硫化氫對大鼠基底動脈血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖及舒張作用的影響

陳錦花,陳志武

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)后發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)第3種氣體信號分子[1]。血管內(nèi)皮來源的H2S可通過舒張血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)調(diào)節(jié)血管張力和器官血流量[2]。血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2)介導(dǎo)了VEGF(vascular endothelial growth factor, VEGF)的大部分生物學(xué)效應(yīng)，是內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF驅(qū)動反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。VEGF作為促進(jìn)因子，通過激活血管VEGFR2產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移[3]。最近，有文獻(xiàn)[4]報(bào)道H2S通過斷裂內(nèi)皮細(xì)胞靶分子VEGFR2中Cys1045-Cys1024之間新的S-S鍵發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等作用。但是，H2S對VSMC的遷移、增殖及舒張作用是否與VEGFR2有關(guān)，尚未見報(bào)道。因此，該實(shí)驗(yàn)以VEGFR2為研究對象，應(yīng)用VEGFR2受體阻斷劑SU5416[5],探討H2S對VSMC遷移、增殖及舒張的影響，并揭示其與VEGFR2的關(guān)系，進(jìn)而闡明H2S促進(jìn)VSMC舒張作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑 NaHS實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解后避光保存，購自美國Sigma公司；SU5416購自美國MCE公司；重組大鼠VEGFA/VEGF164購自無錫Novopeotein公司；alpha SMA抗體(1 ∶200)購自常州Affinity公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Sigma公司;DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；胰酶購自南京維森特生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器 電子天平(FA1004)購自上海天平儀器廠；連續(xù)變倍體式顯微鏡(XTS-20)購自北京泰克儀器有限公司；全自動活細(xì)胞成像儀(Celldiscoverer 7.0)購自德國蔡司公司。

1.1.3動物 清潔級健康SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[合格證號：(皖)scxk2017-001]，飼養(yǎng)溫度為(22±3)℃。動物實(shí)驗(yàn)均符合安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1VSMC的培養(yǎng)與鑒定 取2只大鼠，麻醉后無菌狀態(tài)下斷頭取腦，在冰的無菌PBS中，顯微鏡下，小心剝離基底動脈的周圍組織，將基底動脈剝離干凈，置于另一有冰的無菌培養(yǎng)基小皿中轉(zhuǎn)移至超凈臺。將BAs轉(zhuǎn)移至含少許培養(yǎng)液(20 %的胎牛血清)的0.5 ml EP管中，用眼科鑷將BAs剪碎至約0.5 mm長的組織塊。最后將剪碎的組織塊吸出，Z字形鋪于小皿中(提前包被)，靜置于含 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)。約2 h后組織塊貼壁，加入4 ml培養(yǎng)基，4～5 d后待細(xì)胞長出后小心換液，之后可視細(xì)胞生長情況逐步換液。消化細(xì)胞方法如下：PBS清洗2～3遍；加入含0.25% Trypsin和0.02% EDTA的胰酶細(xì)胞消化液，待細(xì)胞變圓且未飄起時(shí)(顯微鏡下觀察)吸去胰酶，加入含20 %胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞并移入新的培養(yǎng)皿中加4 ml 培養(yǎng)液(20 %胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)。之后按細(xì)胞的生長情況進(jìn)行傳代和鑒定。① 形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、大小及排列方式。② 免疫熒光鑒定：在24孔板中放入多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片并接種VSMC懸液，2 d后進(jìn)行免疫熒光鑒定。實(shí)驗(yàn)步驟如下：吸去原培養(yǎng)液，PBS洗3遍；4%的多聚甲醛固定15 min;PBS洗3遍；0.1%的Triton室溫孵育10 min,3% BSA室溫孵育1 h，吸去。加入單克隆抗α-actin抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS液洗4遍(每次5 min)，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗4遍，方法同上；DAPI核染10 min,PBS洗3遍，每次5 min；細(xì)胞爬片上滴加抗熒光淬滅封固液，置于熒光顯微鏡下避光觀察并拍照。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將VSMC接種至6孔板，90%以上融合后，用黃色無菌槍頭在培養(yǎng)板單層VSMC的相同位置畫直線，造成“傷口”，PBS洗去脫落細(xì)胞，分為對照組、NaHS(100 μmol/L)組、NaHS+SU5416[5]組、VEGF(10 ng/ml)[4]組，孵育24 h,活細(xì)胞成像儀觀察VSMC從劃痕處向中央生長的距離，距離用于衡量細(xì)胞遷移能力，隨機(jī)取5個視野(每孔)觀察并拍攝，Image-J圖像軟件測量細(xì)胞遷移距離并計(jì)算平均值，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.3VSMC收縮幅度的測定 將上述培養(yǎng)的VSMC接種至6孔培養(yǎng)板，分別加入PBS、SU5416(10-5mol/L)、VEGF(10 ng/ml)后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)孵6 h,棄去培養(yǎng)基,并用PBS清洗2遍，加入900 μl培養(yǎng)基和100 μl NaHS(10-3mol/L)，60 s后，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量并記錄細(xì)胞長軸的長度，每孔隨機(jī)選取10個細(xì)胞計(jì)算平均長度。細(xì)胞的舒縮用細(xì)胞給藥前后的長度變化百分?jǐn)?shù)來表示，正值為舒張，負(fù)值為收縮。

細(xì)胞變化百分?jǐn)?shù)=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的平均長度-對照組細(xì)胞的平均長度)/對照組細(xì)胞的平均長度×100%。

1.2.4CCK-8增殖試劑盒檢測VSMC增殖活力在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔)，每孔約2 000個細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為對照組、NaHS組、NaHS+SU5416組、VEGF(10 ng/ml)組，每孔細(xì)胞在給藥24 h后加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度(optical density, OD)值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BAs VSMC原代培養(yǎng)與鑒定組織貼壁法培養(yǎng)SD大鼠BAs VSMC，培養(yǎng)第5天，顯微鏡下可觀察到有少量類長梭形或紡錘狀細(xì)胞從組織塊周圍爬出，約15 d后細(xì)胞生長較多，以組織塊為中心形成類似同心圓狀的細(xì)胞暈，部分重疊，表現(xiàn)為典型的 “峰”、“谷”狀生長。圖1A所示培養(yǎng)5、10、14 d的細(xì)胞狀態(tài)。應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色(抗α-actin抗體)鑒定VSMC，結(jié)果如圖1B顯示，第一張為細(xì)胞核(藍(lán)色)，第二張細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均能觀察到陽性綠色熒光并呈長梭形，第三張為Merge圖片。以上結(jié)果提示大鼠BAs VSMC原代培養(yǎng)成功。

2.2 免疫化學(xué)方法鑒定VSMCs中VEGFR2表達(dá)使用抗VEGFR2抗體，應(yīng)用免疫化學(xué)方法鑒定SMCs中VEGFR2表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，可見VEGFR2在VSMC中顯著表達(dá)，這為研究VEGFR2是否參與H2S介導(dǎo)的細(xì)胞遷移提供了基礎(chǔ)。

2.3 H2S促進(jìn)VSMCs遷移如圖3，與對照組相比，100 μmol/L NaHS可顯著提高VSMC的遷移能力(P<0.05)；SU5416(10-5mol/L)處理組可明顯降低NaHS對VSMC遷移能力的影響；與NaHS對VSMC遷移能力的作用相似， 10 ng/ml VEGF同樣顯著促進(jìn)大鼠BAs VSMC的遷移。以上結(jié)果表明，H2S可顯著提高VSMC的遷移能力，且與VEGFR2有關(guān)。

2.4 H2S對腦基底VSMC增殖的影響用CCK-8法檢測H2S是否促進(jìn)腦基底VSMC增殖，增殖能力用OD值表示(圖4)，VSMC用NaHS(10-4mol/L)刺激后，24 h后，NaHS組OD值均高于對照組(P<0.05),提示H2S可促進(jìn)VSMC的增殖；SU5416預(yù)處理組OD值明顯降低NaHS對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(P<0.05)，該結(jié)果表明阻斷VEGFR2抑制劑能夠降低H2S促進(jìn)VSMC增殖的作用，提示H2S氫介導(dǎo)的VSMC增殖可能與VEGFR2有關(guān)。

圖1 原代大鼠腦基底VSMC的培養(yǎng)及鑒定 ×100

圖2 大鼠腦基底VSMC VEGFR2 的鑒定 ×100

圖3 NaHS 對VSMC遷移能力的影響

2.5 H2S對腦基底VSMC舒張的影響NaHS可顯著提高VSMC的舒張作用(P<0.05)，如圖5，SU5416預(yù)處理組明顯降低NaHS對細(xì)胞的舒張作用(P<0.05)。以上結(jié)果表明H2S對大鼠腦基底VSMC的舒張作用可能與激動VEGFR2有關(guān)。

圖4 NaHS 對VSMC增殖能力的影響

圖5 NaHS對VSMC舒張能力的影響

3 討論

作為除NO和CO之外的第三種氣體信號分子，H2S參與調(diào)節(jié)血管張力和血壓[1，6]，且在體內(nèi)起著重要的生理作用：保護(hù)肺纖維化[6]、心肌缺血再灌注損傷[7]等等。在冠狀動脈缺血模型中，H2S具有血管生成作用[8]。眾所周知，血管生成在傷口愈合的早期至關(guān)重要[9]，因此，研究H2S對血管的生成、張力的調(diào)節(jié)及細(xì)胞的增殖、遷移成為新熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中使用原代培養(yǎng)的大鼠BAs VSMC，其細(xì)胞純度高，活力好，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為4～5代左右。本實(shí)驗(yàn)中采用的NaHS 作為H2S供體[2]，主要考慮以下幾個方面：① NaHS在溶液中解離成Na+和HS-, HS-和H+結(jié)合形成H2S。H2S氣和NaHS在溶液中都是以的H2S(1/3)和HS-(2/3)形式存在，呈動態(tài)平衡。② 細(xì)胞培養(yǎng)液中Na+濃度高達(dá)150 mmol/L,而實(shí)驗(yàn)中給與NaHS后Na+濃度增加μmol/L級別，這在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以忽略不計(jì)。③ 本實(shí)驗(yàn)所用NaHS濃度較低，對溶液pH值沒有影響，且目前國際上大都采用NaHS作為H2S的供體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本研究顯示VEGFR2在大鼠腦BAs VSMC中顯著表達(dá)[10]，該研究結(jié)果是開展H2S是否通過激動VSMC中VEGFR2促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移的研究的重要理論基礎(chǔ)。其次，運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。雖然開始的細(xì)胞劃痕比較直，但是24 h后劃痕邊緣便會變彎曲，因?yàn)椴煌恢玫募?xì)胞有不一樣的遷移能力，之后用Image-J軟件測算出遷移前后的距離，計(jì)算兩者之差即為細(xì)胞的遷移距離，這樣的數(shù)據(jù)更能準(zhǔn)確反映細(xì)胞的遷移能力。

細(xì)胞的遷移和增殖的發(fā)生發(fā)展過程受到多種因子的調(diào)控，其中較為重要的因子是VEGF。比如，VEGF可通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中酪氨酸激酶受體2，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[3]。本研究顯示10 ng/ml VEGF可提高大鼠BAs VSMC的增殖和遷移，并促進(jìn)VSMC的舒張，100 μmol/L NaHS(外源H2S供體)可同樣促進(jìn)血管VSMC的遷移、增殖和舒張功能，而10-5mol/L SU5416(VEGFR2抑制劑)可明顯降低NaHS對血管VSMC的增殖和遷移能力的影響，并降低VSMC的舒張幅度，以上結(jié)果提示H2S促進(jìn)VSMC的遷移、增殖和細(xì)胞舒張作用可能與激動VEGFR2有關(guān)。

目前關(guān)于H2S促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移作用的一個重要限制是體外還原模型的研究[11]。雖然這些模型確實(shí)有實(shí)質(zhì)性的有效性，但它們顯然不能模擬體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞增殖、遷移及血管生成現(xiàn)象。這些復(fù)雜的現(xiàn)象在空間和時(shí)間上受到嚴(yán)格的調(diào)控，如細(xì)胞外基質(zhì)的降解等等[12]。此外， H2S的信號傳遞被認(rèn)為是通過過硫酸鹽化發(fā)生的，即半胱氨酸殘基翻譯后修飾為過硫酸鹽。H2S可通過通道蛋白硫化激活KATP通道[13]或增加大腦小動脈VSMC Ca2+火花頻率激活BK通道，導(dǎo)致膜超極化和血管舒張[14]。綜上所述，進(jìn)一步思考H2S對VSMC產(chǎn)生的增殖、遷移及舒張作用是通過作用于VEGFR2中S-S鍵，引起下游通路的變化；或是導(dǎo)致VEGFR2發(fā)生硫化。這需要做更多的工作來描述H2S在這些過程中的確切作用。