胭脂素聯(lián)合TRAIL對非小細胞肺癌細胞生長和轉移的抑制作用

趙海鵬 張珍珍

(1華北電力大學醫(yī)院外科，北京 102206；2濰坊市人民醫(yī)院呼吸內科)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究表明85%的患者為非小細胞肺癌，而化療是治療非小細胞肺癌的主要方法，但是化療后腫瘤緩解率為40%～50%，并且化療常伴隨部分患者出現耐藥性及全身系統(tǒng)副作用，探索治療肺癌的新策略至關重要〔1〕。胭脂素又稱胭脂樹橙、紅木素，是一種在胭脂樹紅中發(fā)現的脫輔基類胡蘿卜素，既往研究表明該藥物不僅可減少炎癥反應和氧化損傷從而預防動脈粥樣硬化，而且可通過誘導凋亡和阻滯細胞周期抑制腫瘤細胞的增殖〔2〕。因為胭脂素可通過抗增殖和誘導凋亡來抑制各種癌細胞的生長，本研究探討胭脂素和TRATL聯(lián)合用藥對非小細胞肺癌的治療作用。

1 材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)與處理 從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，USA)購買肺癌細胞系A549和H460，以及BEAS-2B的人正常肺上皮細胞。常規(guī)培養(yǎng)的所有細胞在含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)，1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco，Waltham，MA，USA)中進行培養(yǎng)。用于人類肺癌治療的胭脂素(純度> 98%，美國，Sigma)溶于DMSO中，并保存在-20℃進行后續(xù)研究，然后在DMEM培養(yǎng)基中稀釋以進行實驗治療。

1.2細胞活力分析 為了計算胭脂素、TRAIL這兩種藥物在不同細胞系中的抑制作用，將約1×103個細胞/孔種植在96孔板中。24 h后，用不同濃度的胭脂素處理癌細胞，并在37℃下孵育24 h。最終通過噻唑藍(MTT)測定法評估細胞活力。藥物分組為：A組(0 μmol/L胭脂素)、B組(40 μmol/L脂胭素)、C組(80 μmol/L胭脂素)、D組(100 ng/ml TRAIL)、E組(200 ng/ml TRAIL)、F組(40 μmol/L 胭脂素+100 ng/ml TRAIL)。

1.3成克隆實驗 用指定濃度的胭脂素和TRAIL在生長培養(yǎng)基中處理約65%的人肺癌細胞24 h。 孵育后，將細胞收集在單獨的試管中。 從每個試管中，分別在6孔板中鋪600個細胞/孔，并使其生長2 w。14 h后，將細胞用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，使用冷卻的甲醇固定細胞15 min。然后在室溫下，將細胞在25%甲醇中的0.5%結晶紫溶液(ChemCatch，美國)染色5 min。將細胞用水洗滌3次并風干以使用顯微鏡計數。

1.4劃痕實驗 先用馬克筆在6孔板背后均勻劃橫線，再將人肺癌細胞按1×105個細胞/孔種植于6孔板中，待細胞長滿后，使用槍頭垂直于背后的直線劃痕。然后用PBS洗滌以去除細胞碎片，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗。

2 結 果

2.1胭脂素增強了TRAIL誘導的人類肺癌細胞株活力的抑制 見圖1，單獨用不同濃度的TRAIL或胭脂素處理的細胞顯示出細胞附著減少和明顯的細胞收縮，這在人正常的肺上皮細胞中沒有發(fā)現。但是，TRAIL和胭脂素的聯(lián)合治療增強了這種對細胞生長的抑制作用。用TRAIL和胭脂素處理的肺癌細胞的細胞活力要比單一處理的細胞低。正常細胞BEAS-2B在用胭脂素和(或)TRAIL處理后，各組之間無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 不同藥物組對各細胞株活力的影響值)

圖1 肺癌細胞活力檢測(MTT，×40)

2.2胭脂素和TRAIL聯(lián)合抑制人肺癌細胞系中的集落形成和遷移 如圖2所示單獨用胭脂素或TRAIL處理的肺癌細胞株的集落形成水平以劑量依賴的方式明顯減弱。值得注意的是，與單一藥物治療相比，聯(lián)合治療促進了肺癌細胞克隆能力的降低(表2)。劃痕實驗表明，單獨使用TRAIL或胭脂素的治療可適度降低遷移的肺癌細胞的比例。但是聯(lián)合處理增強了這種效應(圖3，表3)。

圖2 肺癌細胞集落形成能力檢測(結晶紫染色，×40)

表2 藥物組對各細胞株集落形成的影響

圖3 肺癌細胞遷移能力檢測(×40)

表3 各細胞株遷移能力的影響

3 討 論

據報道，在全世界人類中，肺癌在所有腫瘤中的發(fā)病率最高〔3〕。本研究探討胭脂素對人肺癌進展的影響。胭脂素可用于多種疾病，如肺部損傷、血液系統(tǒng)腫瘤和腦損傷的治療〔4,5〕。然而，到目前為止，人們關于胭脂素對肺癌的影響知之甚少，尤其是與TRAIL聯(lián)合使用時。TRAIL是屬于TNF家族的成員，可以被DR4和DR5結合，激活細胞凋亡蛋白酶(Caspase)-8裂解。 Caspase-8活性對于Caspase-9表達很重要，隨后刺激Caspase-3裂解并誘導細胞凋亡，最終導致細胞死亡〔6〕。在此過程中，抗凋亡分子B細胞淋巴瘤(Bcl-2)被下調，促凋亡成員Bcl-2相關X蛋白(Bax)被上調。此外，TRAIL作為腫瘤抑制因子，已被用作通過凋亡誘導治療各種癌癥的有效藥物〔7〕。胭脂素是一種天然的類胡蘿卜素，從Bixa Orellana的種子中分離出來〔8〕。類胡蘿卜素聯(lián)蛋白(BX)可減少炎癥反應和氧化損傷。研究表明，食用胭脂素可通過減少氧化損傷，炎癥反應和血脂異常來預防動脈粥樣硬化〔9〕。胭脂素在癌癥的進展和發(fā)展中發(fā)揮抗增殖和凋亡的作用〔10〕。本研究結果表明胭脂素和TRAIL治療肺癌，特別是兩種藥物的結合，顯著下調了癌細胞的增殖和遷移，這與腫瘤轉移密切相關。