牙髓干細胞與血管周細胞性能比較研究

吳文婧，丁如愿，張 菁，張紅艷，胡露露，李 頌

血管新生是組織修復的基礎，血管新生異常常常影響機體損傷的正常愈合。血管由內襯血管壁的內皮細胞層和血管周細胞組成。研究[1]表明，在血管形成過程中，首先由增殖的血管內皮細胞形成管腔樣結構，然后血管周細胞遷移聚集，2 種細胞共同調節(jié)血管的穩(wěn)定性。周細胞在全身毛細血管和微血管周圍廣泛分布，能夠穩(wěn)定血管結構，對血管的發(fā)育以及重塑具有重要作用。然而，現(xiàn)階段分離血管周細胞還有一定的困難，這限制了其在體外血管重建中的運用。有研究[2-4]報道，來源于腦組織、臍帶、脂肪等的間充質干細胞和血管周細胞有許多相似之處，這些間充質干細胞在細胞表型、基因表達和分化能力等方面與血管周細胞有著高度的相似性。但是，這些組織來源的間充質干細胞獲取困難，相對來說，來源于牙髓的牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有無創(chuàng)傷、易于分離、增殖率高等優(yōu)勢，可以從第三恒磨牙、正畸牙或其他原因拔除的健康牙的牙髓組織中分離培養(yǎng)獲得，而不受倫理問題的影響。在該研究中，選擇血管穩(wěn)定能力、遷移功能和干性分化潛能作為評價標準，比較DPSCs和血管周細胞之間的相似性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器原代血管周細胞和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)(美國Sciencell公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；周細胞培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)和ECM培養(yǎng)基(Lonza公司)；Transwell 細胞小室(美國BD公司)；DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；Dispase 酶和Ⅰ型膠原酶( 美國Sigma 公司)；CO2恒溫孵箱(英國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1DPSCs的分離培養(yǎng)與鑒定 取臨床小于25歲健康患者因正畸或阻生拔除健康無齲的牙齒，拔出后立即放入含5%雙抗PBS中，搖晃沖掉牙根表面血跡，立即冰盒保存，送至實驗室。4 h內將牙齒放入超凈工作臺，用無菌紗布包裹牙齒，錘子砸開牙齒，超凈工作臺內分開牙齒，鑷子取出牙髓，去掉根尖1/3根髓，將牙髓移入無菌培養(yǎng)皿中，用2%雙抗PBS反復沖洗干凈。將牙髓組織剪碎后移入15 ml離心管中，加入1 ml 濃度為3 mg/ml膠原酶和1 ml濃度為4 mg/ml Dispase酶，混勻后37 ℃震蕩消化40～60 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，細胞重懸于20% 胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液中，吹打混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后觀察細胞生長情況，以后3 d換液，培養(yǎng)10～12 d，當細胞長至約90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取P3代DPSCs，PBS 洗滌2次，用胰酶消化收集，以1×106/ml分裝至1.5 ml EP管，分別加入CD105、CD29、CD90、CD73、CD45、CD44、CD34 抗體，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌后重懸，流式細胞儀檢測。

1.2.2多向誘導分化 成骨分化：以4×103/cm2接種于12孔板上，培養(yǎng)至70%融合度時，更換成骨誘導培養(yǎng)基(含α-MEM，10% FBS, 1%雙抗, 50 μg/ml 磷酸抗壞血酸, 10 mmol/L β-磷酸甘油, 10 nmol/L地塞米松, 10 nmol/L 1,25二羥基維生素D3)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。誘導4周后，用10%中性緩沖福爾馬林固定1 h，棄去固定液，用雙蒸水沖洗3次，加入茜素紅染色。

成神經(jīng)分化：以4×103/cm2接種于12孔板上，培養(yǎng)至70%融合度時，更換成神經(jīng)誘導培養(yǎng)基(含神經(jīng)誘導培養(yǎng)基，40 ng/ml 成纖維細胞生長因子, 20 ng/ml 表皮生長因子)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。誘導4周后，檢測成神經(jīng)分化。

1.2.3體外成血管實驗 預先對48孔板進行基質膠涂層，按照DPSC+HUVEC(1 ∶4)、血管周細胞+HUVEC(1 ∶4)接種在孔板上，37 ℃與5% CO2條件下孵育。于3、7、11、14、18、24、30、36、42 h在倒置顯微鏡下觀察小管形成情況并采集圖像。

1.2.4細胞趨化實驗 DPSC和HUVEC在血清饑餓24 h后，消化重懸細胞，調整細胞懸液密度為1×106/ml，上室每孔加0.1 ml HUVEC懸液，下室分別加入0.6 ml的DPSCs或血管周細胞懸液，所有樣本均設有復孔，37 ℃與5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。固定染色鏡檢，計算下表面遷移細胞數(shù)，評價DPSCs和血管周細胞對HUVEC遷移行為的影響。

1.3 統(tǒng)計學處理每次實驗獨立重復≥3次，采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采取獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DPSCs的流式鑒定流式細胞儀對DPSCs進行表面抗原的檢測，結果顯示細胞純度較高，均陽性表達CD105、CD73、CD90、CD29、CD44，陰性表達CD34、CD45，符合間充質來源的干細胞特征，為間充質來源(圖1)。

2.2 DPSCs與血管周細胞的多向分化潛能在倒置顯微鏡下，DPSCs和血管周細胞均呈梭形，貼壁生長，兩者表現(xiàn)出類似的形態(tài)學特征(圖2)。

圖1 流式細胞術檢測DPSCs表面標志物

圖2 細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)學觀察 ×40

DPSCs和血管周細胞經(jīng)成骨誘導液誘導4周后，茜素紅染色顯示紅色的礦化結節(jié)。經(jīng)成神經(jīng)誘導液誘導4周后，觀察到兩組細胞均縮小變窄并向兩側伸長，呈長軸突樣，類似神經(jīng)元樣細胞的形態(tài)。發(fā)現(xiàn)兩組細胞均能向成骨細胞和神經(jīng)細胞分化，可見DPSCs和血管周細胞均具有相似的多向分化能力(圖3)。

2.3 DPSCs/血管周細胞與HUVEC共培養(yǎng)形成穩(wěn)定的管狀結構本研究進行了Matrigel成血管實驗，以HUVEC、DPSCs+HUVEC和血管周細胞+HUVEC在Matrigel上共培養(yǎng)，比較各組的成血管能力。結果顯示，兩組細胞均可加強由HUVEC形成的網(wǎng)狀結構，網(wǎng)狀結構相互連接，形成管腔樣結構，并維持到42 h?？梢奃PSCs和血管周細胞均能增強HUVEC產(chǎn)生的管狀結構的穩(wěn)定性(圖4)。

圖4 體外Matrigel成血管實驗結果 ×10

2.4 遷移功能DPSCs和血管周細胞與HUVEC在Transwell孵育12 h后，上室中各實驗組均有一定數(shù)量的HUVEC進入下室，表明DPSCs和血管周細胞對HUVEC均有較強的趨化作用，兩者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5)。

3 討論

血管周細胞是血管結構的重要組成部分，也稱為壁細胞，嵌入在小血管、毛細血管和微血管的基底膜中[5]，在促進血管新生方面起著重要的作用，如穩(wěn)定血管結構和刺激血管生成[6]。并且血管周細胞已被證明可分化為各種譜系，如肌纖維、成牙骨質細胞樣細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等[7-9]。血管周細胞的多能分化能力和血管生成潛能使其成為細胞治療的潛在候選細胞，但目前血管周細胞的分離仍然具有挑戰(zhàn)性。2000年，Gronthos et al[10]首次從牙髓組織中成功分離出DPSCs，并進一步證明了DPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，可以被誘導分化為骨、軟骨、肌肉、血管內皮等多種細胞類型。研究發(fā)現(xiàn)DPSCs能分泌多種成血管因子，用DPSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)內皮細胞可促進內皮細胞的遷移能力以及成血管能力[11-12]。有學者對DPSCs進行成血管誘導，發(fā)現(xiàn)DPSCs可分化為內皮樣細胞，在體外可形成血管樣結構[13-14]。另外，顱面血管周細胞和DPSCs均起源于顱神經(jīng)嵴，DPSC的解剖位置和發(fā)育起源與周細胞相似。Shi et al[15]研究表明，大部分DPSCs表達血管周細胞標志物3G5，也證實了它們與血管周細胞的相似性。所有這些證據(jù)提示是不是可以用來源充足、獲取容易的DPSCs作為血管周細胞的替代物。本研究從臨床上獲得牙髓組織，體外分離培養(yǎng)得到DPSCs，并對細胞進行驗證，流式細胞儀檢測顯示CD105+、CD73+、CD90+、CD29+、CD44+及CD34-、CD45-，與間充質干細胞的表達一致。在細胞形態(tài)學方面，比較了DPSCs和血管周細胞后發(fā)現(xiàn)兩種細胞均呈梭形，貼壁生長，形態(tài)無明顯差異。本課題組還研究了兩種細胞的分化能力，發(fā)現(xiàn)DPSCs和血管周細胞均能向成骨細胞和神經(jīng)細胞分化。Matrigel膠成血管實驗是一種常應用于血管內皮細胞功能的成血管研究的體外模型。本研究在 Matrigel上將血管周細胞或DPSCs與HUVEC共培養(yǎng)，兩組共培養(yǎng)均觀察到有明顯的血管形成，且維持較長時間，驗證了DPSCs同樣也具有顯著的促成血管能力。在此基礎上，通過Transwell實驗進一步研究DPSCs對血管內皮細胞的趨化作用。Transwell趨化實驗是將被趨化細胞接種在上室內，通過小室底部的通透性膜，下層培養(yǎng)液中的成分可以作用到上室內的細胞，以此研究下層物質對細胞遷移的作用。將HUVEC分別和血管周細胞、DPSCs兩種細胞同時培養(yǎng)于 Transwell的上下室，培養(yǎng)12 h后，可以清楚觀察到兩組HUVEC的遷移。初步證明了DPSCs對HUVEC也有顯著的趨化作用。而血管內皮細胞的遷移對于新生血管形成是至關重要的。

圖5 血管周細胞和DPSCs對HUVEC遷移行為的影響 ×20

綜上所述，本研究從細胞分化、趨化和促成血管能力等多個角度，對DPSCs和血管周細胞進行比較，提示DPSCs和周細胞具有相似的功能，為臨床上DPSCs作為血管周細胞的替代提供了理論依據(jù)。