具核梭桿菌相關(guān)細菌生物膜促進巨噬細胞M2 型極化和結(jié)腸癌化療耐藥的研究

陸詩媛，洪 潔，陳縈晅，陳錦先，鐘 鳴，房靜遠

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化科，上海市消化疾病研究所，上海 200001；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科，上海 200127

腸道菌群是影響結(jié)腸癌進展和預(yù)后的重要因素之一，產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF）、 具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn).n）、pks 島陽性大腸桿菌（pks+Escherichia coli，pks+E.coli）等腸道細菌被認為與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[1-3]。細菌生物膜是一種在生物或非生物性表面形成的細菌集合體，包含菌體、胞外聚合物等組分，與細菌耐藥以及牙周炎、傷口感染、腸炎、肺炎等疾病相關(guān)[4]；近期有研究提示細菌生物膜在部分結(jié)腸癌組織中存在，可能通過影響細胞代謝和腸道免疫參與腸癌的進程[5-11]。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是一種骨髓來源的免疫細胞，參與腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。其中，M2 型巨噬細胞介導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥，與結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良 相關(guān)[13-14]。

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其患病率和病死率在全球位居前五[15-16]。幾十年來，結(jié)腸癌的5 年生存率有所提高，但進展期和晚期結(jié)腸癌的預(yù)后仍然不佳[17]。目前結(jié)腸癌的術(shù)后化療輔助治療仍以FOLFOX 化療方案[亞葉酸鈣、5- 氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）、奧沙利鉑（oxaplatin，LOHP） ]、XELOX 化療方案（卡培他濱、LOHP）和FOLFIRI 化療方案（亞葉酸鈣、5-FU、伊立替康）等為主，而化療耐藥是術(shù)后患者復(fù)發(fā)的主要原因之一[18-19]。有研究[6,20]提示F.n 在結(jié)腸癌相關(guān)的生物膜中普遍存在；也有文獻[21-22]報道F.n 可以調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，影響TAMs 的極化；本課題組前期研究[23]提示F.n 可促進結(jié)腸癌的化療耐藥。這些研究提示F.n 細菌生物膜可能與腫瘤免疫微環(huán)境和結(jié)腸癌患者的化療耐藥相關(guān)。

本研究從臨床結(jié)腸癌組織檢測和細胞體外實驗等方面，闡述細菌生物膜與腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化分型、結(jié)腸癌化療耐藥的關(guān)系，旨在探究細菌生物膜與結(jié)腸癌耐藥復(fù)發(fā)的關(guān)系，探究清除細菌生物膜對改善結(jié)腸癌預(yù)后的 意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗材料 本研究使用的腸癌組織來源于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者。組織樣本收集和臨床信息采集均符合醫(yī)院倫理委員會要求。人腸癌細胞系HCT116（ATCC CCL-247）、DLD1 （ATCC CCL-221）、Caco2 （ATCC HTB-37），人單核細胞THP-1 （ATCC TIB-202），小鼠巨噬細胞RAW264.7 （ATCC SC-6003）和具核梭桿菌標準菌株（ATCC 25586）均購自美國模式培養(yǎng)物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）；小鼠腸癌細胞系MC38 由許杰研究組惠贈。

1.1.2 試劑 McCoy's 5A、RPMI-1640、DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基，磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），胎牛血清均購自美國Gibco Life Technologies 公司。LOHP 和5-FU 均購自美國Selleck Chemicals 公司?？笴D68 抗體（#76437）購自美國Cell Signaling Technology 公司， 抗CD206 抗體（#ab64693）購自英國Abcam 公司，抗CD11c 抗體（#TA323539）購自美國Origene 公司。Cell Counting Kit-8（CCK8） 試劑盒購自日本同仁公司。免疫熒光原位雜交全細菌探針（EUB338-CY3）和具核梭桿菌探針（F.n-FITC）均購自廣州外顯子公司。阿斯利新藍、過碘酸、蘇木精、雪夫 （Shiff's）液等化學試劑均購自上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑有限公司。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑SP KIT-A3 和酶底物顯色劑（#DAB-0031）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。組化通用二抗（#D-3304）購自上海長島生物技術(shù)有限公司。FITC 染料（#F5027）購自蘇州宇恒生物科技有限公司。腦心浸出液肉湯粉末（CM1135B）購自美國OXOID 公司。

1.1.3 實驗儀器 普通光學顯微鏡及倒置熒光顯微鏡均購自日本Olympus 公司。冷凍切片機購自德國徠卡病理系統(tǒng)。厭氧操作臺（DG250，Don Whitley Scientific，UK）。實時熒光定量PCR 儀（One-Step Plus，Thermo Fisher Scientific，美國）

1.2 方法

1.2.1 組織學檢測 組織學檢測均使用冷凍新鮮組織標本，制作冰凍切片（9 μm，厚度），以Carnoy's 固定液（乙醇:乙酸=3:1）固定1h，滅菌去離子水洗滌6 次（5 min/次）后，分別進行PAS-AB（periodic acid Schiff and Alcian blue stain）染色、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 檢測和免疫化學染色（immunohistochemistry，IHC）檢測。PAS-AB 染色步驟為：阿斯利新藍滴染20 min，流水沖洗5 min；過碘酸滴染20 min，流水沖洗5 min；Shiff's 液滴染15 min，流水沖洗10 min；最后以蘇木精復(fù)染細胞核，封片后以光學顯微鏡觀察。FISH 按照探針說明書操作，封片后以熒光顯微鏡觀察，并以文獻報道[10,24]的標準評估細菌生物膜存在狀態(tài)。IHC 按照標準流程操作，步驟為：過氧化物酶阻斷劑處理15 min，PBS 洗滌，10%羊血清封閉30 min，一抗孵育4 ℃過夜（CD68 以1:800 配置，CD11c 以1:100 配置，CD206 以1:4 000 配置），PBS 洗滌后以酶底物顯色劑顯色，并以蘇木精復(fù)染細胞核，封片后以光學顯微鏡觀察。

1..2.2 細胞培養(yǎng) HCT116 細胞系以McCoy's 5A，DLD1、THP-1 細胞系以RPMI-1640，Caco2、MC38、RAW264.7 細胞系以DMEM 配置完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（含1%雙抗、10%胎牛血清），并置細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）標準環(huán)境培養(yǎng)。其中THP-1 和RAW264.7 細胞系使用熱滅活（56 ℃，30 min）的血清。THP-1 細胞提前24 h 以佛波醇-12-豆蔻-13-醋酸（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA，100 μg/mL）誘導(dǎo)分化為貼壁的巨噬細胞。

1.2.3 生物膜培養(yǎng) F.n 在厭氧操作臺以BHC 培養(yǎng)基（心腦浸出液肉湯、氯化血紅素、結(jié)晶紫等配置）37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 備用[23]。F.n 標記：生長中期的菌液以2 000×g離心10 min，棄上清，以PBS 洗滌2 次后，加入FITC 染料（0.1 mg/mL）孵育2 h，以PBS 洗滌5 次去除多余的FITC 染料，PBS 重選備用。

非生物體表面的生物膜培養(yǎng)：以中期菌液調(diào)整至 D （600）=0.5，以每孔200 μL 加入96 孔板培養(yǎng)24 ～48 h即生成生物膜。生物體表面的生物膜培養(yǎng)：Caco2 結(jié)腸癌細胞在12 孔板內(nèi)生長10 d 形成單細胞層，以FITC 染料標記的F.n 按感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）為50 的濃度與細胞共孵育，8 ～24 h 后觀測生物膜形成情況[25]。F.n 培養(yǎng)上清收?。号囵B(yǎng)好的菌液以2 000×g 離心15 min 后，以0.22 μm 濾器濾除菌體，留取培養(yǎng)上清（代謝物）備用。

1.2.4 藥物毒性實驗 MC38、 HCT116、 DLD1 細胞在不同濃度的F.n 培養(yǎng)上清處理2 ～3 h 后，PBS 洗滌，胰酶消化、計數(shù)，以8 000 個細胞/孔鋪到96 孔板過夜貼壁，換入含有加入對應(yīng)半數(shù)抑制濃度 （ half inhibit concentration，IC50）的LOHP/5-FU 化療藥物的完全培養(yǎng)基200 μL/孔，48h 后以CCK8（1 μL/100 μL 配置）孵育2 h 后讀取D （450）值，并以各組不含化療藥物的對照組為標準，計算相對生長抑制率。

1.2.5 細胞共培養(yǎng) 本研究采用細胞上清共培養(yǎng)體系。將處理/未處理的腸癌細胞提前24 h 換為單純培養(yǎng)基，收取24 h 的培養(yǎng)上清，10 000×g 離心15 min 后收取上清；或以液氮凍融后離心收取細胞裂解液，以合適濃度加入巨噬細胞培養(yǎng)基做共培養(yǎng)。將處理/未處理的巨噬細胞提前24 h 換為單純培養(yǎng)基，收取24 h 的培養(yǎng)上清，10 000×g離心15 min 后收取上清，以合適濃度加入腸癌細胞培養(yǎng)基做共培養(yǎng)。

1.2.6 RNA 提取和實時熒光定量PCR 處理后的細胞以Trizol 法提取總RNA（F.n 菌體在加入Trizol 后100 ℃加熱10 min 促進菌體裂解），根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑（Takara）說明書取1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以SYBR Green染料（Takara）和實時熒光定量PCR 儀檢測，細胞選取β-actin 為內(nèi)參、菌體選取Fuso-16s 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt定量分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.7 巨噬細胞極化檢測 RAW264.7 以不同條件（腸菌培養(yǎng)上清、細胞培養(yǎng)上清或細胞裂解液，制備方法見“1.2.3”和“1.2.5”）共培養(yǎng)6 h 后，分別檢測細胞極化情況：① 以光學顯微鏡觀測細胞形態(tài)，以長梭形為M2 型。②收取RNA，以實時熒光定量PCR 檢測Il10、Il12b 基因的表達水平。③制作細胞爬片后，以CD206 為M2 型巨噬細胞指標，做免疫化學染色評估細胞極化情況。

1.2.8 具核梭桿菌最小抑菌濃度檢測 液基或生物膜培養(yǎng)的F.n，分別以含有0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL 甲硝唑的培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL（clone formation unit）的濃度，加入96 孔板（每組設(shè)置6個重復(fù)），培養(yǎng)24h 后測量D （600）值；并以上述各組培養(yǎng)后的菌液做涂板培養(yǎng)，48h 后觀測菌落形成情況。以吸光度最先降低（菌落最先消失）的藥物濃度為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 軟件做數(shù)據(jù)分析。定量資料以x—±s 表示。符合正態(tài)分布的2 組間定量資料分析采用student's t檢驗（所有檢驗均為雙尾檢驗），P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。符合正態(tài)分布的各組間定量資料的分析使用oneway ANOVA 檢驗；當P ≥0.05 時，認為方差齊，用LSD 法進一步作多重比較；方差不齊性時，用Dunnett's t 檢驗進一步作多重比較，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 具核梭桿菌相關(guān)生物膜促進結(jié)腸癌細胞耐藥

研究[1,26]提示腸菌代謝物在免疫調(diào)節(jié)和癌癥進程中發(fā)揮作用，但機制不明。因此，我們關(guān)注F.n 代謝產(chǎn)物在生物膜與非生物膜不同狀態(tài)下作用的差異。在96 孔板中培養(yǎng)F.n 生物膜，并收集培養(yǎng)上清（代謝產(chǎn)物）分別與結(jié)腸癌細胞系HCT116、DLD1、MC38 共培養(yǎng)，給予LOHP、5-FU 處理48h 后，通過CCK8 細胞活性檢測評估化療藥物的細胞毒性，并以實時熒光定量PCR 檢測耐藥基因表達變化。結(jié)果顯示，經(jīng)生物膜培養(yǎng)來源的F.n 代謝產(chǎn)物（biofilm-based F.n-culture medium，BF-CM）處理的腸癌細胞，與液基培養(yǎng)狀態(tài)代謝產(chǎn)物（planktonic F.n-culture medium，P-CM）處理的相比，LOHP/5-FU 作用下生長抑制率更低[D（450）值更大]，而耐藥相關(guān)基因（MDR1/Abcb1a/Abcb1b）表達水平更高（圖1）。結(jié)果提示生物膜狀態(tài)的F.n 有更強的促進細胞耐藥的作用。

2.2 細菌生物膜與結(jié)腸癌患者的化療耐藥和TAMs 浸潤相關(guān)

為探究細菌生物膜與化療耐藥的臨床相關(guān)性，研究選取8 個耐藥復(fù)發(fā)和8 個未復(fù)發(fā)的術(shù)后化療結(jié)腸癌患者的組織標本（表2），以FISH（EUB338 探針、F.n-FITC 探針）技術(shù)檢測組織樣本生物膜和F.n 的存在情況，2 組間F.n陽性率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示7/8 個復(fù)發(fā)患者的組織生物膜陽性，而未復(fù)發(fā)組中僅2/8 個（圖2A，表2）。進一步以IHC 檢測腫瘤組織TAMs 的浸潤和極化情況，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組中M2 型TAMs 比例為59.81%±5.54%（其中BF 陽性組織為63.60%±4.66%），相比未復(fù)發(fā)組的43.94%±4.51% 有明顯提高 （其中BF 陰性組織為41.97%±5.57%），見圖2B。以上結(jié)果說明，細菌生物膜陽性與腸癌術(shù)后耐藥復(fù)發(fā)率正相關(guān)，且與TAMs（M2 型）的浸潤度相關(guān)。

表2 結(jié)腸癌患者的臨床信息Tab 2 Clinical information of patients with colon cancer

圖1 F.n 代謝產(chǎn)物對腸癌細胞化療藥物作用和耐藥基因表達的影響Fig 1 Changes of growth inhibition under chemicals and mRNA expression in CRC cell lines

圖2 結(jié)腸癌組織生物膜檢測和腫瘤相關(guān)巨噬細胞浸潤分析Fig 2 Biofilm existence and TAMs infiltration in tumor tissues of colon cancer patients

2.3 具核梭桿菌相關(guān)生物膜促進巨噬細胞M2 型極化

研究[21]報道F.n 可以誘導(dǎo)TAMs 的M2 型（促癌性）極化。為探究生物膜狀態(tài)的F.n 是否作用更強，研究以BF-CM 和P-CM（同時以空白細菌培養(yǎng)基BHC 作陰性對照）分別作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7 和THP-1 來源的巨噬細胞，通過觀測細胞形態(tài)學特征（圖3A）、qRT-PCR檢測標記基因，分析巨噬細胞的極化分型。實時熒光定量PCR 顯示，BF-CM 比P-CM 刺激的巨噬細胞IL10/Il10 表達量更高（而BHC 作用后表達變化不大，圖3B ～C）。

圖3 具核梭桿菌相關(guān)生物膜促進巨噬細胞M2 型極化Fig 3 F.n-related bacterial biofilm promotes macrophage M2-type polarization

2.4 腫瘤相關(guān)巨噬細胞與結(jié)腸癌細胞的相互作用

將BF-CM、P-CM 和BHC 處理后的腸癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，檢測巨噬細胞極化情況，結(jié)果提示BF-CM 作用后的腸癌細胞誘導(dǎo)M2 型極化作用更強（圖4A ～B）。同樣，將BF-CM、P-CM 和BHC 共刺激后的巨噬細胞與腸癌細胞共培養(yǎng)，檢測其對LOHP/5-FU 的藥物反應(yīng)和耐藥基因表達水平。結(jié)果顯示，相比P-CM，LOHP/5-FU 對BF-CM 刺激后的巨噬細胞共培養(yǎng)下的腸癌細胞的細胞生長抑制率更低，且耐藥相關(guān)基因表達水平更高（圖4C ～K）。

圖4 腫瘤相關(guān)巨噬細胞與結(jié)腸癌細胞的相互作用Fig 4 Crosstalk between CRC cells and macrophages

2.5 具核梭桿菌相關(guān)生物膜促進菌體本身耐藥

圖5 具核梭桿菌相關(guān)生物膜促進菌體本身耐藥Fig 5 Reduced sensitivity to Metronidazole of F.n. under biofilm-based status.

結(jié)晶紫染色驗證，96 孔板培養(yǎng)24 h 后F.n 生物膜形成（圖5A）?；罴毎砻嫔锬ば纬山Y(jié)果提示，生物膜來源的F.n 有更強的生物膜形成能力（圖5B）。將不同濃度的甲硝唑分別加入生物膜和液基懸浮狀態(tài)的F.n 培養(yǎng)體系中，24 h 后酶標法[D（600）]檢測F.n 細胞活力，并將對應(yīng)菌液涂板培養(yǎng)。吸光度顯示：液基懸浮狀態(tài)F.n 的MIC 為0.01 μg/mL，而生物膜狀態(tài)F.n 的MIC 為0.1 μg/mL，平板培養(yǎng)結(jié)果與之一致（圖5C ～D）。進一步檢測F.n 在KEGG-QS（quorum-sensing）通路富集基因的表達變化，實時熒光定量PCR 結(jié)果提示群體效應(yīng)/耐藥相關(guān)基因FN1431 和FN1506 表達在生物膜狀態(tài)下增高（圖5E），說明細菌生物膜可以提高F.n 的耐藥和存活率。

3 討論

細菌生物膜促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用逐漸清晰，其機制可能通過腸菌代謝產(chǎn)物或免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)發(fā)揮[5-11]。F.n在介導(dǎo)結(jié)腸癌進展和免疫微環(huán)境改變中有重要作用[21,27]， 也有報道[6,20]F.n 廣泛存在于牙菌斑和腸黏膜附著的細菌生物膜中。但F.n 細菌生物膜在免疫細胞（如巨噬細胞）浸潤和結(jié)腸癌患者預(yù)后中的作用尚不清晰。本研究結(jié)果提示生物膜在腸癌組織中的存在與否和腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2 型極化比例相關(guān)，且和術(shù)后化療患者耐藥復(fù)發(fā)相關(guān)；體外細胞實驗結(jié)果顯示生物膜狀態(tài)下F.n.的代謝物更能降低化療藥物（LOHP/5-FU）對腸癌細胞的藥物毒性。M2型巨噬細胞可能通過白介素-6（interleukin-6，IL-6）誘導(dǎo)腸癌細胞的耐藥[14,27]，本研究發(fā)現(xiàn)生物膜狀態(tài)下F.n.的代謝物對巨噬細胞IL-6 誘導(dǎo)水平更高。細菌生物膜作為一種特殊的集群結(jié)構(gòu)，其內(nèi)個體依賴于效應(yīng)分子相互交流，在藥物反應(yīng)、毒力因子和代謝產(chǎn)物等方面發(fā)生改變，從而產(chǎn)生更強的生存適應(yīng)性和致病性。本研究檢測發(fā)現(xiàn)生物膜狀態(tài)下，F(xiàn).n.生物膜形成力增強，菌體本身耐藥性提高，且群體效益相關(guān)基因表達發(fā)生變化。因此，黏附分子阻斷劑、胞外聚合體抑制劑，以及DNA 結(jié)合蛋白家族（DNA binding protein，DNABII）單抗等靶向生物膜形成及存在過程的分子制劑[4]，或能成為細菌生物膜陽性腸癌患者的輔助治療。

本研究初步揭示了細菌生物膜在巨噬細胞極化誘導(dǎo)和結(jié)腸癌化療耐藥中的作用，提示細菌生物膜檢測對化療效果的預(yù)示和清除生物膜對改善腸癌患者預(yù)后的潛在意義。但目前研究未對發(fā)揮關(guān)鍵作用的代謝產(chǎn)物組分進行分析 ，也未能對F.n 生物膜 - 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 - 結(jié)腸癌細胞相互作用的內(nèi)在機制做深入研究，有待今后進一步探索。

參·考·文·獻

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