β-DG過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620細(xì)胞凋亡的影響

錢 成，徐 濤，潘林鑫

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，可向肝、肺、腦、骨等臟器轉(zhuǎn)移，晚期可出現(xiàn)貧血、消瘦、惡病質(zhì)等表現(xiàn)，嚴(yán)重者危及生命。除了對(duì)結(jié)腸癌的臨床研究外，目前對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)研究也越來(lái)越深刻[1-2]。HCT116、SW620等細(xì)胞系是從結(jié)腸癌患者中分離建立的惡性細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌的細(xì)胞學(xué)研究。人類的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白 (dystroglycan，DG)是由位于染色體3p21上的DAG1基因編碼的含有895個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白，在體內(nèi)翻譯修飾后發(fā)生多肽鍵斷裂，最終水解成α-DG和β-DG 2個(gè)具有獨(dú)立功能的蛋白。α-DG是位于細(xì)胞膜上的高度糖基化蛋白，并通過(guò)與多種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而β-DG作為跨膜蛋白，其胞內(nèi)區(qū)直接與抗肌萎縮蛋白(dystrophin，Dys)結(jié)合，從結(jié)構(gòu)上分析，β-DG主要由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即N端(654～750 aa)和C端(775～895 aa)，它們通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain，TM)相連[3]。β-DG的N端與α-DG的C端通過(guò)非共價(jià)鍵的方式交聯(lián)，其C端的酪氨酸序列能夠結(jié)合胞內(nèi)的信號(hào)分子，并通過(guò)酪氨酸的磷酸化參與激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及改變細(xì)胞的極性等生物功能，在癌癥、遺傳性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[4-5]。該研究首先檢測(cè)四株常見(jiàn)的人結(jié)腸癌細(xì)胞系中β-DG的內(nèi)源表達(dá)情況，以確定β-DG低表達(dá)細(xì)胞系SW620，然后構(gòu)建pcDGFP-β-DG的真核表達(dá)質(zhì)粒，并過(guò)表達(dá)于SW620細(xì)胞中，研究β-DG對(duì)其細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞pcDNA3.1-FLAG-DAG1和pcDGFP真核表達(dá)載體質(zhì)粒由安徽醫(yī)科大學(xué)生物系范禮斌教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，DH5α感受態(tài)菌株HEK 293T和SW620等結(jié)腸癌細(xì)胞株由校實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；BamH I、Not I內(nèi)切酶以及T4連接酶購(gòu)自上海生工生物公司；膠回收、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；細(xì)胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、一抗稀釋液購(gòu)自上海碧云天公司；GFP抗體、β-DG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自澳洲HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLARK公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Opti-MEM低血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。AL600RGB凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司；Axio Observer 3倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)卡爾蔡司公司；MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀、CytoFlex流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1質(zhì)粒構(gòu)建[6]設(shè)計(jì)并合成引物序列：F：CC GGAATTCCGGGCCACCATGTCCATCGTGGTGGAA;R:AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAACAGG TGGGACCATAGGGA，以pcDNA3.1-FLAG-DAG1真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出β-DG的CDS序列，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到其PCR純化產(chǎn)物，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I對(duì)β-DG的PCR純化產(chǎn)物和pcDGFP空載體分別進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將二者的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)至單克隆生成(約12 h)，分別挑取數(shù)個(gè)單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(約12 h)，并抽提菌液中的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(EcoR I和Not I)，選擇鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃水浴復(fù)蘇凍存于液氮中的各細(xì)胞系，并用完全培養(yǎng)基(90% DMEM高糖+10% FBS+青鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。定時(shí)觀察細(xì)胞，及時(shí)更換完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上密度時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，將適量細(xì)胞重新接種至新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 本研究采用的轉(zhuǎn)染方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，步驟如下(以六孔板為例)：分別將適量pcDGFP-β-DG(2～3 μg)或pcDGFP和lip2000(4～6 μl)加到適量Opti-MEM轉(zhuǎn)染液中(約200 μl)，并輕輕充分混勻，室溫靜置5 min后將兩者輕輕充分混勻，室溫靜置20 min后，將溶液加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，培養(yǎng)4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染pcDGFP-β-DG約48 h后，分選并收集陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行裂解(冰上或4 ℃)，30 min后收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行高速冷凍離心(14 000 r/min,10 min)并收集上清液，蛋白定量后取出適量上清液，加入等量2×SDS上樣緩沖液充分混合，沸水浴5 min，冰浴5 min后取適量樣本進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(80 V約0.5 h，100 V約1.5 h)，200 mA恒流電轉(zhuǎn)1 h，取出PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1～2 h，TBST溶液洗膜后加入GFP一抗 (1 ∶500)進(jìn)行孵育(4 ℃過(guò)夜或室溫2 h)，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)進(jìn)行孵育(室溫1 h)，TBST溶液洗膜后用ECL試劑盒進(jìn)行顯色，在蛋白成像儀上進(jìn)行拍攝。

1.3.5免疫熒光觀察 轉(zhuǎn)染pcDGFP-β-DG約24 h后，取出SW620細(xì)胞爬片，用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次后進(jìn)行固定(-20 ℃預(yù)冷甲醇2 min+70%乙醇5 min)，由于GFP能夠自發(fā)綠色熒光，因此無(wú)需進(jìn)行一抗和二抗孵育，固定后用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次后進(jìn)行細(xì)胞核染色(0.15 g/L DAPI 2 min)，棄DAPI溶液后用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次后，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上。4 ℃保存過(guò)夜后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.6細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染了pcDGFP-β-DG(實(shí)驗(yàn)組)和pcDGFP空載體(對(duì)照組)，以及未轉(zhuǎn)染(空白組)的SW620，用不含EDTA的胰酶消化后低速收集(1 000 r/min, 3 min)，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入400 μl×Binding Buffer重懸細(xì)胞(濃度大約為1×106/ml),加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下反應(yīng)15 min，然后加入10 μl PI輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下反應(yīng)5 min，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。凋亡圖分為4個(gè)象限，左下象限為細(xì)胞存活率(Q1-LL)、左上象限為細(xì)胞死亡率(Q1-UL)、右上象限為細(xì)胞晚期凋亡率(Q1-UR)、右下象限為細(xì)胞早期凋亡率(Q1-LR)，本次實(shí)驗(yàn)凋亡率為Q1-UL、Q1-UR和Q1-LR 3個(gè)象限數(shù)值之和。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中β-DG的表達(dá)情況培養(yǎng)HT29、HCT116、SW480、SW620等結(jié)腸癌細(xì)胞系以及HEK293T腎上皮細(xì)胞系，并收集適量以上5種細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白，定量分析后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，當(dāng)用β-DG抗體進(jìn)行免疫印跡時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種細(xì)胞蛋白樣品在43 ku處均出現(xiàn)蛋白條帶，大小基本符合β-DG的分子量。但與正常上皮細(xì)胞相比，各結(jié)腸癌細(xì)胞系中β-DG的表達(dá)量都有不同程度的減少，其中SW620細(xì)胞的β-DG表達(dá)量最少，適合用于后續(xù)β-DG的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中β-DG的表達(dá)情況

圖2 pcDGFP-β-DG重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序結(jié)果

2.2 β-DG真核表達(dá)載體的構(gòu)建通過(guò)PCR擴(kuò)增、雙酶切、酶連、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與抽提后擬得到pcDGFP-β-DG重組質(zhì)粒，利用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2A所示，重組質(zhì)粒被切出兩條亮帶，通過(guò)DNA Marker、PCR產(chǎn)物和空載體的橫向比較，發(fā)現(xiàn)一條亮帶大小約為6 100 bp，與pcDGFP空載體的大小基本一致，另一條亮帶大小約為720 bp, 與β-DG的片段大小基本一致。將此重組質(zhì)粒送生物公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與β-DG的CDS序列(729 bp)進(jìn)行比對(duì)，堿基序列完全一致，表明pcDGFP-β-DG重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2B。

2.3 β-DG在SW620細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和熒光定位情況將pcDGFP-β-DG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中，收集、裂解細(xì)胞后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，當(dāng)用GFP抗體進(jìn)行免疫印跡時(shí)，結(jié)果顯示空載體對(duì)照組、β-DG過(guò)表達(dá)組分別在25 ku和70 ku左右的位置出現(xiàn)條帶，即為GFP和GFP-β-DG(27+43 ku)融合蛋白的蛋白表達(dá)，而空白對(duì)照組未見(jiàn)任何條帶，表明pcDGFP-β-DG重組質(zhì)粒能夠在SW620細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，見(jiàn)圖3。另外，制作SW620細(xì)胞爬片，過(guò)表達(dá)GFP-β-DG后進(jìn)行免疫熒光制片，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示GFP-β-DG自發(fā)綠色熒光，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)顯著表達(dá)，且在細(xì)胞質(zhì)中靠近核膜一側(cè)的定位更加明顯，見(jiàn)圖3。

2.4 β-DG過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響分別將pcDGFP-β-DG和pcDGFP(作為對(duì)照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中，約24 h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染，然后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況，共進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，空白組(未轉(zhuǎn)染)和對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDGFP空載體)細(xì)胞凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDGFP-β-DG)細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4，表明過(guò)表達(dá)β-DG能夠有效促進(jìn)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

圖3 β-DG在SW620細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)和熒光定位圖 ×630

圖4 β-DG過(guò)表達(dá)后SW620細(xì)胞的凋亡圖

表1 β-DG過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響

2.5 β-DG過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響分別將pcDGFP-β-DG和pcDGFP(作為對(duì)照)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中，約24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，共進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)用PARP抗體進(jìn)行免疫印跡時(shí)，結(jié)果顯示空白組、空載體對(duì)照組、β-DG過(guò)表達(dá)組均在113 ku左右的位置出現(xiàn)條帶，即為完整的PARP蛋白，相對(duì)而言，β-DG過(guò)表達(dá)組的PARP蛋白含量有所降低，且在約90 ku的位置還出現(xiàn)了另一條帶，即為PARP的裂解片斷，見(jiàn)圖5。表明過(guò)表達(dá)β-DG能夠有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白PARP裂解，即促進(jìn)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

圖5 β-DG過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白PARP的影響

3 討論

DG是一種跨膜的糖蛋白，β-DG作為其水解衍生物，是組成細(xì)胞表面的重要成分，廣泛分布于脊椎動(dòng)物的骨骼肌和其他組織中[7]。β-DG的N端存在著潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)，在其C末端存在一個(gè)PPXY序列，該序列又與一個(gè)含有兩個(gè)高度保守色氨酸殘基的WW結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，構(gòu)成了蛋白質(zhì)相互作用的一種模式，此結(jié)合的穩(wěn)定性取決于抗肌萎縮蛋白的EF-手形結(jié)構(gòu)域。此外，β-DG的胞質(zhì)尾區(qū)能夠與包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、絲裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,GRB2)等在內(nèi)的眾多信號(hào)分子充分結(jié)合，進(jìn)而起到穩(wěn)定神經(jīng)肌肉接頭，傳遞細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。DG的異常表達(dá)是癌癥發(fā)生的一個(gè)重要特征，與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]，這種異常除了與α-DG糖基化水平改變有關(guān)外，還與β-DG的異常表達(dá)有關(guān)。在人類的乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、舌鱗狀細(xì)胞癌中都發(fā)現(xiàn)了β-DG的異常[9-11]，這種異常主要表現(xiàn)在其非正常裂解導(dǎo)致的表達(dá)量下降。本研究首先利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了HT29、HCT116、SW480、SW620等常見(jiàn)的結(jié)腸癌細(xì)胞系中內(nèi)源性β-DG的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各癌細(xì)胞系中正常分子量β-DG(43 ku)的表達(dá)量均有不同程度的下降，其中SW620下降的最為明顯，另外，這些結(jié)腸癌細(xì)胞系在約31 ku的位置均出現(xiàn)了蛋白條帶，這可能是正常β-DG蛋白水解后的胞外結(jié)構(gòu)域，它的產(chǎn)生是由于膜相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶的活化，破壞了DG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

本研究首先確定了β-DG在各結(jié)腸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，接下來(lái)選擇了低表達(dá)程度最高的SW620細(xì)胞進(jìn)行β-DG的過(guò)表達(dá)研究。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了pcDGFP-β-DG真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了其表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-DG能夠成功過(guò)表達(dá)。同時(shí)還利用了免疫熒光技術(shù)對(duì)β-DG在SW620中的細(xì)胞定位進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP-β-DG蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，而且在細(xì)胞質(zhì)中靠近核膜的一周表達(dá)量更多，此結(jié)果與之前研究的FLAG-β-DG在COS7細(xì)胞中的定位結(jié)果基本一致[12]。而且根據(jù)位置推測(cè)，β-DG蛋白定位可能與高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有著密切的聯(lián)系，所以在接下來(lái)的研究中，可以選擇高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志染料麥胚凝集素或刀豆球蛋白A與β-DG進(jìn)行共定位研究，進(jìn)一步確定β-DG蛋白的具體亞定位。

本研究旨在探索β-DG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及組織系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。而細(xì)胞凋亡的抑制或減弱與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，許多化療藥物發(fā)揮作用的機(jī)制就是誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[13]。因此本研究在確定結(jié)腸癌細(xì)胞系和β-DG的過(guò)表達(dá)效果后，便利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)β-DG對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-DG過(guò)表達(dá)后能夠提高SW620細(xì)胞的凋亡率，表明β-DG具有促凋亡功能。為了進(jìn)一步確定這個(gè)結(jié)果，又檢測(cè)了過(guò)表達(dá)β-DG后SW620細(xì)胞中二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)蛋白水平的變化，PARP為一種依賴鋅離子(Zn2+)的真核DNA結(jié)合蛋白，可特異性地識(shí)別DNA斷裂末端并結(jié)合，是一種重要的DNA修復(fù)酶，在細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期， PARP是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族(如caspase 3和caspase 7)的作用底物，后者可使PARP的DNA 修復(fù)功能喪失，并將113 ku的PARP水解為89 ku的片斷。因此PARP可以作為細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志物，許多研究便是通過(guò)Western blot檢測(cè)PARP的完整蛋白(113 ku)及其裂解片斷(89 ku)的表達(dá)量來(lái)觀察細(xì)胞凋亡效果[14]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-DG過(guò)表達(dá)后PARP的完整蛋白(113 ku)含量下降，且裂解片斷(89 ku)的表達(dá)量升高，同樣表明過(guò)表達(dá)β-DG具有促凋亡功能。

綜上所述，β-DG在結(jié)腸癌細(xì)胞系中異常表達(dá)，主要表現(xiàn)在其異常的水解斷裂。過(guò)表達(dá)β-DG能夠顯著促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步了解β-DG功能，及其與結(jié)腸癌之間的關(guān)系提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。