造血干細(xì)胞移植后的早期免疫重建

朱明霞，萬文麗，李海申，王　晶，王艷芳，胡　凱，克曉燕

(北京大學(xué)第三醫(yī)院血液科，北京　100191)

·論著·

造血干細(xì)胞移植后的早期免疫重建

朱明霞，萬文麗，李海申，王晶，王艷芳，胡凱，克曉燕△

(北京大學(xué)第三醫(yī)院血液科，北京100191)

[摘要]目的：探討異基因造血干細(xì)胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)和自體造血干細(xì)胞移植(autologous HSCT，auto-HSCT)患者早期免疫重建的異同。方法：收集2011年12月至2014年8月在北京大學(xué)第三醫(yī)院血液科進(jìn)行HSCT的惡性血液病患者31例，其中15例allo-HSCT，16例auto-HSCT；留取20名健康人外周血標(biāo)本作為健康對照。采用四色流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組患者移植后1年內(nèi)外周血中淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，并通過檢測T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(T cell receptor rearrangement excision circle，TREC)水平判斷初始 T細(xì)胞功能。結(jié)果：移植后12個(gè)月內(nèi)allo-HSCT組和auto-HSCT組患者CD4+T細(xì)胞、CD8初始T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞、CD4中樞記憶性T細(xì)胞、中期活化性T細(xì)胞以及DC重建與健康對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞迅速恢復(fù)正常水平。移植后前3個(gè)月內(nèi)B細(xì)胞重建在兩組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均顯著低于健康對照組(P<0.01)，但從第6個(gè)月起auto-HSCT組顯著快于allo-HSCT組患者(P<0.05)；移植后第6個(gè)月起allo-HSCT組晚期活化性T細(xì)胞表達(dá)顯著高于auto-HSCT組(P<0.05)，而auto-HSCT組CD4初始T細(xì)胞和CD8中樞記憶性T細(xì)胞的表達(dá)高于allo-HSCT組(P<0.05)。移植后12個(gè)月內(nèi)allo-HSCT和auto-HSCT組患者外周血CD3+T細(xì)胞中TREC水平顯著低于年齡相近的健康對照組(P<0.05)，allo-HSCT組患者外周血CD3+T細(xì)胞中的TREC水平稍高于auto-HSCT組患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：allo-HSCT和auto-HSCT患者早期免疫重建的速度和特點(diǎn)很相似，移植患者免疫重建主要不是由異源性移植物所決定，可能與胸腺功能受損后T細(xì)胞分化緩慢密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]造血干細(xì)胞移植；自體移植；異基因移植；淋巴細(xì)胞亞群；免疫重建

造血干細(xì)胞移植(hematopoieticstemcelltransplantations，HSCT)是治療惡性血液病有效的手段，雖然存在患者疾病類型、移植前的一般狀況以及預(yù)處理方案的千差萬別，但都會去除或者至少強(qiáng)烈抑制受者造血系統(tǒng)，提供移植物植入的空間而避免出現(xiàn)移植物的排斥。HSCT后免疫功能缺陷是影響臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素，異基因HSCT(allogenicHSCT，allo-HSCT)和自體HSCT(autologousHSCT，auto-HSCT)后都會出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫缺陷，很大程度上是由于胸腺功能的降低甚至消失，由于兩者在移植物來源、預(yù)處理方案以及移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)的預(yù)防方案上均不相同，移植后免疫重建理論上也應(yīng)該存在差異。本研究擬通過觀察allo-HSCT和auto-HSCT后患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，比較兩者的免疫重建規(guī)律，并通過檢測T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(Tcellreceptorrearrangementexcisioncircles，TREC)水平評估初始T細(xì)胞功能，從而探討患者HSCT后促進(jìn)細(xì)胞免疫重建的機(jī)制，為加速免疫重建提供新策略。

1資料與方法

1.1研究對象

2011年12月至2014年8月在北京大學(xué)第三醫(yī)院血液科進(jìn)行HSCT的惡性血液病患者31例，其中15例allo-HSCT，16例auto-HSCT，所有患者均接受粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)動(dòng)員后的外周造血干細(xì)胞，患者主要臨床特征見表1。同時(shí)留取北京大學(xué)第三醫(yī)院體檢中心20名健康人外周血標(biāo)本作為健康對照(healthycontrols，HC)，均獲得知情同意。

1.2樣本采集

分別無菌抽取移植前和移植后1、3、6、9和12個(gè)月各組患者外周靜脈血4mL，置于肝素抗凝管中，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3淋巴細(xì)胞亞群檢測

采用四色流式細(xì)胞術(shù)(FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群，所用單克隆抗體和絕對計(jì)數(shù)TruCount管均為美國BD公司產(chǎn)品。以淋巴細(xì)胞絕對數(shù)判斷患者HSCT后淋巴細(xì)胞亞群重建是評估患者總體生存率和無進(jìn)展生存率的正性獨(dú)立預(yù)后因素[1]。采用以下抗體組合檢測淋巴細(xì)胞亞群、T細(xì)胞亞群以及樹突細(xì)胞(dendriticcell，DC)：(1)T細(xì)胞：FITC-CD3/PE-CD8/PerCP-CD45/APC-CD4；(2)B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NK)：FITC-CD3/PE-CD16CD56/PerCP-CD45/APC-CD19；(3)活化性T細(xì)胞：FITC-CD3/PE-HLA-DR/PerCP-CD45/APC-CD25，以CD3+CD25+為中期活化性T細(xì)胞，以CD3+HLA-DR+為晚期活化T細(xì)胞；(4)初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞：FITC-CD45RA/PE-CD62L/PerCP-CD3/APC-CD8，以CD45RA+CD62Lhigh為初始T細(xì)胞，以CD45RA-CD62Lhigh為中樞記憶性T細(xì)胞，以CD45RA+CD62Llow為效應(yīng)記憶性T細(xì)胞；(5)DC細(xì)胞：FITC-Lin1/PE-CD123/PerCP-HLA-DR/APC-CD11c，以CD11c+HLA-DR+Lin1-細(xì)胞為髓樣DC(mDC)，以CD123+CD11c-HLA-DR+Lin1-細(xì)胞為漿樣DC(pDC)。以不同熒光標(biāo)記的小鼠來源單克隆抗體為同型對照，將CD3+CD4+<400/μL、CD3+CD8+<200/μL、CD19+<100/μL、CD16+CD56+CD3-<100/μL定義為淋巴細(xì)胞減少。各取100μL抗凝靜脈血放入樣品測定管，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合，振蕩混勻后室溫避光孵育20min，溶血、洗滌、上機(jī)檢測，采用CellQuestPro軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4TREC水平檢測

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測環(huán)形TREC(signal-jointTREC，sjTREC)水平。應(yīng)用WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega公司產(chǎn)品)提取患者及健康對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度。目的基因TREC引物及探針核苷酸序列如下：T1下游引物5′-CACATCCCTTTCAACCATGCT-3′；T2上游引物 5′-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG-3′；探針T3 5′-6FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-TAMRA，內(nèi)參基因ALB(albumin)引物和探針核苷酸序列如下：A1上游引物5′-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3′，A2下游引物5′-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3′；探針A3 5′-6FAM-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-TAMRA。采用基因合成法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品(引物序列、標(biāo)準(zhǔn)品均由大連寶生物公司合成)。探針法定量PCR試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品，總反應(yīng)體積為25μL，在95 ℃預(yù)變性10min后，95 ℃ 30s和64 ℃ 1min，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國PE公司產(chǎn)品)中進(jìn)行，采用ABI7500軟件分析數(shù)據(jù)。根據(jù)檢測樣本中內(nèi)參基因ALB的實(shí)測拷貝數(shù)來確定檢測樣本中所含的細(xì)胞數(shù)(每個(gè)細(xì)胞含2個(gè)ALB拷貝)，計(jì)算公式：n=2×105×(TREC均值)/(ALB均值)，結(jié)果以每105個(gè)PBMC中所含的TREC拷貝數(shù)表示，并根據(jù)CD3+T細(xì)胞的陽性率計(jì)算每105個(gè)CD3+細(xì)胞中的TREC含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1患者的臨床特征

如表1所示，allo-HSCT組受者年齡低于auto-HSCT組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，兩組患者性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.27)。急性白血病和骨髓增生異常綜合征患者多進(jìn)行allo-HSCT，auto-HSCT常見于淋巴瘤和骨髓瘤患者。兩組患者均接受經(jīng)重組人G-CSF動(dòng)員的外周血造血干細(xì)胞移植，其中allo-HSCT組3例患者同時(shí)輸注1份臍血造血干細(xì)胞；allo-HSCT組同胞全相合供者6例，親緣單倍體供者8例，無關(guān)供者1例。allo-HSCT組患者預(yù)處理按清髓性和非清髓性兩種方案進(jìn)行，單倍體相合移植采用非體外去除T細(xì)胞[加用兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白(rabbitanti-humanthymocyteglobulin，ATG)]；auto-HSCT組預(yù)處理分為全身放射治療(totalbodyirradiation，TBI)和不含全身放射治療(no-totalbodyirradiation，NTBI)兩種方案，TBI同時(shí)聯(lián)合環(huán)磷酰胺、馬法蘭和依托泊苷，NTBI聯(lián)合BEAM(BCNU，etoposide，aracytine，melphalan)方案或環(huán)磷酰胺、馬法蘭和依托泊苷方案。

兩組患者移植后發(fā)生總體感染事件(包括病毒、細(xì)菌和真菌感染)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(多出現(xiàn)于移植后3個(gè)月內(nèi))，allo-HSCT組患者顯著高于auto-HSCT組[8/15(allo-HSCT組)vs. 4/16(auto-HSCT組)， P=0.04]，細(xì)菌感染均以肺部感染常見，allo-HSCT組肺部感染發(fā)生率顯著高于auto-HSCT組[5/15 vs. 2/16，P=0.02]；兩組均出現(xiàn)2例真菌感染，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.99)；allo-HSCT組患者發(fā)生巨細(xì)胞病毒感染常見(10/15)，于移植后3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)。移植后2個(gè)月內(nèi)allo-HSCT組大部分患者發(fā)生急性GVHD(11/15)，1例移植1年后出現(xiàn)慢性GVHD，均用甲潑尼龍治療。allo-HSCT組2例患者由于GVHD導(dǎo)致多器官功能衰竭死亡，1例重癥感染致呼吸衰竭死亡，1例疾病復(fù)發(fā)死亡；auto-HSCT組1例患者疾病復(fù)發(fā)死亡，1例死于其他疾病。移植后1年總生存率auto-HSCT組稍高于allo-HSCT組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14/16 vs. 11/15，P=0.56]。

2.2移植后外周血淋巴細(xì)胞亞群的重建規(guī)律

移植后12個(gè)月內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞重建在allo-HSCT和auto-HSCT兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)持續(xù)減少，均顯著低于健康對照組(P<0.01，圖1A)；CD8+T細(xì)胞比CD4+T細(xì)胞重建早得多，兩組患者移植后3個(gè)月時(shí)均恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1B)。移植后12個(gè)月內(nèi)NK細(xì)胞重建在兩組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，也在移植后3個(gè)月時(shí)恢復(fù)正常水平(P>0.05，圖1C)。移植后前3個(gè)月內(nèi)B細(xì)胞重建在兩組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均顯著低于健康對照組(P<0.01)；allo-HSCT組移植后1年內(nèi)B細(xì)胞持續(xù)性減低，未恢復(fù)至正常水平，而auto-HSCT組于移植后第6個(gè)月時(shí)B細(xì)胞重建恢復(fù)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1D)。

2.3移植后外周血T細(xì)胞亞群的重建規(guī)律

如圖2所示，移植后12個(gè)月內(nèi)allo-HSCT和auto-HSCT兩組中期活化性T細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對照組(P<0.05，圖2A)，兩組患者晚期活化性T細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康對照組(P<0.05，圖2B)，兩組間中期活化性T細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但晚期活化性T細(xì)胞數(shù)量從移植后第6個(gè)月起allo-HSCT組顯著高于auto-HSCT組(P<0.05)。移植后12個(gè)月內(nèi)兩組患者CD4和CD8初始T細(xì)胞數(shù)量均顯著低于健康對照組(P<0.01，圖2C和2F)，CD4初始T細(xì)胞重建從移植后第6個(gè)月起allo-HSCT組低于auto-HSCT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組患者CD8初始T細(xì)胞重建差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植后12個(gè)月內(nèi)兩組患者CD4效應(yīng)記憶性T細(xì)胞數(shù)量均顯著高于健康對照組(P<0.05，圖2D)，CD4中樞記憶性T細(xì)胞數(shù)量均處于正常水平(圖2E)，而CD8效應(yīng)記憶性T細(xì)胞和中樞記憶性T細(xì)胞重建均從移植后第3個(gè)月起恢復(fù)至正常水平(圖2G和2H)，兩組間除CD8中樞記憶性T細(xì)胞數(shù)量auto-HSCT組高于allo-HSCT組外(P<0.05)，其他記憶性T細(xì)胞重建差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　31例造血干細(xì)胞移植患者臨床特征

Allo-HSCT,allogenichematopoieticstemcelltransplantation;auto-HSCT,autologoushematopoieticstemcelltransplantation;PSC,peripheralstemcells;UCB,umbilicalcordblood;TBI,totalbodyirradiation;mBuCy,modifiedbusulfancyclophosphamide;BuFlu,busulfanfludarabine;Ara-c,aracytine;CTX,cyclophosphamide;Flu,fludarabine;ATG,anti-thymocyteglobulin;BEAM,carmustine,etoposide,aracytineandmelphalan;CsA+MMF+MTX,cyclosporineA,mycopenolatemofetil,andmethotrexate;MP,methylprednisolone;aGVHD,graft-versus-hostdisease;CMV,cytomegalovirus.a,studentttest;b,Fisherexacttest.

Pre-HSCT was the point before transplantation. M1, M3, M6, M9 and M12 were from one month to 12 months, post-transplantation. Absolute numbers of T cells, NK cells and B cells of allo- and auto-HSCT patients from one month to 12 months post-transplantation were determined by flow cytometry using TruCount tubes. The 25% and 75% percentiles in heathy control correspond to the lower and to the upper limit of the gray area. The significance of the differences between the two groups of the patients (allo- and auto-HSCT patients) and between each group of patients and heathy controls are detailed in the figure or below the figure, respectively.圖1　異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT )和自體造血干細(xì)胞移植(auto-HSCT )后外周血淋巴細(xì)胞亞群的重建特點(diǎn)比較Figure 1　Reconstitution of peripheral blood lymphocytes in allo- and auto-HSCT recipients

2.4移植后外周血DC的重建規(guī)律

移植后12個(gè)月內(nèi)髓樣DC重建在allo-HSCT和auto-HSCT兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，移植后早期顯著低于健康對照組(P<0.01)，從第3個(gè)月時(shí)起恢復(fù)至正常水平(圖3A)；移植后漿樣DC重建要晚于髓樣DC，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯著低于健康對照組(P<0.01)，直至1年左右逐漸恢復(fù)正常(圖3B)。

2.5移植后外周血TREC水平的變化

如圖4所示，與年齡相近的健康對照相比，allo-HSCT和auto-HSCT組外周血PBMC的TREC水平在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。兩組患者CD3+T細(xì)胞的TREC水平均顯著低于健康對照組(P<0.01)，雖然allo-HSCT組患者外周血CD3+細(xì)胞中的TREC水平稍高于auto-HSCT組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

HSCT后免疫重建嚴(yán)重遲緩，細(xì)胞免疫功能持續(xù)低下，導(dǎo)致感染和疾病復(fù)發(fā)，成為HSCT后主要死亡原因，移植后免疫重建已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。HSCT后免疫重建包括固有免疫重建和獲得性免疫重建，參與固有免疫重建的NK細(xì)胞和DC迅速重建，但以T細(xì)胞亞群和功能性B細(xì)胞為主的獲得性免疫重建是個(gè)漫長而分步進(jìn)行的過程。異基因移植后免疫重建受異源性抗原驅(qū)使或細(xì)胞因子刺激導(dǎo)致T細(xì)胞克隆過度增殖，即使供受者人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA)全相合也會發(fā)生GVHD，自體移植后的免疫重建反而完全不受異源性抗原和GVHD所影響。本研究中我們比較allo-HSCT和auto-HSCT后免疫重建的差異，發(fā)現(xiàn)兩組患者移植后1年內(nèi)外周血各免疫細(xì)胞重建速度和數(shù)量非常相似。從臨床特征分析，患者年齡和疾病種類是選擇移植方式的重要因素，allo-HSCT組患者年齡顯著低于auto-HSCT組；預(yù)處理化療中采用的藥物有不同程度的毒性，如ATG和氟達(dá)拉濱為強(qiáng)效免疫抑制劑，具有較大的毒性，是影響移植后造血重建、免疫重建、感染以及發(fā)生GVHD的因素。本研究中allo-HSCT組患者移植后總體感染率高于auto-HSCT組，與預(yù)處理和發(fā)生GVHD密切相關(guān)，但是總體生存率兩組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A,middle activated T cells; B, late activated T cells; C, CD4 na?ve T cells; D, CD4 effector memory T cells; E, CD4 central memory T cells; F, CD8 na?ve T cells; G, CD8 effector memory T cells; H, CD8 central memory T cells. Flow cytometry analyses were performed on fresh blood from allo- and auto-HSCT patients from one month to 12 months post-transplantation. Other figure legend and the significance of the gray area as shown in Figure 1.圖2　異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT )和自體造血干細(xì)胞移植(auto-HSCT )后外周血T細(xì)胞亞群的重建特點(diǎn)比較Figure 2　Reconstitution of peripheral blood T cell subsets after allo- and auto-HSCT

Flow cytometry analyses were performed on fresh blood from allo- and auto-HSCT patients from one month to 12 months post-transplantation.Other figure legend and the significance of the gray area as shown in Figure 1.圖3　異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT )和自體造血干細(xì)胞移植(auto-HSCT)后樹突細(xì)胞(DC)的重建特點(diǎn)比較Figure 3　Reconstitution of peripheral blood dendritic cells after allo- and auto-HSCT

From the average TREC content, as measured per microgram DNA, TREC content per 105 cells was calculated considering that 1 g DNA corresponds to 150 000 cells. The TREC/105cells were corrected by the percentage of CD3+ cells found by flow cytometry yielding the number of TREC/105CD3. The median values are shown as dots (circles or triangles) and the ends of the whiskers correspond to the 25% and 75% percentile values.Other figure legend and the significance of the gray area as shown in Figure 1.圖4　異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT )和自體造血干細(xì)胞移植(auto-HSCT )后外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(TREC)水平的比較Figure 4　Quantification of TRECs from peripheral blood mononuclears after allo- and auto-HSCT

3.1T細(xì)胞及T細(xì)胞亞群重建

T細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，又是體液免疫的調(diào)節(jié)細(xì)胞，移植物中主要的T細(xì)胞是記憶性和分化成熟的效應(yīng)性T細(xì)胞，而未分化成熟的T細(xì)胞數(shù)量相對較少。移植后T細(xì)胞免疫重建主要有兩條途徑：(1)外周途徑：移植物中T細(xì)胞在外周免疫器官內(nèi)快速擴(kuò)增，此種方式不依賴于胸腺功能；(2)胸腺依賴途徑：T淋巴祖細(xì)胞遷徙至胸腺，在胸腺表皮細(xì)胞和DC等作用下，經(jīng)過陽性和陰性選擇，發(fā)育為初始T細(xì)胞，形成穩(wěn)定持久的免疫重建。既往研究顯示，成人auto-HSCT患者CD4+和CD8+T細(xì)胞重建早于allo-HSCT組患者[2]，而兒童auto-HSCT患者CD4+T細(xì)胞重建要遲于allo-HSCT組[3]，這是由于兒童的胸腺輸出功能比成人更持久。本研究中CD4+和CD8+T細(xì)胞重建在兩組間無差異，CD4+T細(xì)胞均持續(xù)性減少，CD8+T細(xì)胞很快恢復(fù)重建，與國內(nèi)眾多研究結(jié)果相似[4-5]。

HSCT后早期淋巴細(xì)胞減少，移植早期T細(xì)胞主要來自細(xì)胞因子依賴的外周血成熟T細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增，這些成熟T細(xì)胞主要來自供者外周血干細(xì)胞中的T細(xì)胞和經(jīng)過大劑量預(yù)處理后患者體內(nèi)存留的成熟T細(xì)胞[6]，主要是記憶性T細(xì)胞，與初始T細(xì)胞相比，其對外來抗原更易產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答。由于大部分allo-HSCT采用含ATG非體外T細(xì)胞去除的預(yù)處理方案，初始T細(xì)胞減少，因而以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效應(yīng)下降，GVHD發(fā)生率增加。HSCT后CD4+T細(xì)胞早期重建與效應(yīng)記憶性T細(xì)胞恢復(fù)以及較少初始T細(xì)胞的外周穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增有關(guān)，本研究中兩組患者移植后初始T細(xì)胞持續(xù)性低下，效應(yīng)記憶性T細(xì)胞表達(dá)高于健康對照，故CD4+T細(xì)胞重建嚴(yán)重遲緩，可見CD4+T細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞重建更依賴于胸腺的功能。因?yàn)門細(xì)胞活化水平受感染、GVHD發(fā)生和T細(xì)胞庫外周穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增等因素影響[4]，本研究對allo-HSCT和auto-HSCT兩組活化T細(xì)胞的數(shù)量分析后發(fā)現(xiàn),移植后中期活化T細(xì)胞重建無差異，移植后第6個(gè)月起allo-HSCT組晚期活化T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于auto-HSCT組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-8]。

3.2NK、DC及B細(xì)胞重建

NK細(xì)胞是HSCT后最早恢復(fù)的淋巴細(xì)胞亞群[9]，本研究兩組患者移植后3個(gè)月時(shí)均恢復(fù)重建，且兩組患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，移植1年后生存率亦未見明顯差異。有研究認(rèn)為HSCT后早期NK細(xì)胞重建與疾病無進(jìn)展生存率相關(guān)，HSCT后1個(gè)月時(shí)NK細(xì)胞數(shù)較高患者無進(jìn)展生存率顯著高于NK細(xì)胞減少患者[10]。與NK細(xì)胞不同，DC重建延遲[11]，本研究結(jié)果顯示兩組間DC重建差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究表明pDC與GVHD發(fā)生密切相關(guān)，移植后漿樣DC數(shù)目越高GVHD發(fā)生率越低[12-13]，GVHD可能阻止了pDC的成熟[14]。本研究中allo-HSCT組發(fā)生GVHD的患者pDC低于未發(fā)生GVHD的患者，但由于病例數(shù)太少未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B細(xì)胞分化成熟需要CD4+T細(xì)胞的輔助，移植后B細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)緩慢，其多態(tài)性表達(dá)與CD4依賴性抗體反應(yīng)長期不能恢復(fù)有關(guān)。由于移植后缺乏CD4+T細(xì)胞，同時(shí)內(nèi)環(huán)境缺陷，即使有供者CD4細(xì)胞，成熟B細(xì)胞的體細(xì)胞突變率也降低，導(dǎo)致B細(xì)胞功能下降。本研究中移植后第6個(gè)月起auto-HSCT組患者功能性B細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)要快于allo-HSCT組患者，而且移植后發(fā)生GVHD的患者B細(xì)胞重建速度低于未發(fā)生GVHD的患者，可能是GVHD及其治療措施阻礙B細(xì)胞重建的結(jié)果。

3.3初始T細(xì)胞功能

HSCT后T細(xì)胞重建主要依賴于供者源T細(xì)胞在受者胸腺內(nèi)發(fā)育為初始T細(xì)胞，生成具有多樣化T細(xì)胞受體的T細(xì)胞庫，形成受者對多種抗原包括腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，所以移植后T細(xì)胞重建主要依賴于受者的胸腺功能。胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的場所，T細(xì)胞發(fā)育時(shí)TCRα基因重排過程中刪除其間的δ基因而形成一段環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，即sjTREC，其含量代表了胸腺內(nèi)新生的初始T細(xì)胞含量，可評價(jià)胸腺輸出功能，了解機(jī)體T細(xì)胞增殖潛能[15-16]。TREC水平通常是以每105個(gè)外周血PMNC中或者每微升外周血中含量來表示，本研究發(fā)現(xiàn)allo-HSCT和auto-HSCT兩組患者移植后1個(gè)月時(shí)外周血CD3+T細(xì)胞中的TREC拷貝數(shù)均明顯下降，3個(gè)月時(shí)稍有上升，6個(gè)月時(shí)進(jìn)一步下降，直至12個(gè)月時(shí)緩慢上升，提示移植早期胸腺功能尚未恢復(fù)，兩組患者初始T細(xì)胞水平持續(xù)低下，移植后早期T細(xì)胞主要來自于移植物中成熟的記憶T細(xì)胞擴(kuò)增，患者體內(nèi)TREC水平持續(xù)較低，移植后100d急性GVHD發(fā)生率較高以及6個(gè)月時(shí)出現(xiàn)細(xì)菌、病毒和(或)真菌感染明顯增加可能與患者胸腺輸出功能初始T細(xì)胞的功能較差、細(xì)胞免疫功能較低有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。由于胸腺近期輸出功能隨著年齡增加而逐漸降低[18]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然allo-HSCT組TREC水平高于auto-HSCT組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者均存在嚴(yán)重的免疫缺陷。TREC的恢復(fù)速度還受GVHD和免疫抑制劑應(yīng)用等影響，本研究中allo-HSCT組患者發(fā)生GVHD的外周血TREC水平低于未發(fā)生GVHD患者，但由于病例數(shù)太少未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這可能是GVHD損傷胸腺上皮細(xì)胞而導(dǎo)致胸腺功能低下，也可能是相關(guān)免疫激活使T細(xì)胞分化、增殖加速從而稀釋TREC的結(jié)果，有待進(jìn)一步積累病例數(shù)，結(jié)合影響T細(xì)胞免疫功能的相關(guān)因素分析，獲得更可靠的研究結(jié)果。

綜上所述，本研究中allo-HSCT和auto-HSCT兩組患者早期免疫重建特點(diǎn)差異較小，allo-HSCT后免疫重建主要不是由異源性移植物或者是否發(fā)生GVHD決定，而可能是成人T細(xì)胞庫的外周穩(wěn)態(tài)擴(kuò)增以及胸腺功能受損、免疫重建遲緩導(dǎo)致感染發(fā)生的結(jié)果，尚有待積累更多的病例數(shù)來驗(yàn)證?？傊?，應(yīng)該掌握HSCT后免疫重建規(guī)律，尋找加速免疫重建的新策略，提前干預(yù)治療，減少感染和疾病復(fù)發(fā)，從而進(jìn)一步提高患者的生存率。

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(2014-12-11收稿)

(本文編輯：趙波)

Early immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation

ZHU Ming-xia, WAN Wen-li, LI Hai-shen, WANG Jing, WANG Yan-fang, HU Kai, KE Xiao-yan△

(DepartmentofHematology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China)

ABSTRACTObjective：To search for differences in early immune reconstitution after allogenic or autologous hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods: The peripheral blood (PB) from 31 adult patients undergoing allogenic HSCT (allo-HSCT, 15 patients) or autologous HSCT (auto-HSCT, 16 patients) for the treatment of hematological malignancies and from 20 related healthy controls (HC) from December 2011 to August 2014 was used to analyze the kinetic recovery of lymphocyte subsets by means of flow cytometry during 12 months after HSCT. The T cell receptor rearrangement excision circle (TREC) levels among CD3+ T cells were measured in the patients and HC to evaluate the thymic-dependent T cell reconstitution. Results: The allo- and auto-HSCT recipients did not differ significantly in CD4+ T cells, CD8 na?ve T cells, effecter memory T cells (TEM), CD4 central memory T cells (TCM), mid-activated T cells and dendritic cells (DC)during the follow-up (P>0.05). But they both differed significantly from HC (P<0.05). CD8+ T cells and NK cells reconstructed rapidly. There was no significant difference in the numbers of B cells between the allo- and auto-HSCT groups from M1 to M3 (P>0.05). B cells in both the groups were lower than those in HC (P<0.05). The recovery of B cells in auto-HSCT group was faster than in allo-HSCT group at M6 and M12 (P<0.05). The frequencies of CD4 na?ve T cells and later activated T cells in allo-HSCT group were significantly higher than in auto-HSCT group at M6 and M12 (P<0.05). The frequencies of CD8 TCM in auto-HSCT group were significantly higher than in allo-HSCT group at M6 and M12 (P<0.05). The TREC levels were significantly lower than in both the groups compared with the age-matched HC during the follow-up (P<0.05). No significant difference was observed between allo-HSCT and auto-HSCT groups (P>0.05). Conclusion: The differences of the nature and the speed of lymphocyte reconstitution observed between the two patents groups were minor. This leads us to conclude that in allografted patients, immune recons-titution and subpopulations of peripheral blood lymphocytes are probably not related to the allogenicity of the graft, but due to the impaired thymus functions and slow differentiation of T lymphocytes in thymus.

KEY WORDSHematopoietic stem cell transplantation；Autologous transplantation; Allogenic transplantation; Lymphocyte subsets; Immune reconstitution

Corresponding author△’s e-mail, xykbysy@163.com

[中圖分類號]R392.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-167X(2016)03-0515-08

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.024

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-278：25：36網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160527.0825.008.html