罕見同卵雙胞胎侵襲性牙周炎患者易感基因研究

劉麗， 藍(lán)露芳， 郭淑娟， 吳亞菲

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周病科，四川 成都（610041）

侵襲性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）是一類進(jìn)展迅速、破壞嚴(yán)重、有家族聚集性的牙周破壞性疾?。?］。AgP 是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，病因尚不明確［2］。研究發(fā)現(xiàn)罹患AgP 與攜帶某些易感基因相關(guān)，提示遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中起到重要作用［3-4］。目前對AgP 易感基因研究主要集中在一些目標(biāo)候選基因，但國內(nèi)外關(guān)于這些基因在不同人種中的攜帶率尚無統(tǒng)一定論［3，5］。由于基因多態(tài)性、環(huán)境及宿主因素的影響，使得確定遺傳因素在疾病中的作用十分困難?；贏gP 家族聚集性的特點(diǎn)，常運(yùn)用家系研究［6-7］及雙胞胎研究來評估遺傳、環(huán)境因素對疾病的影響，其中同卵雙胞胎實(shí)驗(yàn)是最理想的研究模型［7］。同卵雙胞胎（monozygotic twins，MZ）的遺傳物質(zhì)基本相同，但胚胎發(fā)育和環(huán)境的影響可使其遺傳物質(zhì)產(chǎn)生差異，從而引起二者表型差異［8］。本研究通過對同卵雙胞胎廣泛型侵襲性牙周炎（generalized aggressive periodontitis，GAgP）表型的鑒定和遺傳物質(zhì)的分析，探索遺傳基因與GAgP 發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

雙胞胎，女性，26 歲，漢族，籍貫山西。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道的問卷法［9］結(jié)合父母及子代血型鑒定法判斷其卵型。本研究通過倫理委員會(huì)審批，患者同意并簽署知情同意書。

1.2 主要材料和試劑

QIAamp blood mini kit（Qiagen，德國）；目標(biāo)基因引物合成（上海生物工程sangon biotech）；限制性內(nèi)切酶Ava I、Taq I、Nco I、Apa I、Xba I（New England Biolab，美國）；Sureselect Human All Exon 50M kit（Agilent，美國）；Illumina HiSeq 2500 高通量測序系統(tǒng)（Illuminat，美國）。

1.3 病例采集

詳細(xì)詢問并記錄病史。拍攝初診口內(nèi)照及治療前后全景片，采Florida 牙周探針（Florida company，USA）對兩名患者口內(nèi)28 顆牙的6 個(gè)位點(diǎn)（近中頰側(cè)、近中舌側(cè)、遠(yuǎn)中頰側(cè)、遠(yuǎn)中舌側(cè)、頰側(cè)中央、舌側(cè)中央）進(jìn)行牙周指標(biāo)檢查，包括：探診深度（probing depth，PD）、臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）、探診出血指數(shù)（bleeding on probing，BOP）及牙齒松動(dòng)度（tooth movement，TM）。初診檢查后，由研究者與患者充分溝通交流病情，并進(jìn)行口腔衛(wèi)生宣教，指導(dǎo)患者菌斑控制方法。隨后進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療（分區(qū)多次進(jìn)行齦上潔治、齦下刮治及根面平整術(shù)），并輔助全身用藥（口服阿莫西林克拉維酸鉀、奧硝唑各0.5 g/次，2 次/d，3～5 d）和局部抗菌藥物使用（0.12%的氯己定含漱1周）。治療后3 月再次行Florida 牙周探診檢查以評估短期療效。由研究者以外的兩名專業(yè)牙周醫(yī)生分別進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療和牙周測量工作。

1.4 基因組DNA 提取

抽取研究對象前臂靜脈血，按照QIAamp blood mini kit 說明書從全血中提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后檢測DNA 濃度，-20℃保存。

1.5 候選易感基因基因型鑒定

運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法對篩選出的6 個(gè)目標(biāo)易感基因進(jìn)行鑒定，包括白細(xì)胞介素1β-511（interleukin-1 beta-511，IL-1β-511）、白細(xì)胞介素1β+3953（interleukin-1 beta+3953，IL-1β+3953）、腫瘤壞死因子-α-308（tumor necrosis factor alpha-308，TNF-α-308）、Fcγ 受體-IIIb（Fc gamma receptor-IIIb，F(xiàn)cγRIIIb）、維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）［5，10］。運(yùn)用NCBI 數(shù)據(jù)庫Primer-BLAST 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，引物由上海生工合成，序列見表1。按照說明書取上述模板DNA 2 μL，加入各基因上下游引物2 μL，總反應(yīng)體積為50 μL，然后行PCR 循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存產(chǎn)物。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶法進(jìn)行PCR 產(chǎn)物鑒定，取PCR 產(chǎn)物5 μL，加入各目的基因特定限制性內(nèi)切酶，總反應(yīng)體積20 μL，37 ℃水浴過夜，1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，60 min），溴化乙錠染色后自動(dòng)凝膠成像分析儀采集圖片。

表1 基因引物序列Table 1 The primer sequences

1.6 全外顯子測序（whole-exome sequencing，WES）

使用Sureselect HumanAll Exon 50M kit 和靶向序列捕獲技術(shù)對DNA 進(jìn)行全外顯子捕獲，再利用Illumina HiSeq 2500 高通量測序系統(tǒng)，將富集后的外顯子在DNA HiSeq PE150 模式下進(jìn)行雙端測序，每條讀長150 bp。

1.7 數(shù)據(jù)質(zhì)控、處理及生物學(xué)分析

使用FreeBayes 工具檢測單核苷酸多態(tài)性（single nuclear polymorphism，SNP）、微小插入或缺失（Insect and Delete，InDel），并按“測序深度≥5 且QUAL 值≥50”進(jìn)行過濾。結(jié)果整合多個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)庫并通過Annovar 行突變注釋。按2 kb 窗口大小對拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）進(jìn)行分析，覆蓋度大于1.5 的片段為重復(fù)區(qū)段，小于0.5為缺失區(qū)段。X 代表同卵雙胞胎的妹妹；Y 代表同卵雙胞胎的姐姐。差異性SNP 和InDel 篩選條件：①Y 樣本突變率＞0.25，X 樣本突變率＜0.05，等位基因數(shù)目＜3；②篩除dbSNP 或1 000 Genome 數(shù)據(jù)庫最小等位基因頻率＜0.01；③僅篩查外顯子區(qū)域；④除去無功能的同義突變。CNV 差異的篩選條件：①Y 測序深度/X 測序深度＞1.2 或＜0.8；②|Y 測序深度-X 測序深度|＞0.2 倍全外顯子平均測序深度；③滿足以上條件的變異再次以IGV（integrative Genomics Viewer）軟件手動(dòng)核查。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對t檢驗(yàn)法分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 初診臨床檢查結(jié)果

雙胞胎血型均為O 型，其父為O 型，母為B型。結(jié)合問卷結(jié)果判斷該雙胞胎的卵型為同卵型。訴有牙周炎家族史（母親失牙年齡較早，具體不詳），余否認(rèn)。既往史：妹妹17 歲時(shí)接受正畸治療1 年，前牙全瓷冠修復(fù)5 年，姐姐無特殊，口腔衛(wèi)生習(xí)慣均為刷牙2 次/日，每次5 min，不使用牙線，無其他輔助措施。

妹妹口腔衛(wèi)生一般，少量齦上軟垢、結(jié)石，色素（-），BOP（+）；牙齦充血，質(zhì)地柔軟，牙齦退縮明顯，覆覆蓋正常；12～22 牙全瓷橋，全瓷冠邊緣密合，邊緣位于齦上，牙槽骨廣泛吸收累及全口牙，多顆牙角形吸收至根尖1/3，口內(nèi)廣泛的附著喪失及深牙周袋。姐姐口腔衛(wèi)生欠佳，齦上軟垢結(jié)石I°，色素（+），BOP（+），牙齦色澤充血鮮紅，質(zhì)地柔軟，未見明顯牙齦退縮；全景片示全口牙牙槽骨廣泛吸收達(dá)根長1/3，11、12、33、41、42 牙鄰面牙槽骨角形吸收達(dá)根中1/2；口內(nèi)廣泛的附著喪失及深牙周袋。見圖1。

口內(nèi)衛(wèi)生情況妹妹略優(yōu)于姐姐，而牙槽骨吸收情況妹妹相對于姐姐吸收更加廣泛且程度更重，F(xiàn)lorida 探診結(jié)果顯示妹妹PD、CAL 指標(biāo)高于姐姐，但姐姐初診BOP 高于妹妹（表2），這可能與姐姐初診口腔衛(wèi)生控制不良有關(guān)。

2.2 牙周基礎(chǔ)治療3 個(gè)月后復(fù)診臨床檢查結(jié)果

姐妹二人口腔衛(wèi)生控制情況尚可，姐姐下前牙結(jié)石新附著（+），妹妹口腔衛(wèi)生控制情況優(yōu)于姐姐，二者牙齦充血紅腫及BOP 均明顯改善；全景片示二者牙槽骨高度均未見明顯恢復(fù)（圖2）。Florida 探診結(jié)果顯示經(jīng)基礎(chǔ)治療后PD、CAL、BOP 等指標(biāo)均有改善（表2）。

Figure 1 Clinical data of the monozygotic twins at initial diagnosis圖1 同卵雙胞胎初診臨床資料

表2 同卵雙胞胎治療前后全口臨床指標(biāo)變化Table 2 Changes in clinical indicators of the monozygotic twins

2.3 同卵雙胞胎GAgP 患病程度及對牙周治療效果不同

根據(jù)GAgP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：廣泛的鄰面附著喪失，侵犯第一磨牙和切牙以外的牙數(shù)在三顆以上［11］，姐妹初診全景片和初診Florida 探診結(jié)果均顯示全口廣泛的鄰面附著喪失及牙槽骨吸收，故診斷為GAgP。對比姐妹初診時(shí)的PD、CAL 結(jié)果及全景片牙槽骨吸收情況，發(fā)現(xiàn)妹妹的GAgP 患病程度更嚴(yán)重。治療后，姐姐CAL 的改善較明顯，BOP下降幅度也更明顯，且治療后姐姐不同袋深的比例均降低，而妹妹降低較少（表3）。提示經(jīng)相同治療后姐姐疾病的改善更明顯。

Figure 2 Clinical data of the monozygotic twins after 3 months of basic periodontal treatment圖2 同卵雙胞胎牙周基礎(chǔ)治療3 個(gè)月后臨床資料

表3 同卵雙胞胎治療前后牙周袋比例變化Table 3 Changes of the ratio about PD in monozygotic twins

2.4 同卵雙胞胎目標(biāo)候選易感基因及其基因型相同

圖3 及表4 PCR-RFLP 酶切結(jié)果顯示在同卵雙胞胎姐妹中均可檢出6 個(gè)目標(biāo)候選AgP 易感基因，且姐妹二者基因型相同。

2.5 同卵雙胞胎姐妹外顯子基因中存在與GAgP表型相關(guān)的可疑差異突變

經(jīng)個(gè)性化分析和可疑疾病相關(guān)基因的特殊篩選，在姐妹二人中檢測到26 個(gè)差異性SNP（詳見本文OSID 碼）和30 個(gè)移碼突變（Ins/Del，詳見本文OSID 碼），這些突變會(huì)導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，與姐妹二人之間的疾病表型相關(guān)。通過對上述基因功能的手動(dòng)篩查，找到4 個(gè)與炎癥、骨代謝相關(guān)的可疑SNP 差異性基因：ZFPM1、PTH2、ZFYVE16、LY6G6C；這4 個(gè)差異性基因可能與GAgP 表型差異相關(guān)，但未找到相關(guān)的移碼突變?；胺ǚ治霭l(fā)現(xiàn)該同卵雙胞胎CNV 分布有差異性，但未篩選出相關(guān)的CNV 差異。

Figure 3 The results of PCR-RFLP gel electrophoresis圖3 PCR-RFLP 酶切凝膠電泳結(jié)果圖

表4 6 個(gè)候選易感基因基因型Table 4 The genotype of the six candidate susceptibility genes

3 討 論

有研究通過同卵雙胞胎實(shí)驗(yàn)證實(shí)了環(huán)境及遺傳因素對牙齦纖維瘤?。?2］、慢性牙周炎［13］及菌斑性齦炎［14］的影響，但目前尚未有關(guān)于侵襲性牙周炎的雙胞胎研究報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)以同卵雙胞胎為疾病模型對AgP 臨床表型和遺傳物質(zhì)進(jìn)行研究，顯示同卵雙胞胎姐妹的GAgP 表型不同，二者疾病嚴(yán)重程度和對相同治療的反應(yīng)效果均存在差異，推測可能的原因如下：①妹妹發(fā)病時(shí)間較姐姐早，牙周破壞累及范圍和程度更重，且存在根分叉病變等解剖因素影響深袋內(nèi)細(xì)菌清除率；②易感基因及其他遺傳因素影響了妹妹宿主免疫反應(yīng)從而加快疾病發(fā)生發(fā)展并影響治療效果。

回顧危險(xiǎn)因素時(shí)發(fā)現(xiàn)同卵雙胞胎母親的早年失牙史，提示了該同卵雙胞胎姐妹對GAgP 的遺傳易感性。IL-1β-511 I/II 型［15］，L-1β+3953 II/II 型和等位基因II［16］；TNF-α-308 等位基因［17］；FcγRIIIb受體NA1/NA1 型［18］；VDR T/t 型［19］以及ER X/X 型和等位基因X［20］可增加中國人患AgP 的易感性，同時(shí)多個(gè)易感基因存在疊加效應(yīng)，可加速AgP 的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示同卵雙胞胎姐妹均攜帶除IL-1β+3953II/II 型以外的易感基因的基因型，推測上述幾種易感基因及其疊加效應(yīng)增加了該同卵雙胞胎患GAgP 的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，且二者患病風(fēng)險(xiǎn)相同。易感基因雖能解釋同卵雙胞胎姐妹罹患GAgP 的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，但無法解釋二者GAgP 表型的差異，而外顯子作為基因表達(dá)最密切的區(qū)域，是研究疾病與基因關(guān)聯(lián)性的突破點(diǎn)［21］。從WES結(jié)果發(fā)現(xiàn)該同卵雙胞胎患者遺傳物質(zhì)存在差異，且該差異主要由二者發(fā)育過程中差異性的基因突變和基因重排引起。研究從二者差異突變的基因中篩出26 個(gè)差異性SNP 和30 個(gè)Ins/Del，這些突變會(huì)導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變。通過對基因功能的手動(dòng)篩查，找到4 個(gè)（ZFPM1、PTH2、ZFYVE16、LY6G6C）與炎癥、骨代謝相關(guān)的可疑SNP，可能與二者GAgP表型差異相關(guān)，但不排除其余22 個(gè)差異性SNP 和30 個(gè)Ins/Del通過改變其編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)其他途徑影響GAgP 的發(fā)生發(fā)展。但由于受研究手段限制，未能從二者差異的CNV篩選出與AgP 疾病相關(guān)的CNV 變異。

此外，環(huán)境因素在同卵雙胞胎姐妹GAgP 的發(fā)生發(fā)展中也可能發(fā)揮了一定的作用。妹妹17 歲時(shí)“因前牙有縫”接受正畸治療1 年，前牙全瓷冠修復(fù)5 年。有文獻(xiàn)指出，盡管輔助的正畸治療在AgP 修復(fù)階段是有益的，但未有效控制的牙周炎活躍期，正畸治療會(huì)加速牙周炎的急性進(jìn)展及骨破壞［22］?！扒把烙锌p”可能與早期的AgP 發(fā)病相關(guān)，該階段的正畸治療可能是加重牙周破壞的危險(xiǎn)因素。固定修復(fù)體的材料、邊緣位置及密合性、軸面外形、鄰接關(guān)系及橋體齦面與牙槽嵴的關(guān)系與宿主牙周組織的健康均密切相關(guān)［23］。檢查發(fā)現(xiàn)妹妹全瓷冠修復(fù)材料適宜，邊緣密合，邊緣止于釉牙骨質(zhì)界，據(jù)患者回顧5 年前行烤瓷冠修復(fù)時(shí)牙齦已經(jīng)退縮，因此對于該患者全瓷修復(fù)體造成其GAgP 加重的可能性較低。

本研究表明同卵雙胞胎姐妹的GAgP 表型存在差異，易感基因增加了其罹患GAgP 的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。采用WES 分析了同卵雙胞胎患者的基因突變差異并提出了其與GAgP 表型差異的潛在聯(lián)系，為GAgP 遺傳病因?qū)W研究提供了新思路。但由于目前研究手段限制和數(shù)據(jù)庫不足，相關(guān)基因變異和疾病表型之間的關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。