋白H3 第27 位賴氨酸乙?；℉3K27ac）情況來鑒定lncRNA 是否存在增強(qiáng)子活性[10]。

Tet 甲基胞嘧啶雙加氧酶（Tet methylcytosine dioxygenase，Tet）是一類DNA 去甲基化酶，主要包括TET1、TET2 和TET3[11]。其中，TET1 可抑制非霍奇金淋巴瘤的增殖[12]，TET2 與白介素6（interleukin-6，IL-6）和Forkhead box 蛋白P3（forkhead boxprotein P3，F(xiàn)OXP3）的表達(dá)相關(guān)[13-14]，TET3 與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生相關(guān)[15-16]。另有報(bào)道[17]顯示，TET3 可作為負(fù)調(diào)控分子抑制干擾素β 的表達(dá)。全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide association study，GWAS）[18]發(fā)現(xiàn) TET3 是SLE 易感基因，提示其可能參與SLE 疾病的發(fā)展。但有關(guān)TET3 表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。根據(jù)Ensembl 數(shù)據(jù)庫中的基因注釋，我們發(fā)現(xiàn)在TET3 轉(zhuǎn)錄本的上游存在一條lncRNA AC073046.25，而已有報(bào)道[19-20]提示，編碼基因鄰近區(qū)域的lncRNA 可作為eRNA 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。故本研究從SLE 易感基因TET3 的表達(dá)調(diào)控出發(fā)，探究AC073046.25 與TET3 表達(dá)水平之間的關(guān)系，以及在SLE 患者和健康志愿者中AC073046.25 的表達(dá)差異，以期為SLE 的診斷提供一種新的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、試劑及儀器

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象和細(xì)胞培養(yǎng) 選擇2018—2019 年于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病科就診的SLE 患者46 例（均為女性），平均年齡（34.52±9.27）歲。所有患者均符合2009 年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）頒布的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]。同時(shí)，招募與SLE 患者的年齡、性別分布相匹配的，無SLE 家族遺傳病史，無糖皮質(zhì)激素?cái)z入的健康志愿者32 名（健康對(duì)照組）。本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào)為【2013】126 號(hào)），所有被試均簽署了知情同意書。

本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用U-937 細(xì)胞為自組織淋巴瘤的單核細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)U-937 細(xì)胞，待生長密度達(dá)70%即可傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為指數(shù)生長期的第3 ～9 代細(xì)胞，生長狀態(tài)良好。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基、FBS、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基（Gibco，美國），NE-PER 胞漿胞核分離試劑盒（Thermo，美國），人CD4+、CD8+、CD14+和CD19+細(xì)胞陽選分離磁珠（Miltenyi，德國），TRIzol試劑（Invitrogen，美國），PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒與TB Green?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒（Takara，日本），ViiATM7 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國），TransIntroTMEL 轉(zhuǎn)染試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AC073046.25 所在區(qū)域基因組的表觀遺傳學(xué)分析 本研究涉及的表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)均來自RoadMap 數(shù)據(jù)庫（http://www.roadmapepigenomics.org/data/tables/all#），分析步驟如下：①點(diǎn)擊Browse Data 選項(xiàng)卡下的Data table 選項(xiàng)，選定免疫細(xì)胞亞群和組蛋白修飾類型。②點(diǎn)擊Go to Browser 按鈕，建立與UCSC 數(shù)據(jù)庫的鏈接，并輸入位置：GRCh37/hg19 chr2:74208245-74218245。③點(diǎn)擊View 選項(xiàng)下的PDF/PS 選項(xiàng)，將數(shù)據(jù)保存為后綴.EPS 的文件。④使用AI 圖像處理軟件，將與表觀遺傳修飾無關(guān)的部分刪除，只保留基因注釋和表觀遺傳修飾峰圖的數(shù)據(jù)即可。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.3 ASO/siRNA 轉(zhuǎn)染 為驗(yàn)證AC073046.25 mRNA 水平降低后對(duì)TET3 表達(dá)的影響，我們利用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO） 對(duì)AC073046.25 進(jìn)行敲低。實(shí)驗(yàn)步驟如下：于轉(zhuǎn)染前18 h，將U-937 細(xì)胞均勻接種于24 孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（ASO-NC）和實(shí)驗(yàn)組（AC073046.25-ASO1、AC073046.25-ASO2）；向50 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中加入2 μL 100 mmol/L 的ASO，充分混勻后靜置3 min，再向其中加入2 μL TransIntroTMEL 轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混勻后室溫靜置15 min，隨后將上述混合物緩慢滴加至U-937 上清液中培養(yǎng)6 h 后，離心收集細(xì)胞，使用TRIzol 抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行qPCR 檢測(cè)（引物見表1）。為驗(yàn)證TET3 mRNA 水平降低是否會(huì)對(duì)AC073046.25 產(chǎn)生影響，我們還利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）對(duì)TET3 進(jìn)行敲低。在siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，分為陰性對(duì)照組（siRNA negative control，siRNA-NC）和實(shí)驗(yàn)組（siRNA-TET3），除需將2 μL的ASO 替換為2 μL 20 mmol/L 的siRNA 外，其余步驟均與ASO 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)一致。ASO 及siRNA 的轉(zhuǎn)染序列如表2。

表2 ASO 及siRNA 轉(zhuǎn)染序列Tab 2 Transfection sequences of ASO and siRNA

1.2.4 不同原代免疫細(xì)胞亞群的分離 收集健康志愿者和SLE 患者的外周血樣本，分別通過密度梯度離心法將2 個(gè)樣本中的單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進(jìn)行分離，步驟如下：將所得樣本用含有2%牛血清白蛋白與2 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS（即美天旎緩沖液）稀釋2 倍。向50 mL 離心管中加入密度梯度離心介質(zhì)Ficoll 15 mL，并將稀釋后的外周血樣本沿管壁緩慢加至Ficoll 液面上方，設(shè)置離心機(jī)加減速度為零，400×g 離心45 min 后吸取位于Ficoll 與水相之間的PBMCs。對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用美天旎緩沖液洗滌2次，按CD14+/CD4+/CD8+/CD19+磁珠使用說明書進(jìn)行相應(yīng)免疫細(xì)胞亞群的分離。

1.2.5 RNA 測(cè)序 采用TRIzol 抽提從上述方法中獲得的健康志愿者的免疫細(xì)胞亞群的RNA，并送至蘇州金唯智公司進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序，包括對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和分析。目前，常采用2 種衡量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行分析：即每百萬個(gè)映射的讀數(shù)中映射到外顯子的每一千個(gè)堿基上的讀數(shù)個(gè)數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）和每百萬個(gè)外顯子模型讀數(shù)中映射到轉(zhuǎn)錄本每千個(gè)堿基的個(gè)數(shù)（transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM）。由于TPM 可以更精確地反映轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，因此本研究采用TPM 作為衡量AC073046.25 在不同免疫細(xì)胞亞群中表達(dá)水平的依據(jù)。

1.2.6 SLE 患者疾病活動(dòng)度評(píng)分 采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）對(duì)SLE 患者的疾病活動(dòng)程度進(jìn)行評(píng)分，并據(jù)此將患者分為疾病活躍組（SLEDAI>4 分）與疾病穩(wěn)定組（SLEDAI ≤4 分）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)，分析健康志愿者與SLE患者的原代單核細(xì)胞中AC073046.25 與TET3 表達(dá)水平之間的相關(guān)性。通過非配對(duì)雙側(cè)Student's t 檢驗(yàn)，比較健康志愿者、疾病活躍組與疾病穩(wěn)定組間AC073046.25與TET3 表達(dá)水平的差異。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA AC073046.25 對(duì)TET3 的表達(dá)調(diào)節(jié)作用

由于TET3 上游存在一條與之同向的lncRNA，從空間上來說，我們認(rèn)為該lncRNA 存在調(diào)控TET3 表達(dá)的可能性。因此，本研究首先對(duì)該lncRNA 所在區(qū)域的表觀遺傳修飾進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1A）顯示在CD14+單核細(xì)胞中的AC073046.25 位點(diǎn)處探測(cè)到了較強(qiáng)的H3K4me1 與H3K27ac 信號(hào)；而結(jié)合原代不同免疫細(xì)胞亞群的RNA-seq數(shù)據(jù)（圖1B）可以發(fā)現(xiàn)，AC073046.25 在單核細(xì)胞中表達(dá)水平較高，繼而推斷該lncRNA 有可能在CD14+的單核細(xì)胞中發(fā)揮功能。

由于eRNA 參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，因此其主要定位于細(xì)胞核。本研究采用胞漿胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)對(duì)AC073046.25的定位進(jìn)行探究，隨后經(jīng)qPCR 檢測(cè)（圖1C）顯示，在U-937 細(xì)胞中AC073046.25 主要定位在細(xì)胞核內(nèi)（84.8%的AC073046.25 分布于細(xì)胞核內(nèi)，僅有15.2%分布在 胞漿）。

圖1 LncRNA AC073046.25 的功能性預(yù)測(cè)Fig 1 Functional prediction of lncRNA AC073046.25

為進(jìn)一步驗(yàn)證AC073046.25 的功能，我們?cè)赨-937細(xì)胞中設(shè)計(jì)功能缺失實(shí)驗(yàn)，即用ASO 對(duì)AC073046.25進(jìn)行敲低，并通過qPCR 對(duì)敲低效率及敲低后對(duì)TET3的表達(dá)影響進(jìn)行分析。結(jié)果（圖2A、2B）顯示，與ASO-NC 組相比，ASO 實(shí)驗(yàn)組可在RNA 水平有效敲低AC073046.25， 效率均>50%（ASO1：P=0.008，ASO2：P=0.010）；同時(shí)該實(shí)驗(yàn)組在敲低AC073046.25 后，TET3 mRNA 水平降低（均P=0.002）。繼而說明，在U-937 細(xì)胞中AC073046.25 對(duì)TET3 的表達(dá)存在調(diào)控作用。而通過siRNA 將TET3 在mRNA 水平上進(jìn)行敲低后結(jié)果（圖2C、2D）發(fā)現(xiàn)，siRNA 敲低TET3（P=0.008）并未影響AC073046.25 的表達(dá)?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為在U-937細(xì)胞中AC073046.25 對(duì)TET3 的表達(dá)存在調(diào)控作用，且該調(diào)控作用是單向的。

圖2 siRNA/ASO 轉(zhuǎn)染U-937 細(xì)胞后，qPCR 檢測(cè)AC073046.25 和TET3 的表達(dá)水平Fig 2 After siRNA/ASO was transfected into U-937 cells, the expression levels of AC073046.25 and TET3 were detected by qPCR

2.2 AC073046.25 與TET3 在原代單核細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性分析

在確定了AC073046.25 在U-937 細(xì)胞中對(duì)TET3 存在表達(dá)調(diào)控作用后，我們采用qPCR 檢測(cè)單核細(xì)胞中AC073046.25 與TET3 的表達(dá)水平，并在GraphPad Prism 軟件中計(jì)算皮爾遜系數(shù)對(duì)二者表達(dá)水平作相關(guān)性分析；其中，X 軸AC073046.25 表達(dá)量為自變量，Y 軸TET3 表達(dá)量為因變量。結(jié)果（圖3）顯示，在原代單核細(xì)胞中AC073046.25與TET3 的表達(dá)水平間存在正相關(guān)性（r=0.650，P=0.000）。

2.3 AC073046.25 在不同疾病活動(dòng)度SLE 患者單核細(xì)胞中的表達(dá)水平分析

圖3 原代單核細(xì)胞中AC073046.25 與TET3 表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis of AC073046.25 and TET3 expression in primary monocytes

雖經(jīng)分析得知，在原代單核細(xì)胞中AC073046.25 與TET3 的表達(dá)呈正相關(guān)，但我們?nèi)孕鑼?duì)AC073046.25 與SLE間的關(guān)系做進(jìn)一步驗(yàn)證。通過對(duì)46 例SLE 患者的疾病活動(dòng)情況打分并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疾病穩(wěn)定組共25 例、疾病活躍組共21 例。采用qPCR 對(duì)健康對(duì)照組、疾病穩(wěn)定組和疾病活躍組的單核細(xì)胞中AC073046.25 和TET3 表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）所示，AC073046.25 在健康對(duì)照組與疾病穩(wěn)定組的表達(dá)水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在疾病活躍組則較低（P=0.002，P=0.000）；與健康對(duì)照組相比，TET3在疾病活躍組中的表達(dá)水平則表現(xiàn)為下調(diào)（P=0.010）。

圖4 AC073046.25 及TET3 在健康對(duì)照組及不同疾病活動(dòng)組的單核細(xì)胞中的表達(dá)Fig 4 Expression of AC073046.25 and TET3 in monocytes derived from healthy control group and different disease activity groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在U-937 細(xì)胞中通過ASO 敲低AC073046.25 會(huì)導(dǎo)致TET3 表達(dá)水平的降低；且在原代單核細(xì)胞中，AC073046.25 與TET3 的表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此我們認(rèn)為，該AC073046.25 在單核細(xì)胞中能夠調(diào)控TET3的表達(dá)。隨后我們對(duì)不同疾病活動(dòng)組的SLE 患者單核細(xì)胞中AC073046.25 的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疾病活躍組中的AC073046.25 表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組與疾病穩(wěn)定組。因此，我們認(rèn)為該lncRNA 具備作為活躍性SLE診斷的生物標(biāo)志物的潛力，與報(bào)道[22]結(jié)論一致。

lncRNA 曾因不具備編碼蛋白質(zhì)的能力而被視為無用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但隨著高通量測(cè)序技術(shù)水平的不斷提升，越來越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，其功能也逐漸被報(bào)道[23]。根據(jù)研究結(jié)果，我們認(rèn)為AC073046.25 可能以eRNA 的形式參與TET3 的表達(dá)調(diào)控。且eRNA 在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因的調(diào)控方式可大致分為2 種：通過募集組蛋白修飾相關(guān)的酶來改變組蛋白的修飾水平，影響染色質(zhì)開放性[24]；或是與蛋白或RNA 結(jié)合來影響其穩(wěn)定性，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25]。針對(duì)AC073046.25 具體發(fā)揮功能的機(jī)制探索，我們計(jì)劃從以下幾個(gè)角度開展：首先通過生物信息學(xué)對(duì)有可能與其直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)，其次是通過RNA 拉下（RNA pull down）合成生物素標(biāo)記的AC073046.25 探針，將與之結(jié)合的蛋白質(zhì)拉下，并通過質(zhì)譜對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定[26]；除此之外，我們還計(jì)劃采用環(huán)形染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Circular chromosome conformation capture，4C）實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證AC073046.25 可通過誘導(dǎo)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子環(huán)形染色體構(gòu)象的形成來調(diào)控TET3 的表達(dá)[27]。綜上，通過研究AC073046.25 對(duì)TET3 的表達(dá)調(diào)控具體機(jī)制，不僅可以為其作為活躍性SLE 的診斷標(biāo)志物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，還可以為SLE 的治療提供新的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入 分析。

參·考·文·獻(xiàn)

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