下調(diào)miR-20a靶向負(fù)調(diào)控ZNF259抑制肺癌H322細(xì)胞侵襲遷移并誘導(dǎo)凋亡

李虹澤 曹鋒 章敏

(武漢市金銀潭醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430023；2外科)

近年研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生與基因的異常表達(dá)有關(guān)，這些基因參與調(diào)控肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，也是近年來分子靶向治療的研究熱點(diǎn)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移等過程〔2〕。miR-20a是一個(gè)作用十分廣泛的miRNA分子，在人類的多種組織和器官中均有表達(dá)，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程，與先兆子癇、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病進(jìn)展有關(guān)〔3，4〕。研究報(bào)道，miR-20a還參與人類腫瘤的發(fā)生，沉默miR-20a具有抵抗白血病發(fā)生的作用，miR-20a在宮頸癌中高表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)，miR-20a具有促進(jìn)前列腺癌惡性進(jìn)展的作用〔5～7〕。研究顯示，miR-20a在肺癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織，其高表達(dá)可能與肺癌的進(jìn)展有關(guān)〔8〕。目前對(duì)于miR-20a在肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探討miR-20a在肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲中的作用和機(jī)制，為靶向基因治療肺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞A549、Spc-A1、H322購(gòu)自上海歌凡生物細(xì)胞庫(kù)；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、ZNF259抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；本實(shí)驗(yàn)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-20a inhibitor、inhibitor control、miR-20a mimics、mimics control均由吉滿生物科技(上海)有限公司合成構(gòu)建；C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體、MMP-2抗體、C-Caspase-9抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；ZNF259 siRNA、siRNA control購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2Realtime PCR檢測(cè)miR-20a在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 收集正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞A549、Spc-A1、H322，按照Trziol試劑提取各細(xì)胞中的總RNA?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度及濃度后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄步驟同miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，cDNA合成條件為：16℃孵育30 min，42℃孵育30 min，80℃孵育15 min，4℃孵育10 min。使用SYBR Green進(jìn)行定量PCR，PCR條件為：95℃孵育3 min，95℃孵育12 s，58℃孵育30s，共30個(gè)循環(huán)。把U6設(shè)置為內(nèi)參，根據(jù)PCR過程中的CT值計(jì)算miR-20a水平，計(jì)算方法采用2-△△CT法。引物序列為：U6正義5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-20a正義5′-GCGAGATCTAGTTGTGCAAATCTATGC-3′，反義5′-GGCGAATTCTAACCATAGAACAGTGTTC-3′。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在肺癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor和inhibitor control，轉(zhuǎn)染試劑用Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染操作同轉(zhuǎn)染試劑說明。將轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor和inhibitor control后的細(xì)胞命名為Anti-miR-20a和Anti-NC。把沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為Control。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后1 d，按照1.2中Realtime PCR方法測(cè)定下調(diào)效果。

1.4四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)方法測(cè)定細(xì)胞增殖變化 按照Control、Anti-NC、Anti-miR-20a分組方法將肺癌細(xì)胞按照每孔100 μl的細(xì)胞懸浮液接種到96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，在細(xì)胞中添加MTT溶液(體積15 μl)，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。將孔內(nèi)的上清液體吸棄，添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床震蕩反應(yīng)10 min。以不含細(xì)胞的孔調(diào)零以后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm的OD值。

1.5流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡變化 取培養(yǎng)1 d后的Control、Anti-NC、Anti-miR-20a細(xì)胞，每組收集約106個(gè)細(xì)胞，添加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次細(xì)胞，最后用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，再依次添加PI和Annexin V-FITC染液各5 μl。在60min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲和遷移變化 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)均用Transwell小室，侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠將小室濕化，遷移實(shí)驗(yàn)不用基質(zhì)膠濕化，其余步驟相同。步驟如下：將Control、Anti-NC、Anti-miR-20a細(xì)胞懸浮在不含血清的培養(yǎng)液中，吸取200 μl添加到8 μm孔徑的Transwell小室的上室中，在下室中添加600 μl含血清細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)1 d后，用甲醇固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、MMP-2、C-Caspase-9、MMP-9蛋白表達(dá)變化 常規(guī)方法使用蛋白裂解試劑提取Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培養(yǎng)1 d)細(xì)胞總蛋白。蛋白定量方法為二喹啉甲酸(BCA)法，定量步驟同試劑盒。將蛋白同上樣緩沖液混合煮沸，添加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣孔中，每個(gè)孔按照40 μg蛋白樣品計(jì)算。SDS-PAGE用10%分離膠和5%濃縮膠。在分離膠中采用90 V電壓電泳，在濃縮膠中采用100 V電壓電泳。在90 V電壓條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到裁剪合適大小的NC膜上。NC膜經(jīng)過含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液在室溫中封閉90 min后，再與一抗反應(yīng)液(C-Caspase-3按照1∶400稀釋、C-Caspase-9按照1∶400稀釋、MMP-2按照1∶800稀釋、MMP-9按照1∶800稀釋)在室溫中孵育90 min。最后將NC膜放在1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗中，在室溫中孵育1 h。以ECL顯色，Image J分析條帶的灰度值，把β-actin作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.8miR-20a靶基因預(yù)測(cè)和鑒定 經(jīng)過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-20a與ZNF259的3′UTR端有結(jié)合位點(diǎn)，將ZNF259的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體(pmiRGLO)，同時(shí)構(gòu)建含有ZNF259的3′UTR野生型(WT)熒光素酶報(bào)告載體。把WT和MUT分別用miR-20a mimics和 mimics control共轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞中，用雙熒光素酶活性報(bào)告測(cè)定試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。用Western印跡方法檢測(cè)Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培養(yǎng)1 d)細(xì)胞中ZNF259蛋白表達(dá)變化，步驟同上。

1.9ZNF259 siRNA對(duì)下調(diào)miR-20a的肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響 將miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor、siRNA control共轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞中，命名為Anti-miR-20a+si-ZNF259、Anti-miR-20a+si-NC。按照上述步驟以MTT、流式細(xì)胞儀、Transwell小室、Western印跡檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表達(dá)變化。

1.10統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-20a在肺癌細(xì)胞中高表達(dá) 肺癌細(xì)胞A549、Spc-A1、H322中miR-20a表達(dá)水平(1.89±0.13、1.40±0.12、2.36±0.23)明顯高于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B(1.00±0.09，P<0.05)，且H322細(xì)胞中miR-20a表達(dá)水平明顯高于Spc-A1、A549(P<0.05)。miR-20a在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，選用表達(dá)水平最高的H322細(xì)胞作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-20a inhibitor下調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-20a表達(dá) Anti-miR-20a組miR-20a表達(dá)水平(0.32±0.03)明顯低于Anti-NC組(0.98±0.11，P<0.05)，Control組(1.00±0.10)與Anti-NC組、Anti-miR-20a組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.591，P=0.000)。miR-20a inhibitor下調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-20a表達(dá)水平。

2.3下調(diào)miR-20a對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白的影響 在肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡率升高，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目減少，細(xì)胞中促凋亡蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-9表達(dá)水平升高，腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

表1 各組OD值、凋亡率、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞凋亡率

圖1 Western印跡方法檢測(cè)C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.4miR-20a靶向調(diào)控ZNF259表達(dá) miR-20a與ZNF259的3′UTR端有堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖3)，且WT和miR-20a mimics共轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞熒光素酶活性(0.37±0.06)顯著低于mimics control組(1.00±0.12;t=8.133,P=0.001)。而MUT和miR-20a mimics共轉(zhuǎn)染后(0.99±0.11 vs 1.00±0.88)無明顯變化(t=0.127，P=0.905)。

圖3 miR-20a與ZNF259的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)

2.5miR-20a inhibitor促進(jìn)ZNF259表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor后的肺癌細(xì)胞中ZNF259蛋白水平(0.79±0.09)明顯高于Anti-NC組(0.47±0.6，P<0.05)。Control組(0.50±0.07)與Anti-NC組、Anti-miR-20a組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.934，P=0.003),見圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)miR-20a inhibitor對(duì)肺癌細(xì)胞中ZNF259蛋白表達(dá)的影響

2.6ZNF259 siRNA逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-20a對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor、siRNA control的肺癌細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA后的肺癌細(xì)胞增殖能力升高，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目增多，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，ZNF259蛋白水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表2，圖6。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表2 ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor共轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞OD值、凋亡率、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9、ZNF259蛋白表達(dá)的影響

圖6 Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

miR-20a是具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞如成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的調(diào)節(jié)因子，不僅與正常組織生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育有關(guān)，還參與人類疾病的發(fā)生〔9，10〕。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-20a在皮膚損傷等相關(guān)疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，對(duì)于miR-20a在腫瘤中的作用是目前研究的熱點(diǎn)〔11〕。在胃癌中證實(shí)，miR-20a具有增加胃癌細(xì)胞順鉑抵抗性的作用，miR-20a表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡發(fā)生〔12〕。miR-20a高表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔13〕。研究報(bào)道，miR-20a在肺癌組織中的陽性率明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，且其表達(dá)水平的高低與腫瘤患者臨床病理分期有關(guān)〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明下調(diào)miR-20a抑制肺癌細(xì)胞惡性表型，靶向抑制miR-20a可能是治療肺癌的有效途徑。

腫瘤細(xì)胞惡性表型與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，這些蛋白受到細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因的直接或間接調(diào)節(jié)作用〔15〕。Caspase蛋白家族是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，其受到凋亡信號(hào)影響后可以通過自我活化的方式誘導(dǎo)Caspase凋亡反應(yīng)，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔16〕。Caspase-3和Caspase-9是凋亡反應(yīng)的下游和上游因子，只有被激活形成C-Caspase-3和C-Caspase-9后才可以發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用〔17〕。MMP-9和MMP-2具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的基質(zhì)降解酶〔18〕。本研究結(jié)果說明下調(diào)miR-20a抵抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，與檢測(cè)細(xì)胞凋亡和侵襲、遷移能力結(jié)果相符合。

目前對(duì)于miRNA分子調(diào)控機(jī)制的研究顯示，miRNA分子通過靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用，且在不同組織或生理、病理過程中，同一個(gè)miRNA分子的靶向調(diào)控機(jī)制不同〔19〕。miR-20a作為一個(gè)與腫瘤有關(guān)的miRNA分子，目前在不同的腫瘤中已經(jīng)證實(shí)其具有多個(gè)靶基因，如PTEN、ABL2等〔20，21〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZNF259可能是miR-20a的靶基因，且ZNF259受到miR-20a的負(fù)調(diào)控作用。研究報(bào)道，ZNF259具有抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用，ZNF259在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用〔22〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ZNF259具有逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-20a抗肺癌細(xì)胞的作用，說明miR-20a通過靶向ZNF259調(diào)控肺癌細(xì)胞惡性表型。

綜上，miR-20a在肺癌進(jìn)展及惡性轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，其在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-20a具有抑制肺癌細(xì)胞惡性表型并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控ZNF259有關(guān)。