和厚樸酚對過氧化氫誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

錢保進(jìn)，王 玉

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布，是細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)并進(jìn)行折疊、寡聚化加工的重要場所，可維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂類代謝中起著核心作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在受到高糖、高脂等多種因素刺激時，生理功能發(fā)生紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)；持續(xù)的ERS可能通過激活凋亡途徑造成神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和凋亡。目前在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)了ERS導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，比如帕金森病(Parkinsons disease, PD)[1]。研究[2-4]表明PD主要的病理改變?yōu)槎喟桶飞窠?jīng)元變性死亡以及由應(yīng)激誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。其患者黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被過度激活[5]。PD的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞ERS相關(guān)的凋亡有密切聯(lián)系[1,6]。和厚樸酚(honokiol, HNK)是傳統(tǒng)中藥厚樸中分離出的有效成分之一，是一種含有酚羥基的活性物質(zhì), 具有一定的心腦血管保護(hù)功效[7-8]。此外，研究[9-10]表明HNK具有抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等的神經(jīng)保護(hù)作用。但HNK對神經(jīng)細(xì)胞的ERS相關(guān)的凋亡作用目前尚不清楚。該實驗用過氧化氫(H2O2)處理人來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，探討HNK對神經(jīng)元細(xì)胞ERS損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)SCSP-5014購于中科院上海細(xì)胞庫；HNK購于成都德銳可生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國Hyclone公司；PBS購于美國GIBCO公司；胰蛋白酶、CCK-8、流式試劑盒購于美國Sigma公司；Bcl-2、Bax抗體購于美國CST公司；Caspase-3、β-actin、BIP、CHOP、Caspase-12抗體、羊抗兔IgG二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記購于上海中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，使其貼壁生長，每日更換培養(yǎng)基1次。通過倒置顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞覆蓋到培養(yǎng)瓶85%左右時用胰酶消化進(jìn)行傳代。

1.3 實驗分組實驗分為4組。① 保護(hù)組：先加入10 μmol/L HNK于DMEM培養(yǎng)液孵育6 h，再加入H2O2；② 溶劑組：培養(yǎng)液加入與保護(hù)組HNK等體積的DMSO；③ 對照組：只添加培養(yǎng)液；④ 損傷組：培養(yǎng)液加入終濃度為400 μmol/L的H2O2。

1.4 建立模型當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，以3×104個/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，孵育12 h后，再加入梯度濃度的H2O2(0、50、100、200、400、800 μmol/L)孵育24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃孵育1 h，通過酶標(biāo)儀于450 nm波長下，測量每孔吸光度值。用對照組的百分比來表示細(xì)胞活性從而篩選出H2O2的終濃度。

1.5 CCK-8比色法篩選HNK濃度當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，稀釋到3×104個/ml的密度后接種于96孔板中，每孔100 μl，孵育12 h后，對照組和損傷組中加入的培養(yǎng)液含10%胎牛血清；HNK組和溶劑組分別加入不同濃度(0、1、5、10、20、50 μmol/L)HNK及等體積DMSO孵育6 h。孵育結(jié)束吸取掉上清液，對照組再加入DMEM培養(yǎng)液，損傷組和不同濃度的HNK組加400 μmol/L的H2O2，37 ℃條件下孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8，最終篩選出HNK的適宜濃度。

1.6 免疫熒光染色觀察SH-SY5Y細(xì)胞凋亡細(xì)胞用6孔板接種，每組按分組要求給予不同處理后，吸出上清液，經(jīng)清洗、4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100通透、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物后滴加5% BSA于37 ℃封閉30 min。清洗后滴加合適濃度的一抗，接著在濕盒中4 ℃條件下孵育過夜，再用PBS清洗。加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，每次間隔5 min。加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫避光條件下孵育10 min后用PBS清洗3次，每次間隔5 min。接著滴加抗熒光淬滅劑后封片，并迅速用熒光顯微鏡下觀察。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡細(xì)胞用6孔板接種，每組按分組要求給予不同處理后，消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，再用預(yù)冷PBS洗3次。在EP管中將細(xì)胞重懸浮于200 μl結(jié)合緩沖液里，每管常規(guī)加入10 μl熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV-FITC)和 5 μl碘化丙啶(PI)進(jìn)行染色，混勻后避光室溫孵育15 min，再加入300 μl結(jié)合緩沖液后立即檢測。根據(jù)AnnexinV-FITC及PI的熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(%)，同樣操作重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)收集各實驗組處理的細(xì)胞，PBS清洗1次后加入適當(dāng)細(xì)胞裂解液。常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，再用BCA法對蛋白含量進(jìn)行定量測定。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；再通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶印跡到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉1 h；再分別用特異的細(xì)胞抗體(Bcl-2、Bax、Caspase-3、BIP、CHOP、Caspase-12、內(nèi)參GAPDH)孵育，在4 ℃冰箱中過夜；隔天洗膜15 min×3次；相應(yīng)的二抗在室溫條件下孵育1 h；洗膜8 min×3次；顯色。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2對SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響不同H2O2濃度(0、50、100、200、400、800 μmol/L)作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞活性分別為(2.64±0.23)、(2.50±0.57)、(2.37±0.35)、(1.97±0.42)、(1.50±0.34)、(1.11±0.23)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.01，P<0.001)，見圖1。可見在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞損傷程度逐漸增加，細(xì)胞活性明顯下降。當(dāng)H2O2的濃度為400 μmol/L時，細(xì)胞損傷接近50%，因此選取400 μmol/L作為造細(xì)胞損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度(50、100、200、400、800 μmol/L)H2O2對SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響

2.2 不同濃度HNK對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響進(jìn)一步實驗觀察不同濃度的HNK對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用，圖2中細(xì)胞活性分別為(1.98±0.91)、 (1.23±0.09)、(1.32±0.13)、(1.40±0.10)、(1.56±0.13)、(1.78±0.19)、(1.54±0.17)、(0.91±0.17), 各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.87，P<0.001)。實驗結(jié)果提示，低濃度時，HNK對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有一定保護(hù)作用，在10 μmol/L時保護(hù)作用最佳；隨著濃度升高保護(hù)作用減弱，達(dá)到50 μmol/L時甚至產(chǎn)生損傷作用。因此，選取10 μmol/L作為觀察HNK對SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的濃度。

2.3 HNK對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響免疫熒光法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，損傷組經(jīng)過400 μmol/L H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，凋亡細(xì)胞增多，Caspase-3的熒光較強(qiáng)。與損傷組比較，保護(hù)組凋亡細(xì)胞減少，Caspase-3的熒光強(qiáng)度減弱(圖3)。此外，溶劑組與損傷組比較，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

在流式細(xì)胞檢測儀上AnnexinV-PI雙染色顯示，與對照組比較，損傷組的細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與損傷組比較，保護(hù)組的細(xì)胞凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。溶劑組與損傷組比較，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 HNK對Bcl-2/Bax比值的影響損傷組較對照組Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)，保護(hù)組較損傷組比值增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。溶劑組與損傷組比較，HNK對Bcl-2/Bax比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 HNK對Caspase-3蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，損傷組Caspase-3蛋白表達(dá)增加，而保護(hù)組Caspase-3蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖6；與損傷組比較，溶劑組HNK對Caspase-3蛋白表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 HNK對ERS的影響損傷組BIP、CHOP及Caspase-12表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示ERS增加。加入低濃度HNK保護(hù)后，ERS相關(guān)指標(biāo)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。溶劑組與損傷組比較，HNK對BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

ERS過度可以干擾細(xì)胞正常功能，或通過ERS 相關(guān)的凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究[1]表明ERS介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑可能與多種中樞退行性疾病如PD 的發(fā)病有關(guān)。HNK是中藥厚樸中有效活性成分之一，有研究[11]報道HNK具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化的作用。但HNK對神經(jīng)元ERS的作用尚不十分清楚。本研究主要探究HNK對H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

Caspase-12是起始Caspase，是ERS的特異性凋亡成員，其誘導(dǎo)Caspase-3激活[12-13]。CHOP是ERS 條件下誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可引起細(xì)胞周期停滯及DNA 損傷，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，已經(jīng)被廣泛視為ERS 的凋亡標(biāo)志[14]。目前認(rèn)為CHOP 可以通過下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)而促進(jìn)ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此通過藥物干預(yù)后研究Caspase-12和CHOP表達(dá)可以初步了解藥物對ERS 的作用。

圖3 免疫熒光觀察SH-SY5Y細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)情況 ×50

圖4 流式細(xì)胞術(shù)測定SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡情況

圖5 Bcl-2/Bax比值情況

圖6 Caspase-3蛋白表達(dá)情況

圖7 BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)情況

本研究中，與對照組比較，H2O2刺激后造成SH-SY5Y細(xì)胞損傷(P<0.01)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時Bcl-2/Bax比值顯著降低，Caspase-3蛋白水平增加(P<0.01)，此外BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，提示H2O2刺激的神經(jīng)細(xì)胞ERS損傷模型成功。溶劑組與損傷組比較，HNK對BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示溶劑DMSO不會對研究造成影響。與損傷組比較，10 μmol/L HNK保護(hù)組凋亡細(xì)胞減少，Caspase-3的熒光強(qiáng)度減弱，同時蛋白表達(dá)結(jié)果也驗證了這一結(jié)論，提示HNK可以抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。此外，HNK能明顯下調(diào)BIP、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)，減少SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，說明HNK能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ERS相關(guān)的凋亡。

綜上，HNK可以在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，因此HNK可能對ERS導(dǎo)致的神經(jīng)損傷性疾病如PD的防治具有潛在的改善和保護(hù)作用。