堆肥土著微生物演替響應(yīng)抗酸化菌劑研究

宋彩紅，齊 輝，魏自民，席北斗

（1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012）

近年來(lái)，關(guān)于堆肥過(guò)程接種外源微生物菌劑問(wèn)題受到關(guān)注。堆肥土著微生物種類(lèi)和數(shù)量可滿(mǎn)足堆肥需要，因此無(wú)需額外接種[1-2]。接種微生物菌劑在提高堆肥效率方面效果不穩(wěn)定，并可能在與堆肥土著微生物競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中死亡[3]。Nakasaki 等認(rèn)為特殊物料堆肥單純依靠土著微生物，存在堆肥效率低下、質(zhì)量差問(wèn)題，需接種功能微生物菌劑[4]。餐廚垃圾富含油脂等易降解有機(jī)質(zhì)，堆肥初期易出現(xiàn)小分子有機(jī)酸累積現(xiàn)象，導(dǎo)致堆料酸化、微生物活性受抑制，堆溫延滯上升，甚至發(fā)酵崩潰[5-6]，研究表明接種高效有機(jī)酸降解菌劑可有效解決此問(wèn)題[7-8]。

有機(jī)酸降解菌劑主要分為單一菌種[4-5,8]和混合培養(yǎng)復(fù)合菌系[9]，單一菌種菌劑對(duì)堆肥環(huán)境適應(yīng)能力較差、效果不穩(wěn)定，通過(guò)接種畢赤酵母，可有效解決餐廚垃圾堆肥初期酸化抑制問(wèn)題，但該菌劑在高溫期無(wú)法存活[4]。課題組前期研究表明，抗酸化微生物復(fù)合菌系A(chǔ)AMC 接種，不但可有效提高餐廚垃圾堆肥效率，還顯著提高腐殖酸數(shù)量和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，改善堆肥品質(zhì)[10]。堆肥是多種微生物發(fā)揮功能復(fù)雜體系[11]，接種微生物與土著微生物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，土著微生物間存在競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)作關(guān)系[1]。目前，AAMC 菌劑與堆肥土著微生物關(guān)系不清，菌劑接種效果不穩(wěn)定，限制后期實(shí)際應(yīng)用。本研究通過(guò)對(duì)比AAMC 接種堆肥、添加化學(xué)緩沖劑堆肥和自然堆肥，從細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌三大類(lèi)群全方位揭示堆肥土著微生物演替響應(yīng)AAMC菌劑規(guī)律，揭示堆肥土著微生物與AAMC 關(guān)系，以期為AAMC工廠化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

餐廚垃圾取自中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院職工食堂，堆肥前對(duì)餐廚垃圾預(yù)處理，具體方法參見(jiàn)前期研究[10]；麩皮取自順義實(shí)驗(yàn)基地附近農(nóng)戶(hù)，本研究作為調(diào)理劑使用，調(diào)節(jié)堆料含水率和C/N，堆料具體性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 堆肥材料理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical characteristics of composting substrates

1.2 AAMC篩選和馴化

AAMC篩選、馴化和構(gòu)建方法已在前期研究中展示[10]，此處不再贅述。該復(fù)合菌系由2種Pseudo?monas、2 種Bacillus、1 種Dysgonomonas、1 種Lac?tobacillus和1種Aeribacillus菌種組成。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將餐廚垃圾與麩皮按比例充分混合均勻，得到堆肥混合物理化性質(zhì)如下：C/N為25.6；含水率為60.6%。設(shè)置3 個(gè)堆肥組，結(jié)果見(jiàn)表2。①接種組：堆肥前于堆肥混合物接入處于對(duì)數(shù)期抗酸化復(fù)合菌系A(chǔ)AMC（菌體濃度為1×108CFU·mL-1），接種量為1.25 mL 菌液·kg-1堆料（以干基計(jì)）；②加堿組：添加堿性化合物MgO 和K2HPO4，以緩解堆肥初期密集酸化導(dǎo)致pH 下降，添加量分別為0.05 mol·L-1MgO·kg-1堆料和0.1 mol·L-1K2HPO4·kg-1堆料（以干基計(jì)）；③設(shè)立自然堆肥組為空白對(duì)照。采用在線(xiàn)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器堆肥[12]，試驗(yàn)過(guò)程中使通風(fēng)量保持在0.5 L·min-1·kg-1，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)堆溫和含水率，定期翻堆。在堆肥30 h、2 d和30 d取樣，分別作為升溫期、高溫期、降溫和腐熟期樣品，置于-20 ℃保存，用于PCR-DGGE分析。

表2 堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Composting experimental design

1.4 理化指標(biāo)分析

溫度：堆肥裝置在線(xiàn)監(jiān)測(cè)記錄；C/N、pH和有機(jī)質(zhì)分別采用元素分析儀、pH計(jì)和馬弗爐測(cè)定，方法參照文獻(xiàn)[7,10]；含水率：采用差重法測(cè)定[10]。

1.5 微生物群落分析

采用PCR-DGGE 技術(shù)檢測(cè)堆肥細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌群落多樣性，DNA 提取和純化采用MOBIO Power Soil 基因組提取試劑盒（美國(guó)Mobio）。細(xì)菌PCR體系和擴(kuò)增程序、DGGE條件、優(yōu)勢(shì)條帶切膠回收參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]，真菌擴(kuò)增引物為Fung-GC（GC-clamp-5' ATTCCCCGTTACCCGTTG-3' GC-clamp：5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC CCGCCCC 3'）和 NS1（5' GTAGTCATATGCTTGTCTC 3'）PCR 體系：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、MgCl24 μL、引物（10 μM）各1 μL、ExTaq（大連TaKaRa）1.5 U、模板DNA 20～50 ng、滅菌超純水補(bǔ)齊至50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60～50 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s， 58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。DGGE條件：膠濃度為6%～12%（M·V-1），上樣量為15 μL，60 ℃下 65 V 電泳 16 h，SYBREGreen 染色。優(yōu)勢(shì)條帶切膠回收參見(jiàn)文獻(xiàn)，其中第二輪pcr擴(kuò)增引物和程序同上。放線(xiàn)菌PCR 體系和擴(kuò)增程序、DGGE 條件、優(yōu)勢(shì)條帶切膠回收參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]，細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌測(cè)序工作均由北京市理化分析測(cè)試中心完成。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Quantity one v4.62軟件將DGGE凝膠圖譜數(shù)字化后，按照Vivas 等[15]方法對(duì)DGGE 圖譜中各泳道微生物作香農(nóng)指數(shù)（H'）和辛普森指數(shù)（D）分析，H'通過(guò)公式H'=-ΣPilnPi計(jì)算，D通過(guò)公式D=ΣPi2計(jì)算，其中，Pi是泳道中條帶相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌演替規(guī)律分析

2.1.1 細(xì)菌DGGE圖譜分析

圖1 顯示3 個(gè)處理堆肥過(guò)程DGGE 條帶種類(lèi)和分布差異較大，接種組DGGE條帶數(shù)顯著高于對(duì)照和加堿組，說(shuō)明接種AAMC 增加細(xì)菌多樣性。條帶1、5、21、22、32、33、34、35、36、37 和39為接種組特有條帶，而這些條帶并非來(lái)源于所接種AAMC，說(shuō)明接種AAMC可能激發(fā)新細(xì)菌種類(lèi)產(chǎn)生，尤其是在升溫期。條帶A、B、C、D、E、F、G為AAMC中主要細(xì)菌種類(lèi)。

由圖1可知，條帶A～G在接種組中均為優(yōu)勢(shì)條帶，說(shuō)明來(lái)源于餐廚垃圾堆肥AAMC 適應(yīng)餐廚垃圾堆肥環(huán)境良好，發(fā)揮其有機(jī)酸降解功能。與對(duì)照組相比，加堿組高溫期DGGE 條帶數(shù)顯著降低，這可能與其較高堆溫有關(guān)，Nakasaki 等研究表明，高溫對(duì)細(xì)菌有篩選作用[4]。

2.1.2 細(xì)菌群落多樣性分析

H'反映物種豐度和分布均勻性，與物種多樣性呈正相關(guān)[16]。D反映物種多樣性，呈負(fù)相關(guān)[17]。由圖2 可見(jiàn)，接種和加堿組H'在堆肥過(guò)程中均呈現(xiàn)先降后升變化趨勢(shì)，由堆肥溫度變化對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)躍遷影響所致；D均呈現(xiàn)先升后降變化趨勢(shì)，反映高溫對(duì)細(xì)菌群落篩選作用，這與H'研究結(jié)論一致。對(duì)照組H'和D變化較小，這與其堆肥過(guò)程較平穩(wěn)溫度變化有關(guān)[3]。在堆肥周期中，接種組H'均高于加堿組和對(duì)照組，D低于其他兩組，尤其在升溫期，說(shuō)明接種AAMC 可提高餐廚垃圾堆肥細(xì)菌多樣性，與接種菌劑可引入微生物有關(guān)，也與所引入AAMC 在餐廚垃圾堆肥中良好定殖狀況和激發(fā)新細(xì)菌種類(lèi)產(chǎn)生有關(guān)（見(jiàn)圖1）。在高溫期，加堿組H'明顯低于對(duì)照組，D高于對(duì)照組，添加化學(xué)緩沖劑降低細(xì)菌群落多樣性，而在堆肥腐熟期，隨溫度降低和細(xì)菌對(duì)堿性環(huán)境適應(yīng)，多樣性恢復(fù)。

2.1.3 細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落分析

優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表3。39個(gè)條帶被成功測(cè)序。接種組特有條帶1、5、21、22、32、33、34、35、36、37和39，分別屬于Legionella、Aerib?acillus、Deinococcus、 Uncultured bacterium、Aneu?rinibacillus、Sphingobacterium、Escherichia、Sphin?gobacterium、Flavobacterium、Bacillus和Pusillimo?nas。課題組前期揭示上述Legionella、Deinococ?cus、Escherichia和Bacillus是乙酸和丙酸代謝途徑關(guān)鍵酶來(lái)源菌[3]，說(shuō)明接種AAMC 激發(fā)乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌產(chǎn)生，接種組升溫期（此階段正對(duì)應(yīng)對(duì)照組酸化抑制期）檢測(cè)條帶34（Escherichia）和37（Bacillus），這可能是接種組避免初期酸化抑制原因之一。Karadag 等報(bào)道Sphingobacterium和Flavo?bacterium與木質(zhì)素降解有關(guān)[18]，而木質(zhì)素降解過(guò)程與腐殖酸合成緊密相關(guān)[19]。接種組特有條帶33、35和36 屬于此兩屬，且這3 個(gè)條帶分別來(lái)自接種組升溫期、腐熟期和高溫期，說(shuō)明接種AAMC在堆肥周期內(nèi)可激發(fā)木質(zhì)素降解細(xì)菌產(chǎn)生，這與接種組堆肥較高腐殖化程度相關(guān)[10]。

課題組前期通過(guò)宏蛋白質(zhì)組學(xué)揭示乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌還有：Bacillus（條帶14、16、17、18、19、28、29、31 和 37）、Pseudomonas（條帶4、6、9 和 26）、Staphylococcus（條帶 20）和Strepto?coccus（條帶7和13）[3]。由于餐廚垃圾堆肥酸化抑制主要發(fā)生在初期階段，對(duì)比不同處理升溫期乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌。對(duì)照組檢測(cè)到4、6、9、13四個(gè)條帶，屬于Pseudomonas和Streptococcus兩個(gè)屬；加堿組有7、13、19、28 四個(gè)條帶，屬于Streptococcus和Bacillus兩個(gè)屬；接種組有 13、17、28、29、31 五個(gè)條帶，再加上接種組分布在升溫期特有條帶34 和37，共檢測(cè)到7 個(gè)乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌種類(lèi)，分別屬于Streptococcus、Bacillus和Escherichia3 個(gè)屬。上述結(jié)果顯示堆肥升溫期接種組乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌多樣性明顯高于加堿組和對(duì)照組，這可能是接種AAMC 能克服初期酸化抑制主要原因。與對(duì)照組相比，加堿組在升溫期乙酸和丙酸降解關(guān)鍵細(xì)菌多樣性并無(wú)明顯差異，僅是細(xì)菌種類(lèi)不同。

此外，檢測(cè)到乳酸產(chǎn)生菌Lactobacillus[20]（條帶8、10和11）和Weissella[5]（條帶3），3個(gè)處理在升溫期都檢測(cè)到乳酸產(chǎn)生菌（接種組：3種；加堿組：2種；對(duì)照組：2 種），在腐熟期對(duì)照組仍檢測(cè)到所有4種乳酸產(chǎn)生菌，加堿組檢測(cè)到1種，接種組未檢測(cè)到。研究表明Aeribacillus（條帶5）分泌羧甲基纖維素酶，此酶主要參與多糖和木質(zhì)纖維素降解[21]、Mei 等發(fā)現(xiàn)Serratia（條帶 25）和Aneurinibacil?lus（條帶 32）具有降解木質(zhì)素能力[22]。Thermobacil?lus（條帶38）是嗜熱細(xì)菌，具有木聚糖降解功能。上述木質(zhì)纖維素降解菌在接種組檢測(cè)到3種，在對(duì)照組檢測(cè)到2種，在加堿組僅檢測(cè)到1種，且在腐熟期僅有接種組檢測(cè)到兩種木質(zhì)素降解菌（條帶25和32），其他兩組均未檢測(cè)到，這可能與接種組較高腐殖酸程度有關(guān)[10]。Sporosarcina（條帶15）是耐酸菌，在低pH 條件下可阻止H+進(jìn)入其細(xì)胞質(zhì)[23]，僅在對(duì)照組檢測(cè)到，對(duì)照組堆料長(zhǎng)期處于酸化狀態(tài)。Francis 等報(bào)道Pantoea agglomerans（條帶24）是兼性厭氧菌，以乙酸為電子供體、Fe（Ⅲ）為電子受體作電子傳遞，同步降解復(fù)雜有機(jī)物[24]。

本研究在接種組堆肥周期內(nèi)均檢測(cè)到Pantoea agglomerans分布，說(shuō)明Pantoea agglomerans對(duì)接種組堆肥過(guò)程中乙酸代謝發(fā)揮重要作用，對(duì)接種組克服酸化抑制起積極作用。在加堿組升溫期檢測(cè)到Pantoea agglomerans，說(shuō)明Pantoea agglomer?ans在加堿組緩解堆肥初期酸化抑制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

表3 細(xì)菌DGGE條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 3 Sequence analysis of bacterial DGGE bands

2.2 真菌演替規(guī)律分析

2.2.1 真菌DGGE圖譜分析

圖3 展示3 個(gè)堆肥處理真菌DGGE 條帶分布，本研究檢測(cè)到土著真菌（對(duì)照組檢測(cè)到條帶）有條帶 1、2、4、5、7、9、10、11、12、13、14、15和17。與對(duì)照組相比，接種組土著真菌條帶10、14和15消失，而新檢測(cè)到條帶6、8和16，說(shuō)明接種AAMC（細(xì)菌）也對(duì)堆肥真菌群落演替產(chǎn)生影響，這種影響包括促使某些土著真菌消亡和激發(fā)新真菌種類(lèi)產(chǎn)生。與接種組類(lèi)似，加堿組土著真菌條帶14、15和17消失，而新檢測(cè)到條帶3、8、16和18，說(shuō)明添加化學(xué)緩沖劑也對(duì)真菌躍遷產(chǎn)生影響。與其他兩處理相比，在升溫期接種組真菌種類(lèi)明顯降低，而其細(xì)菌多樣性明顯升高（見(jiàn)圖1 和3），原因是細(xì)菌多樣性提高對(duì)真菌群落生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生抑制作用。

2.2.2 真菌群落多樣性分析

由圖4可知，在堆肥過(guò)程中，對(duì)照組H'變化不明顯；加堿組H'顯著下降；接種組H'先升后降。一般來(lái)說(shuō)，由于高溫對(duì)微生物篩選作用，在高溫期堆肥微生物多樣性降低，進(jìn)入腐熟期后隨堆溫降低，多樣性回升[5]。對(duì)照組H'平穩(wěn)變化趨勢(shì)與其堆肥過(guò)程中較低堆溫對(duì)真菌篩選作用微弱有關(guān)。接種組H'變化趨勢(shì)與上述規(guī)律不一致，原因是AAMC 接種激發(fā)3 個(gè)DGGE 條帶均分布在高溫期，對(duì)高溫有較強(qiáng)抵抗力（見(jiàn)2.2.3）。D在3個(gè)處理中變化趨勢(shì)與H'完全相反，說(shuō)明D結(jié)果佐證H'分析結(jié)果良好。

2.2.3 真菌優(yōu)勢(shì)群落分析

圖3中18種DGGE條帶被成功測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)表4。本研究前期結(jié)果顯示Saccharomyces（條帶1和8）和Candida（條帶3 和7）是乙酸和丙酸降解關(guān)鍵真菌[3]。升溫期，對(duì)照組并未檢測(cè)到此4 種條帶，而接種組檢測(cè)到條帶7和8，加堿組檢測(cè)到條帶1、3、7 和8，原因可能是接種AAMC 和添加化學(xué)緩沖劑能克服和有效避免初期酸化抑制。接種組新激發(fā)產(chǎn)生條帶6、8 和16，分別屬于Melanocarpus、Sac?charomyces和Aspergillus，前期研究顯示Melanocar?pus能分泌漆酶，主要作用于木質(zhì)素降解，Saccha?romyces與乙酸和丙酸代謝緊密相關(guān)（前述內(nèi)容已有分析），Aspergillus主要作為用于纖維素降解[3]。條帶6在接種組高溫和腐熟期為優(yōu)勢(shì)菌，在其他兩處理均未檢測(cè)到，由于在堆肥過(guò)程中木質(zhì)素降解與腐殖質(zhì)合成緊密相關(guān)，推測(cè)接種組高溫期和腐熟期Melanocarpus存在與其較高腐殖質(zhì)含量和腐殖化程度有關(guān)。條帶16 在接種組和加堿組高溫期為優(yōu)勢(shì)菌，說(shuō)明這兩個(gè)處理在高溫期纖維素降解即活躍，揭示接種和加堿組加速堆肥進(jìn)程。

表4 真菌DGGE條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 4 Sequence analysis of fungal DGGE bands

此外，還檢測(cè)到Eremothecium cymbalariae（條帶2）、Galactomyces geotrichum（條帶5）、Neurospo?ra（條帶 4、12 和 18）、Schizosaccharomyces pombe（條帶10）、Thermomyces lanuginosus（條帶11）、De?baryomyces（條帶 9）、Paracoccidioides（條帶 14）、Yarrowia lipolytica（條帶13）和未培養(yǎng)真菌（條帶15和17）。Leeuw 等報(bào)道Eremothecium是重要植物病原菌[25]，本研究在加堿和對(duì)照組高溫期及接種組腐熟期均檢測(cè)到此種真菌。Galactomyces geotrichum可降解甲基紅等染料，常用于紡織和造紙等行業(yè)染料劑處理[26]。Galactomyces geotrichum在 3 個(gè)堆肥處理均為優(yōu)勢(shì)菌，可視為餐廚垃圾堆肥土著真菌。Lin 等報(bào)道Neurospora可分泌胞外脂肪酶，在餐廚垃圾富含油脂降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[27]。本研究除條帶18僅在加堿組高溫期檢測(cè)到外，條帶4和12 在3 個(gè)處理堆肥過(guò)程中均分布。Thermomyces lanuginosus為耐熱真菌，在木聚糖（半纖維素成分）降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。本研究在3 個(gè)堆肥處理升溫期和接種組高溫期均檢測(cè)到Thermomy?ces lanuginosus。Debaryomycessp.具 有 較 強(qiáng) 耐 鹽性，在木糖發(fā)酵產(chǎn)木糖醇過(guò)程中有大量應(yīng)用[29]。這種耐鹽真菌在3 個(gè)堆肥處理堆肥周期均為優(yōu)勢(shì)菌，與餐廚垃圾物料含鹽量較高有關(guān)。Yarrowia lipolyti?ca可分泌胞外脂肪酶，主要作用于油脂類(lèi)降解[30]。條帶13 在加堿和對(duì)照組升溫期及接種組腐熟期均為優(yōu)勢(shì)菌。

2.3 放線(xiàn)菌演替規(guī)律分析

2.3.1 放線(xiàn)菌DGGE圖譜分析

圖5 展示3 個(gè)堆肥處理放線(xiàn)菌DGGE 條帶分布，本研究檢測(cè)到土著放線(xiàn)菌（對(duì)照組檢測(cè)到條帶）有條帶1、2、3、7、8、9、12、14、15、21、22、23、25、27、28、31、34 和35。與對(duì)照組相比，除條帶9、23、31 和34 外，其他土著真菌條帶在接種組中全部消失，而新檢測(cè)到11 個(gè)放線(xiàn)菌條帶（條帶 5、10、13、19、20、24、26、29、30、32和33），這些現(xiàn)象說(shuō)明接種AAMC（細(xì)菌）對(duì)放線(xiàn)菌群落躍遷產(chǎn)生顯著影響，這種影響包括促使某些土著放線(xiàn)菌消亡和激發(fā)新放線(xiàn)菌種類(lèi)產(chǎn)生。與加堿組類(lèi)似，除條帶9、21、23、31 和34外，其他土著真菌條帶在加堿組中全部消失，而新檢測(cè)到條帶 4、6、11、16、17、18、24、26、32 和33，說(shuō)明添加化學(xué)緩沖劑也對(duì)放線(xiàn)菌群落演替產(chǎn)生顯著影響。在升溫期加堿組放線(xiàn)菌種類(lèi)明顯低于接種和對(duì)照組，而在高溫期放線(xiàn)菌種類(lèi)相比升溫期大幅增多，此時(shí)放線(xiàn)菌種類(lèi)多于接種和對(duì)照組，說(shuō)明雖放線(xiàn)菌類(lèi)最適生長(zhǎng)pH呈堿性，但在投加化學(xué)緩沖劑后較短時(shí)間內(nèi)，餐廚垃圾堆肥體系pH突然升高并未促進(jìn)放線(xiàn)菌類(lèi)生長(zhǎng)，對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用，這種抑制作用隨堆肥進(jìn)程轉(zhuǎn)成促進(jìn)作用。

2.3.2 放線(xiàn)菌群落多樣性分析

由圖6可知，接種組H'變化平穩(wěn)，而加堿和對(duì)照組H'均呈先升后降變化趨勢(shì)，與Tran等[5]研究結(jié)論不一致，原因是接種和加堿組由于人為調(diào)控添加微生物菌系和化學(xué)緩沖劑打破堆肥過(guò)程放線(xiàn)菌演替一般規(guī)律，可一定程度削弱溫度對(duì)放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)躍遷影響，而這種削弱作用在加堿組更明顯，與放線(xiàn)菌最適生長(zhǎng)pH 呈堿性有關(guān)。對(duì)照組溫度較低，無(wú)明顯高溫對(duì)放線(xiàn)菌群落組成篩選作用。在升溫期，加堿組H'（1.38）明顯低于接種（2.07）和對(duì)照組（2.15），而在高溫期H'有一個(gè)顯著升高（2.63），這與前述結(jié)果一致。D在3 個(gè)處理中變化趨勢(shì)與H'完全相反，說(shuō)明D結(jié)果佐證H'分析結(jié)果良好。

2.3.3 放線(xiàn)菌優(yōu)勢(shì)群落分析

優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 放線(xiàn)菌DGGE條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 5 Sequence analysis of actinobacterial DGGE bands

35 個(gè)條帶被成功測(cè)序。本研究前期結(jié)果顯示，Corynebacterium（條帶29）、Mycobacterium（條帶5和20）和Rhodococcus（條帶10、32和34）是乙酸和丙酸降解關(guān)鍵放線(xiàn)菌[3]。升溫期，不同處理檢測(cè)到上述條帶數(shù)分別為接種組4個(gè)、加堿組2個(gè)、對(duì)照組1個(gè)，說(shuō)明接種AAMC（細(xì)菌）提高乙酸和丙酸降解放線(xiàn)菌種類(lèi)，有效避免堆肥初期酸化抑制問(wèn)題。本研究檢測(cè)到多種Acidothermus（條帶16、17、26 和28）和Streptomyces（條帶7、9、21、27 和31）放線(xiàn)菌種類(lèi)，Mohagheghi等報(bào)道Acidothermus是嗜熱、嗜酸放線(xiàn)菌，具有降解纖維素能力[31]。加堿組高溫期檢測(cè)到條帶16、17 和26，接種組升溫期檢測(cè)到條帶26，對(duì)照組高溫期檢測(cè)到條帶28。Streptomyces有效降解木質(zhì)纖維素[32]，在對(duì)照組檢測(cè)到5 個(gè)Streptomyces種類(lèi)，加堿組和接種組分別檢測(cè)到3 個(gè)和2 個(gè)Streptomyces種類(lèi)。由上述結(jié)果可知，接種AAMC 或添加化學(xué)緩沖劑并未顯著提高纖維素或木質(zhì)纖維素降解放線(xiàn)菌種類(lèi)。

此外，在本研究餐廚垃圾堆肥過(guò)程中檢測(cè)到Frankia（條帶 1、4 和 8）、Nocardioides（條帶 2 和30）、Saccharomonospora（條帶24 和33）、Salinispo?ra（條 帶 12 和 35）、Thermomonospora（條 帶 6 和11）、Arthrobacter humicola（條帶 14）、Geoderma?tophilus arenarius（條帶 3）、Kocuria（條帶 19）、Leif?sonia bigeumensis（條帶 18）、Micrococcus（條帶 13）、Tropheryma whippelii（條帶15）和3 種未培養(yǎng)放線(xiàn)菌種類(lèi)（條帶22、23 和25）。Yin 等報(bào)道Frankia放線(xiàn)菌具有固氮作用，對(duì)照組檢測(cè)到兩種Frankia放線(xiàn)菌，加堿組檢測(cè)到1 種，而接種組未檢測(cè)到[33]。Webb 等報(bào)道Saccharomonospora有降解農(nóng)藥五氯苯酚能力，所有堆肥處理均檢測(cè)到2 種Saccharo?monospora放線(xiàn)菌[34]。Salinispora產(chǎn)生抗生素，僅在對(duì)照組檢測(cè)到2種Salinispora放線(xiàn)菌[35]。Sakon 等報(bào)道Thermomonospora分泌內(nèi)切和外切纖維素酶[36]，本研究?jī)H在加堿組高溫期檢測(cè)到2種Thermomonos?pora放線(xiàn)菌種類(lèi)。

3 結(jié) 論

a.AAMC中7種主要細(xì)菌在接種組中均為優(yōu)勢(shì)條帶，說(shuō)明AAMC 在接種組定殖狀況良好，適應(yīng)餐廚垃圾堆肥環(huán)境良好。

b.乙酸和丙酸降解關(guān)鍵微生物：接種組共檢測(cè)到7 個(gè)細(xì)菌種類(lèi)，2 個(gè)真菌種類(lèi)和4 個(gè)放線(xiàn)菌種類(lèi)，顯著高于加堿（細(xì)菌：4個(gè)，真菌：4個(gè)，放線(xiàn)菌：2個(gè)）和對(duì)照組（細(xì)菌：4個(gè)，真菌：0個(gè)，放線(xiàn)菌：1 個(gè)），說(shuō)明接種AAMC 可激發(fā)乙酸和丙酸降解關(guān)鍵微生物產(chǎn)生。

c.接種AAMC激發(fā)木質(zhì)素降解細(xì)菌和真菌種類(lèi)產(chǎn)生，但并未顯著提高木質(zhì)纖維素降解放線(xiàn)菌種類(lèi)；接種AAMC 顯著增加堆肥過(guò)程細(xì)菌多樣性，對(duì)真菌和放線(xiàn)菌多樣性影響不明顯，但均顯著改變3個(gè)類(lèi)群群落結(jié)構(gòu)躍遷規(guī)律，包括激發(fā)新微生物種類(lèi)產(chǎn)生并促進(jìn)某些土著微生物消亡。添加化學(xué)緩沖劑顯著改變土著微生物演替規(guī)律。