三叉神經痛模型大鼠的三叉神經節(jié)中JAK/STAT3通路的活化

張 瑤，劉亞軍，李 芳，朱大衛(wèi)，王元銀，侯愛兵

JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子信號STAT3轉導通路是一條從膜到核的信號轉導通路，能在多種病理生理過程發(fā)揮重要作用[1]。其主要由JAK蛋白酪氨酸激酶和STAT3蛋白連接蛋白兩部分組成，能在細胞因子誘導下被活化從而調節(jié)目的基因的表達[2]。JAK/STAT3通路能在許多細胞類型中被與損傷反應有關的細胞因子激活，因此在疼痛信息的傳遞和調節(jié)中發(fā)揮著重要作用[3]。神經性疼痛的發(fā)展也伴隨著炎癥成分的釋放，可引發(fā)神經損傷并由各種信號通路傳遞信息從而引發(fā)更加廣泛和持久的效應，這些均可能使疼痛過敏增強[4]。脊神經損傷(建立脊神經縮窄動物模型)后脊髓中有pSTAT3、白介素(IL)-6、IL-1β蛋白的表達上調，而在給予JAK/STAT通路抑制劑后IL-6、IL-1β的表達則明顯減低并伴隨機械痛敏的減弱[5]，提示JAK/STAT通路在神經性疼痛的免疫炎癥反應中有著重要作用。而有關三叉神經痛(trigeminal neuralgia, TN)模型大鼠的三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion, TG)中有無JAK/STAT3通路的活化尚無研究涉及，因此該研究旨在通過成功建立大鼠TN模型，使用Western blot、免疫熒光方法檢測pSTAT3在TN大鼠TG中的變化情況，為探討有效的TN治療方法提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取體質量為120 g左右的成年雄性SD大鼠，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水進食，室內環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，12 h交替照明。造模前對所有大鼠進行Von Frey毛刷的刺激訓練練習，在每日基本固定的時間段內(避免在下午5點以后進行，否則大鼠比較活躍測量不準確)交替刺激大鼠雙側觸須墊區(qū)域約6次，刺激間隔30～60 s，持續(xù)3～5 d后記錄每只大鼠在此期間的平均機械閾值，剔除對刺激異常敏感(<0.6 g)及過于遲鈍(>1.8 g)的大鼠，使得最后選出用于造模的大鼠健康且對一定機械強度下的刺激反應平靜，依照動物倫理學的原則進行所有的動物實驗和處理。實驗所用大鼠均來自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 實驗模型建立將32只雄性SD大鼠按照隨機分組的原則將其分成2組，即假手術組(Sham組)16只，眶下神經縮窄組(CCI-ION組)16只。稱重后，按照每100 g體質量給予0.38 ml 10% 水合氯醛的比例對大鼠行腹腔注射麻醉。待麻醉顯效后，將大鼠放置于消毒鋪巾后的操作臺上，對擬操作的術區(qū)用0.5%碘伏消毒，沿大鼠左側顴骨下緣胡須墊區(qū)稍偏內側做約5 mm長的手術切口，紋氏鉗略擴大手術切口后向下鈍性分離組織，用玻璃分針輕柔的顯露出約3 mm長度的眶下神經，注意操作輕柔，最后用5-0號線在相距2～3 mm處分別結扎眶下神經使其輕微壓迫，縫合皮膚創(chuàng)口并涂抹金霉素軟膏預防感染；對于Sham組行手術切口的部位及前期方法相同，而在玻璃分針顯露出眶下神經后不予以結扎，僅縫合皮膚切口并涂抹金霉素軟膏完成造模。最后分別將Sham組與CCI-ION組模型大鼠置入不同的鼠籠中并備注相應標簽后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 實驗模型驗證使大鼠在安靜環(huán)境下穩(wěn)定15 min后，用Von Frey毛刷從最小的刺激力度開始依次增大刺激大鼠的術側胡須墊區(qū)進行檢測，每個刺激力度的檢測需重復6次，每次間隔30 s，直至大鼠出現(xiàn)以下陽性反應：逃避或攻擊以及不對稱的面部搔抓行為中的至少1項，此時記錄下出現(xiàn)陽性反應的最小刺激力度即為機械敏感閾值。實驗大鼠分別在術前和術后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d時記錄閾值并統(tǒng)計分析。

1.4 Western blot法檢測pSTAT3蛋白含量將未行任何手術操作的Naive大鼠和建模后第3、7天的大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死，遂立即于冰上分離取出術側TG并編號稱重，于冰浴的玻璃勻漿器內按照1 mg組織加入10 μl RIPA裂解液的比例在剪碎神經節(jié)后進行研磨，待無肉眼可見大塊組織后，于4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min；取上清液按照比例加入蛋白上樣緩沖液，于100 ℃條件下加熱10 min使蛋白充分變性，最后置于-20 ℃冰箱內儲存?zhèn)溆?。上樣行SDS凝膠電泳后將目的蛋白轉移到PVDF膜上，TBST溶液漂洗3次每次約5 min后，將PVDF膜置于5% 脫脂牛奶中室溫下封閉1 h。用一抗稀液稀釋一抗(pSTAT3-Tyr705：1 ∶10 000，美國Abcam公司，貨號ab76315；GAPDH: 1 ∶10 000，美國 Bioworld公司，貨號AP0063)，隨后將PVDF膜置入并于4 ℃搖床孵育過夜。將充分漂洗后的PVDF膜置于已稀釋好的二抗中室溫孵育1 h。最后將漂洗后的膜置于顯影機內設置條件曝光成像，采用Image J圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫熒光實驗將Sham組大鼠與建模后第2天的CCI-ION大鼠用前述方法取出術側TG后于4 ℃冰箱內梯度脫水固定TG(分別置于4%多聚甲醛溶液中20 min, 10%蔗糖溶液、20% 蔗糖溶液中各2 h, 30%蔗糖液中過夜)，取出后用組織包埋劑于-20 ℃環(huán)境下包埋TG，在冰凍切片機上切片后于-20 ℃冰箱內保存待用，取出的冰凍切片復溫15 min后于PBS中洗膠后用配置好的含有山羊血清的PBST封閉液于室溫條件下封閉2 h，充分漂洗后將按照比例稀釋后的一抗加于組織玻片上[pSTAT3-Tyr705：ab76315，1 ∶100；兔抗GFAP：ab7260，1 ∶1 000；兔抗NeuN：ab177487，1 ∶300；鼠抗CD11b(ITGAM)：ab8878，1 ∶200)(美國Abcam公司)；鼠抗pSTAT3-Tyr705：#4113，1 ∶100(美國Cell Signaling Technology公司)]，置于4 ℃冰箱內孵育過夜后取出，漂洗殘余的一抗孵育液后用封閉液稀釋二抗(山羊抗小鼠IgG/TRITC(ZF0313)、山羊抗兔IgG/FITC(ZF0311)：1 ∶100，北京中杉金橋科技有限公司)，室溫下暗箱內避光孵育2 h后于PBS液中漂洗，避光黑暗環(huán)境下滴加防熒光淬滅液后置蓋玻片固定，并放置于-20 ℃冰箱內避光保存待用。

1.6 統(tǒng)計學處理采用 SPSS 17.0軟件進行分析，行為學實驗結果和Western blot結果采用重復測量設計的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學實驗結果Von Frey毛刷測定結果顯示CCI-ION組大鼠的機械敏感閾值明顯低于Sham組大鼠。術后第1天CCI-ION組大鼠機械敏感閾值即開始降低[Sham組：(1.55±0.22)g，CCI-ION組：(0.35±0.21)g]，在第14天時疼痛閾值達到最低[Sham組：(1.53±0.04)g，CCI-ION組：(0.10 ±0.04)g，F(xiàn)=25.13，P<0.05](圖1)。

圖1 各組大鼠觸須墊在造模后不同時間點機械敏感閾值的變化

2.2 pSTAT3蛋白在TG中的表達變化Western blot結果顯示，CCI-ION組大鼠TG中pSTAT3蛋白相對表達量在術后第3、7天時較Sham組大鼠均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(F=64.37，P<0.05)。見圖2。

圖2 pSTAT3蛋白在 CCI-ION 組大鼠術側TG中的表達變化

2.3 pSTAT3蛋白的免疫熒光表達及其定位在術后第2天的術側TG內，CCI-ION組大鼠可見大量的pSTAT3綠色熒光(圖3A2)而在Sham組大鼠pSTAT3標記的綠色熒光則很少(圖3A1)。在分別行pSTAT3與GFAP(衛(wèi)星膠質細胞標志物)、ITGAM(小膠質細胞標志物)、Neun(神經元細胞標志物)的免疫熒光雙染實驗后發(fā)現(xiàn)，在術后第2天，pSTAT3僅與ITGAM有大量的共染(圖3B3中表現(xiàn)為黃色的共染區(qū))，而與GFAP無共染(圖3C)，與Neun亦無共染(圖3D)，提示活化的pSTAT3定位于小膠質細胞內。比例尺均為50 μm。

3 討論

TN是一種嚴重的慢性疼痛綜合征，在三叉神經的一個或多個分支的口面部區(qū)域內出現(xiàn)嚴重的、短暫的、陣發(fā)性的電擊樣疼痛，常由接觸“扳機點”引發(fā)，發(fā)病率為4%～13%[6]。目前其具體發(fā)病機制尚不完全清楚，周圍致病因素認為是TG及腦橋區(qū)的異常壓迫引起的，而中樞發(fā)病機制理論則認為TN是一種感覺性癲癇樣發(fā)作[7]。針對其完全有效的理想治療方法尚未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段對TN的經典治療手段主要是卡馬西平、奧卡西平等抗癲癇藥，但是治療后復發(fā)率仍較高[8]。因此闡明TN的有關分子生物學發(fā)病機制對進一步探究其有效的治療方法是必需的。

用CCI-ION術建立TN模型是由Vos et al[9]于1994年首次提出的一種經典的造模方法，其能有效模擬出TN的自發(fā)性疼痛及痛覺過敏兩大方面，其中大鼠胡須墊區(qū)的機械閾值測定是判斷造模有無成功的標準。近年來，研究[5]顯示STAT3通路的活化參與了外周神經損傷后脊髓內痛覺信息的傳遞和調節(jié)。此外，在糖尿病神經性痛及奧利沙鉑引發(fā)神經性疼痛的大鼠模型中亦觀察到JAK/STAT3通路的活化[1,10]。神經系統(tǒng)中膠質細胞是除神經元外的第二大主要成分，外周神經系統(tǒng)(PNS)中的膠質細胞主要由衛(wèi)星膠質細胞、施萬細胞和小膠質細胞組成[11]。本研究中CCI-ION術后第2天的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)pSTAT3定位于TG中的小膠質細胞上，這與Dominguez et al[5]在脊神經損傷模型中的觀察結果相似。然而，有報道[12-13]表明，除了小膠質細胞外，上調的pSTAT3還存在于其他類型的細胞中，這種差異可能是由于行實驗檢測的時間點不同或取材標本不同引起。

圖3 術后第2天的術側TG內pSTAT3的免疫熒光表達及其定位

本研究由CCI-ION術建立大鼠模型，結果表明，在術后第14天的機械閾值檢測中，CCI-ION組較Sham組均明顯降低，提示TN模型建立成功。同時，Western blot實驗結果表明，CCI-ION后術側TG的pSTAT3蛋白相對表達量明顯增加。在Dominguez et al[14]的研究中，脊髓內pSTAT3的免疫熒光表達在術后24～48 h時最高，因此本實驗選用術后第2天(術后48 h)作為免疫熒光的檢測時間點。結果表明CCI-ION組的術側TG中有大量的pSTAT3熒光染色，而Sham組僅可見很少的pSTAT3熒光染色。這些發(fā)現(xiàn)可能為TN的治療及相關分子機制研究提供了新的方向。