Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah對玉米蚜的效應(yīng)評價(jià)

孫丹丹， 陳 瑜， 王月琴， 王振營， 何康來

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193

1996 年轉(zhuǎn)基因玉米在美國開始商業(yè)化種植，隨后轉(zhuǎn)基因作物在全球的種植范圍迅速擴(kuò)展，轉(zhuǎn)Bt基因玉米是目前生產(chǎn)發(fā)展最快的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物之一。轉(zhuǎn)Bt基因玉米通過持續(xù)表達(dá)外源Bt蛋白，在整個(gè)生育期都可以對靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生防治效果，目前商業(yè)化應(yīng)用中，以Cry和Vip抗蟲蛋白居多(ISAAA,2018)。如歐洲唯一法定可種植抗蟲玉米是MON810，表達(dá)Cry1Ab Bt殺蟲蛋白(EFSA Panel on Genetically Modified Organisms,2010)。轉(zhuǎn)Bt基因玉米種植可區(qū)域性地降低害蟲種群密度(Dively,2018)，經(jīng)濟(jì)效益明顯，同時(shí)對非靶標(biāo)生物，尤其是昆蟲天敵及非靶標(biāo)害蟲等存在潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，主要體現(xiàn)在兩方面(葉恭銀等, 2011)：一是Bt作物可能直接對Bt蛋白不敏感的其他節(jié)肢動(dòng)物害蟲產(chǎn)生影響，如棉蚜Aphisgossypii(Glover)、盲蝽蟓、煙薊馬Thripstabaci(Lindeman)等(Kumaretal.,2014; Luetal.,2010; Zhangetal.,2012)； 二是可能影響自然生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)功能，如對生物防治、動(dòng)物傳粉和廢棄物分解等的影響(Zeilingeretal.,2016)。

玉米蚜Rhopalosiphummaidis(Fitch)廣泛存在于多種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，是影響玉米生產(chǎn)的重要害蟲之一。它除了刺吸植物組織汁液，還傳播植物病毒，進(jìn)而造成更為嚴(yán)重的間接危害和產(chǎn)量損失(Anwayetal.,2005)。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，玉米蚜既是捕食性天敵昆蟲、寄生性天敵昆蟲，也是其他節(jié)肢動(dòng)物的食物來源。這表現(xiàn)為兩方面：一方面其蟲體本身是草蛉、食蚜蠅和瓢蟲等昆蟲主要甚至是專一的食物(Romeis & Meissle,2011)，另一方面其排泄物(蜜露)是一些節(jié)肢動(dòng)物的重要能量來源(Zhangetal.,2012)。當(dāng)其種群嚴(yán)重波動(dòng)時(shí)，將會對與其相關(guān)的整條食物鏈造成擾動(dòng)，進(jìn)而影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的平衡。因此，玉米蚜蟲是用于轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的重要指示性生物(任少鵬等,2018)。有關(guān)蚜蟲取食轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米引起的食物網(wǎng)中非靶標(biāo)天敵昆蟲等直接或間接暴露于Bt蛋白的安全風(fēng)險(xiǎn)已有很多研究報(bào)道，總的結(jié)論是沒有顯著影響(劉慧等,2012; Digilioetal.,2012; Duanetal.,2010; Lietal.,2008; L?veietal.,2009; Romeisetal.,2014; Tianetal.,2014)。轉(zhuǎn)基因玉米植株活體生測研究對蚜蟲的影響不盡一致。研究表明，表達(dá)Cry1Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米(Bt11, MON810和Event 176)比其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战入s交種更感玉米蚜(Bourguetetal.,2002; Duttonetal.,2002; Fariaetal.,2007; Lumbierresetal.,2004; Ponsetal.,2005);另有研究表明，表達(dá)Cry1Ab轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對麥長管蚜Sitobionavenae(Fabricius)的生長發(fā)育和繁殖沒有影響(Ramirez-romeroetal.,2008)。此外，一些Bt殺蟲蛋白對蚜蟲有低水平的毒力(Porcaretal.,2009; Walters & English,1995; Waltersetal.,1994)。

本研究采用飼料添加法及自制的生測裝置，研究國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米表達(dá)的3種Bt殺蟲蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah對玉米蚜的生長發(fā)育及存活、有翅蚜率等的影響，以期為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蚜蟲

玉米蚜種群采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊科研中試基地玉米田，室內(nèi)用大麥在人工培養(yǎng)箱(寧波江南RXZ-500D-LED)中飼養(yǎng)數(shù)代后備用。培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境條件：溫度(22±1)℃，相對濕度60%±5%，光周期16L∶8D。玉米蚜1日齡若蚜用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 供試蛋白及試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的Vip3Aa19、Cry1Ab蛋白由北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供，Cry1Ah蛋白由北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司提供。酪蛋白(casein，CS)，購于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。PBS緩沖液(1×PBS Buffer)為北京酷來搏科技有限公司生產(chǎn)，pH 7.2～7.4。印楝素(C35H44O16, neem oil)為內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司生產(chǎn)，含量3.0%。其他常見試劑皆為分析純。通過飼料混合生測法(Heetal.,2005; Yangetal.,2018)分別明確了實(shí)驗(yàn)用Vip3Aa19殺蟲蛋白對靶標(biāo)害蟲黏蟲Mythimnaseparata(Walker)、Cry1Ab和Cry1Ah殺蟲蛋白對靶標(biāo)害蟲亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée) 的毒力，致死中濃度LC50分別為1.64、0.10、0.40 μg·g-1，表明供試的3種Bt蛋白對其相應(yīng)的靶標(biāo)害蟲都具有很高的殺蟲活性。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

玉米蚜取食生測方法采用全純?nèi)斯わ暳咸砑臃?，即在玉米蚜的全純?nèi)斯わ暳现蟹謩e添加測試的Bt蛋白。每天觀察記錄蚜蟲的蛻皮、死亡及產(chǎn)蚜情況，直至蚜蟲死亡，每天去除母蚜所產(chǎn)若蚜。玉米蚜的全純?nèi)斯わ暳嫌杀緦?shí)驗(yàn)制備，飼料配方參考Kieckhefer & Derr(1967)，其中含有23種氨基酸，總濃度為21.575 mg·mL-1。飼料制備在實(shí)驗(yàn)前5～7 d完成，飼料制備完成后分裝放置-20 ℃保存。

玉米蚜取食生測分別進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)處理：(1)抗蟲蛋白實(shí)驗(yàn)組，向全純?nèi)斯わ暳现刑砑庸┰嘊t蛋白，分別為PBS緩沖液溶解的Vip3Aa19蛋白溶液(終濃度31.2 μg·mL-1)、Na2CO3溶液溶解的Cry1Ab蛋白溶液(終濃度15.8 μg·mL-1)或Na2CO3溶液溶解的Cry1Ah蛋白溶液(終濃度15.7 μg·mL-1)；(2)中性對照組，分別為PBS緩沖液溶解的CS溶液或Na2CO3溶液溶解的CS溶液，CS濃度與其對應(yīng)的Bt蛋白實(shí)驗(yàn)濃度相同；(3)陰性對照組，PBS緩沖液或者Na2CO3溶液；(4)低濃度陽性對照(Neem-L)，3.0%的Neem稀釋1000倍的溶液；(5)高濃度陽性對照(Neem-H)，3.0%的Neem稀釋200倍的溶液。玉米蚜生測實(shí)驗(yàn)中添加的Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah的濃度分別是引起靶標(biāo)害蟲半致死濃度的19、166、39倍。每個(gè)處理6次重復(fù)，每次重復(fù)測試30頭蚜蟲。

蚜蟲取食裝置結(jié)構(gòu)參考Mittler & Dadd(1964)的三明治膜取食器制作而成，即高30 mm、直徑10 mm，兩端開口的玻璃管，一端用不銹鋼紗網(wǎng)封口，另一端用雙層封口膜夾飼料滴(0.1 mL)做成供食室。在每個(gè)處理的全純?nèi)斯わ暳先∈称髦?，接入玉米?日齡若蚜30頭。將蚜蟲連同取食器放置在人工培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)觀察(培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境條件同1.1)，第8天換飼料1次，每天觀察并記錄生長發(fā)育和死亡蚜蟲數(shù)、新產(chǎn)若蚜數(shù)和有翅蚜數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)各處理每天存活蚜蟲數(shù)、有翅蚜數(shù)、產(chǎn)子代蚜日期、產(chǎn)蚜數(shù)等分別計(jì)算存活率等生物學(xué)參數(shù)。種群生存曲線采用邏輯斯蒂模型分析，統(tǒng)計(jì)計(jì)算采用PoloPlus軟件，得到半數(shù)生存時(shí)間ST50、回歸系數(shù)、卡方值、異質(zhì)因子。不同處理的ST50之間差異性比較根據(jù)其置信區(qū)間是否重疊判斷。取食不同處理飼料各蟲態(tài)玉米蚜的發(fā)育歷期(若蟲期、成蟲期、繁殖期)、存活率、有翅蚜率及產(chǎn)蚜量的變異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種Bt蛋白處理下玉米蚜的存活率

Neem-L和Neem-H處理全純?nèi)斯わ暳巷曫B(yǎng)玉米蚜，分別在取食1和2 d出現(xiàn)顯著死亡，取食2和4 d時(shí)死亡率接近50%，取食4和7 d時(shí)全部死亡，且沒有繁殖下一代若蚜；而取食分別添加了Vip3Aa19、Cry1Ab、Cry1Ah、CS、PBS、Na2CO3的全純?nèi)斯わ暳系挠衩籽?，在取? d時(shí)開始繁殖下一代若蚜，6～7 d時(shí)出現(xiàn)顯著死亡，最長可存活14 d以上(圖1)。

Neem-H處理因在取食4 d時(shí)全部死亡，沒有足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合計(jì)算，其余取食不同飼料處理的蚜蟲生存時(shí)間符合邏輯斯蒂曲線模型(表1)。取食添加了Vip3Aa19、CS、PBS的全純?nèi)斯わ暳系挠衩籽?，?0%個(gè)體生存時(shí)間為8.3～8.6 d，不同處理間差異不顯著，各處理種群生存趨勢(回歸系數(shù))間差異不顯著(表1)。與之相比，Neem-L處理50%個(gè)體生存時(shí)間為3.2 d，顯著低于其他處理，且種群生存趨勢(回歸系數(shù)顯著小)下降顯著。

取食添加了Cry1Ab、CS、Na2CO3的全純?nèi)斯わ暳系挠衩籽?，?0%個(gè)體生存時(shí)間為9.0～9.6 d，不同處理間差異顯著。Cry1Ab蛋白處理的生存時(shí)間顯著長于Na2CO3處理，而CS處理與Cry1Ab蛋白或Na2CO3處理間差異均不顯著(表1)。與之相比，Neem-L處理50%個(gè)體生存時(shí)間為4.0 d，顯著降低。Cry1Ab、CS、Na2CO3處理種群生存趨勢(回歸系數(shù))間差異不顯著，但顯著大于Neem-L處理。

取食添加了Cry1Ah、CS、Na2CO3的全純?nèi)斯わ暳系挠衩籽粒?0%個(gè)體生存時(shí)間為8.3～8.5 d，不同處理間差異不顯著(表1)。與之相比， Neem-L處理50%個(gè)體生存時(shí)間為4.0 d，顯著降低。Cry1Ah、CS、Na2CO3處理種群生存趨勢(回歸系數(shù))間差異不顯著，但顯著大于Neem-L處理。

2.2 3種Bt蛋白處理下玉米蚜的發(fā)育歷期

不同處理間，玉米蚜若蚜期、繁殖期及成蚜期存在顯著差異(表2)。與取食添加PBS飼料處理相比，取食Vip3Aa19或CS蛋白飼料處理的若蚜發(fā)育歷期顯著縮短，成蚜期顯著增長，繁殖期顯著增長(Vip3Aa19處理)。而Vip3Aa19與CS蛋白飼料處理的若蚜期、繁殖期和成蚜期之間差異不顯著。取食添加Cry1Ab和CS蛋白飼料2個(gè)處理間的若蚜發(fā)育歷期、繁殖期和成蚜期差異均不顯著。與之相比，取食添加PBS或Na2CO3飼料處理的若蚜發(fā)育歷期顯著增長，繁殖期和成蚜期則顯著縮短。取食添加Cry1Ah和CS蛋白飼料2個(gè)處理間的若蚜發(fā)育歷期、繁殖期和成蚜期差異均不顯著。而取食添加Na2CO3比添加CS飼料處理的若蚜發(fā)育歷期顯著增長，成蚜期則顯著縮短。

圖1 玉米蚜取食分別添加3種Bt蛋白全純?nèi)斯わ暳系纳媲€Fig.1 Survival model of corn leaf aphids fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

表1 玉米蚜取食分別添加3種Bt蛋白全純?nèi)斯わ暳系纳鏁r(shí)間Table 1 Survival time of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

2.3 3種Bt蛋白處理下玉米蚜的有翅率及產(chǎn)蚜量

玉米蚜取食添加Vip3Aa19與CS蛋白處理間相比，其有翅蚜率及產(chǎn)蚜量均無顯著性差異，但均顯著高于取食添加PBS處理(表3)。說明添加Vip3Aa19和CS比PBS利于玉米蚜繁殖。取食添加Cry1Ab與CS蛋白處理間相比，其產(chǎn)蚜量差異不顯著，但均顯著高于添加Na2CO3處理。而取食添加Cry1Ab和PBS處理的有翅蚜率間無顯著差異，但均顯著低于添加CS蛋白處理。取食添加Cry1Ab、CS蛋白及Na2CO3處理間相比，有翅蚜率差異不顯著，僅Na2CO3處理的產(chǎn)蚜量顯著低于前二者。

表2 玉米蚜取食分別添加3種Bt蛋白全純?nèi)斯わ暳系陌l(fā)育歷期Table 2 Developmental time of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

表3 玉米蚜取食分別添加3種Bt蛋白 全純?nèi)斯わ暳系挠谐崧始爱a(chǎn)蚜量Table 3 Percentage of alatae and reproduction of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

3 討論

飼料添加法測定某一物質(zhì)(化學(xué)殺蟲劑、Bt蛋白等)對昆蟲尤其是天敵的影響被廣泛采用(Romeisetal.,2008)，以甄別供測試物質(zhì)對測試對象(多為天敵)是否存在“毒力”活性，因此設(shè)置已知具有毒力活性物質(zhì)的陽性對照和溶解所測試物質(zhì)(如Bt蛋白)溶劑或緩沖液為陰性對照(Lietal.,2008； Porcaretal.,2009; Walters & English,1995)，驗(yàn)證生測體系能夠靈敏的檢測出處理間真實(shí)存在的顯著差異。本研究表明，不同濃度處理引起蚜蟲死亡率間存在顯著差異。說明這一生測體系能夠真實(shí)檢測出不同供試物質(zhì)處理間毒力活性差異。

有研究報(bào)道，馬鈴薯蚜Macrosiphumeuphorbiae(Thomas)對Cry2、Cry3A和Cry4晶體懸浮液敏感，而對其溶液不敏感(Walters & English,1995; Waltersetal.,1994),這可能與晶體的非完全溶解和生測時(shí)對照沒有添加溶解晶體的緩沖液有關(guān)(Walters & English,1995)。Porcaretal.(2009)研究報(bào)道了豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(Harris)對Cry3A、Cry4Aa、Cry11Aa和Cyt1Aa有低水平的敏感性，且必須是以溶解這些Bt蛋白的緩沖液為對照進(jìn)行比較。本研究結(jié)果表明，與陰性對照相比，飼料中分別添加3種Bt蛋白有利于玉米蚜的生長發(fā)育和繁殖。此外，考慮到生測用玉米蚜全純?nèi)斯わ暳?，其營養(yǎng)成分含量一定，而測試的Bt蛋白為蛋白質(zhì)，除考慮其殺蟲活性之外，還應(yīng)考慮其營養(yǎng)成分屬性，飼料中添加或提高飼料的營養(yǎng)質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)中增加了等量的CS為中性對照。而全純?nèi)斯わ暳现蟹謩e添加3種Bt蛋白處理的玉米蚜存活率和生存時(shí)間、若蚜期、繁殖期和成蚜期以及產(chǎn)蚜量與添加CS蛋白處理沒有顯著差異，而與陰性對照相比差異顯著。說明玉米蚜全純?nèi)斯わ暳现蟹謩e添加3種Bt蛋白或CS蛋白，起到了相同的作用，即提高了飼料營養(yǎng)質(zhì)量。由于轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)的Bt蛋白在韌皮部組織汁液中檢測不到或含量極低(Duttonetal.,2002; Rapsetal.,2001)。實(shí)際生產(chǎn)中轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的Bt蛋白量遠(yuǎn)達(dá)不到本實(shí)驗(yàn)中的濃度，因此，這種有益于玉米蚜生長發(fā)育的現(xiàn)象在實(shí)際中并不一定能體現(xiàn)。雖有研究報(bào)道，6個(gè)表達(dá)BtCry1Ab轉(zhuǎn)基因玉米中的5個(gè)比其常規(guī)對照玉米上玉米蚜種群數(shù)量增加，且與Bt玉米韌皮部組織汁液的氨基酸表達(dá)量高相關(guān)(Fariaetal.,2007)，但不能完全排除是由品種間差異引起。

生態(tài)系統(tǒng)中，蚜蟲以刺吸式口器刺入植物韌皮部吸食組織汁液，與土壤芽孢桿菌Bt的生態(tài)位差異較大。因此，基本不存在相互協(xié)同進(jìn)化的可能。Kieckhefer & Derr (1967)曾指出，適宜蚜蟲存活和繁殖的全純?nèi)斯わ暳掀湔崽呛繎?yīng)為10%～30%，最適為20%。雖然Porcaretal. (2009) 報(bào)道了Cry3A、Cry4Aa、Cry11Aa和Cyt1Aa等Bt蛋白對豌豆蚜有低水平的毒力活性，然而其使用濃度都非常高，在125～500 μg·mL-1濃度下才能觀測到低水平的影響，實(shí)驗(yàn)雖然設(shè)置了緩沖液作為陰性對照，但缺乏中性蛋白對照。同時(shí)，其生測方法亦是添加Bt蛋白到全純?nèi)斯わ暳?，即營養(yǎng)成分有一定的均衡性，大量增加單一Bt蛋白的合理性，是否會對飼料營養(yǎng)適宜性及蚜蟲取食消化產(chǎn)生不利影響有待商榷。本研究中以添加CS蛋白作為中性對照，測試濃度是Porcaretal.(2009)測試濃度的3%～25%，飼料的氮含量提高了0.7%～1.4%，無論是Bt蛋白還是CS蛋白都有利于玉米蚜的生長發(fā)育和繁殖，即實(shí)質(zhì)等同性，可解釋為Bt蛋白和CS蛋白一定程度上提高了全純?nèi)斯わ暳系臓I養(yǎng)質(zhì)量,但最高可添加量有待于進(jìn)一步研究探討。