一種基于嗎啉衍生物的Fe3+/Cu2+熒光探針

羅杰偉 趙 波 張仕祿 賈飛云 劉 軍

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南充 637000)

近年來，離子識(shí)別因其精確靈敏的檢出極限和豐富多元的響應(yīng)信號(hào)在信息學(xué)、生物診斷試劑與診斷醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力[1-3]。在各種重金屬中，鐵和銅是人體中豐富的微量元素，鐵離子和銅離子參與了很多細(xì)胞的生物及化學(xué)過程。如Fe3+作為血紅蛋白、肌紅蛋白和各種酶形成的重要組成部分，參與了細(xì)胞水平上的許多生物和化學(xué)過程[4]。但過多的Fe3+和Cu2+卻給人的身體健康帶來傷害。如過量的Fe3+會(huì)破壞蛋白質(zhì)、肝臟、DNA等，從而引發(fā)多種疾病[5]。Cu2+過量不僅導(dǎo)致一些如威爾遜病、孟克斯病、帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病，還會(huì)引起腸道疾病和肝腎損害[6]。對(duì)于正常的生理機(jī)能而言，要求體內(nèi)的Fe3+和Cu2+處于平衡狀態(tài)，因此，設(shè)計(jì)熒光傳感器探測(cè)Fe3+和Cu2+成為目前的研究熱點(diǎn)之一[7-11]。

嗎啉衍生物是一類重要的六元含氮雜環(huán)化合物，在農(nóng)藥、醫(yī)藥等生物和非生物領(lǐng)域都具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值與廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。嗎啉環(huán)上氧原子可以參與相應(yīng)受體的供體-受體型相互作用，增加結(jié)合緊密性；另外，氧原子的高電負(fù)性降低了氮原子的堿性[14]。嗎啉基團(tuán)的特殊性使得許多科研工作者致力于嗎啉衍生物的合成與性能研究，但目前關(guān)于嗎啉衍生物同時(shí)對(duì)Fe3+和Cu2+具有選擇性識(shí)別的報(bào)道還很少[15-18]。鑒于此，我們合成了一種熒光分子探針4-((3-(1-苯基-5-吡啶基-4，5-二氫-1H-吡唑-3-基)蒽-9-基)甲基)嗎啉(L)，利用熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜研究了探針L的離子識(shí)別性能。還測(cè)定了L在Fe3+、Cu2+和H+不同組合條件下的量子產(chǎn)率，構(gòu)建了三輸入“NOR”邏輯門電路。結(jié)果表明，通過儀器檢測(cè)和裸眼可以判斷探針L選擇性識(shí)別Fe3+和 Cu2+。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器有：ZFQprobe L5A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(四川康宇科技公司)、Avatar 360型紅外光譜儀(KBr壓片，Nicolet公司)、XT-4型雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(溫度計(jì)未經(jīng)校正，北京泰克公司)、AdvanceⅢ400 Hz核磁共振儀(Bruker公司)、UV2550型紫外分光光度儀(Shimadzu公司)、RF-5301型熒光光度計(jì)、pHS-3C型酸度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。9-乙?；?、嗎啉、1，4-二氧六環(huán)、苯肼、三溴化磷、吡啶甲醛等均為分析純，購自科龍化學(xué)試劑公司。硼氫化鈉為進(jìn)口袋裝。金屬離子溶液所用金屬鹽均為高氯酸鹽水合物。測(cè)試中所用的乙腈為色譜純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 熒光探針L的合成

合成路線如Scheme 1所示。

Scheme 1 探針L的合成路線Scheme 1 Synthetic route for probe L

1.2.1 4-(9-蒽甲基)嗎啉(3)的合成

化合物 9-蒽醇(1)和 9-溴甲基蒽(2)參照文獻(xiàn)[19]合成。在250 mL圓底燒瓶中加入2(5 g，18.45 mmol)、無水K2CO3(7.65 g，55 mmol)、80 mL無水CH3CN和少量KI，攪拌回流9 h。冷卻至室溫，抽濾，旋蒸除去溶劑。用二氯甲烷和石油醚(1∶4，V/V)重結(jié)晶得到黃色顆粒狀固體4.1 g。產(chǎn)率：80.4%，m.p.142～144℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，-OCH2-)，4.46(s，2H，Ar-CH2-)，7.46～7.56(m，4H，Ar-H)，8.00～8.03(m，2H，Ar-H)，8.44(s，1H，Ar-H)，8.48～8.49(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，8.51(s，1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 53.65,54.54，67.11，76.77，77.09，77.41,124.84,124.99，125.63，127.55，128.96，129.10，131.35，131.39。

1.2.2 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)乙酮(4)的合成

在250 mL三頸瓶中加入3(1 g，3.6 mmol)、乙酰氯(1.7 g，22 mmol)和50 mL無水二氯甲烷，冰鹽浴條件下攪拌，冷卻至-5～0℃時(shí)，分批加入0.96 g無水三氯化鋁，拆去冰浴，攪拌至溫度升到10℃。抽濾，無水二氯甲烷洗滌。將溶液緩慢加入到150 mL冰和濃鹽酸的混合溶液中，用二氯甲烷和水萃取，以飽和Na2CO3溶液洗至pH=7，無水MgSO4干燥。抽濾，旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析純化(V石油醚∶V二氯甲烷=4∶1)得黃色固體0.35 g。產(chǎn)率：30%，m.p.158～160℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.60～2.62(t，J=4.4 Hz，4H，-N-CH2-)，2.77(s，3H，-COCH3)，3.63～3.65(t，J=4.4 Hz，4H，-O-CH2-)，4.44(s，2H，Ar-CH2-)，7.51～7.63(m，2H，Ar-H)，8.03～8.07(m，2H，Ar-H)，8.49～8.53(m，2H，Ar-H)，8.58(s，1H，Ar-H)，8.64～8.65(d，J=4 Hz,1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 26.44,53.52，54.42，66.97，122.86，124.99，125.44，125.58，126.91,129.17,130.06,131.69,132.23，132.90，133.37。

1.2.3 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)-3-吡啶基丙基-2-烯-1-酮(5)的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入7 g KOH、10 mL水和50 mL 95%乙醇，冷卻至室溫。加入4(0.638 g，2 mmol)和吡啶甲醛(0.321 g，3 mmol)，在15 ℃下攪拌3 h。過濾，水洗，用無水乙醇重結(jié)晶得黃色固體0.425g。產(chǎn)率：64%，m.p.145～148℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.65(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.67(t，J=8 Hz，4H，-O-CH2-)，4.45(s，2H，Ar-CH2-)，7.33～7.37(m，1H)，7.52～7.56(m，2H),7.60～7.64(m,1H),7.77～7.81(m，1H)，7.87～7.91(d，J=16 Hz，1H)，8.06～8.08(d，J=8 Hz，1H)，8.17～8.20(m，1H)，8.36～8.40(d，J=16 Hz，1H)，8.51～8.58(m，2H)，8.64(m，1H)，8.75～8.77(m，1H)，8.86～8.87(d，J=4 Hz，1H)。

1.2.4 L的合成

50 mL圓底燒瓶中加入5(0.5 g，1.5 mmol)和10 mL無水乙醇，加熱至溶解，加入苯肼(0.199 g，1.18 mmol)和一粒氫氧化鈉，攪拌回流16 h。冷卻至室溫，加適量水析出黃色固體。抽濾，水洗，用無水乙醇重結(jié)晶得黃色固體0.27 g。產(chǎn)率：42%，m.p.276～278 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.61～2.63(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.46(s，1H)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz,4H,-O-CH2-),4.07(s，1H)，4.44(s，2H，Ar-CH2-)，5.53～5.58(m，1H)，6.82～6.86(m，1H，Ar-H)，7.14～7.16(m，2H，Ar-H)，7.19～7.21(m，1H，Ar-H)，7.23(s，1H，Ar-H)，7.24～7.25(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，7.26～7.28(m，1H，Ar-H)，7.46～7.55(m，2H，Ar-H)，7.59～7.63(m，1H，Ar-H)，7.86～7.87(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，7.96～8.00(m，1H，Ar-H)，8.24～8.27(m，1H，Ar-H)，8.25(s，1H，Ar-H)，8.45～8.48(m，2H，Ar-H)，8.65～8.67(m，1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 41.64，53.55，54.44，65.73，67.03，113.20，119.30，120.24，122.53，123.32，124.98,125.13,125.24,125.37,125.86，125.96，127.78，128.84，129，129.16，129.25，131.00，131.05，131.70，131.75，137.41，144.30，146.96，149.65，161.49。

1.3 離子識(shí)別實(shí)驗(yàn)

1.3.1 溶液配制

稱量4.9 mg(0.01 mmol)L于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，濃度為0.1 mmol·L-1。配制含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Hg2+等離子的高氯酸鹽溶液，濃度為0.1 mmol·L-1。

1.3.2 光譜測(cè)定

移取0.1 mL的L溶液分別置于10 mL容量瓶中，分別加入0.1 mL各種陽離子溶液，稀釋至10 mL(濃度為1 μmol·L-1)，搖勻，靜置24 h。室溫下，在激發(fā)波長360 nm、狹縫寬度(d)5 μm的條件下測(cè)定其熒光發(fā)射強(qiáng)度。以乙腈溶液為參比溶液，在波長為200～600 nm條件下測(cè)定主-客體混合液的紫外吸收強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L對(duì)陽離子的識(shí)別

圖1 加入不同陽離子后L在乙腈中的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of L after adding various cations in acetonitrile

如圖1所示，在360 nm激發(fā)波長下，F(xiàn)e3+和Cu2+對(duì)探針L表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光猝滅，其他離子對(duì)L無影響。當(dāng)加入Fe3+后，L的熒光強(qiáng)度從650變?yōu)?15，最高峰位置從540 nm紅移到567 nm。加入Cu2+后，L的熒光強(qiáng)度從650變?yōu)?10，最高峰位置不變。同時(shí)，L溶液的顏色分別從淡黃色變?yōu)樽睾稚退{(lán)色(圖2)，裸眼很容易判斷L選擇性識(shí)別Fe3+和Cu2+。

圖2 在L的乙腈溶液中加入不同離子后的顏色變化Fig.2 Color changes of L in acetonitrile after adding various ions

2.2 探針L的熒光滴定

圖3 加入不同濃度Fe3+后L在乙腈中的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of L in acetonitrile upon addition of iron ion with different concentrations

圖4 加入不同濃度Cu2+后L在乙腈中的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of L in acetonitrile upon addition of copper ion with different concentrations

鑒于L對(duì)Fe3+和Cu2+具有較好的識(shí)別效果，用Fe3+和Cu2+對(duì)L進(jìn)行熒光滴定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著Fe3+濃度的增加，峰的強(qiáng)度逐漸減小并向長波方向移動(dòng)；峰強(qiáng)從650降至123，降低了527；峰位從540 nm移到了582 nm，紅移了42 nm；在425 nm處出現(xiàn)了一個(gè)小峰，但峰強(qiáng)度很小(圖3)。紅移原因可能是吡啶環(huán)和吡唑環(huán)上的N都參與了配位，熒光淬滅被抑制。圖4顯示，隨著Cu2+濃度的增加，L的熒光光譜在540 nm處的峰強(qiáng)逐漸降低到0，同時(shí)在425 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的峰，強(qiáng)度從0升至105。通過Job曲線法求得L與Fe3+和Cu2+的配位比均為1∶1。可能是L環(huán)上雜原子作為軟給體原子與軟/硬酸Fe3+和Cu2+發(fā)生了配位作用。

2.3 探針L與Fe3+/Cu2+配位反應(yīng)的抗干擾測(cè)定

為了考察其它陽離子對(duì) L(1.0 μmol·L-1)與 Fe3+和Cu2+配位反應(yīng)的影響，研究了Fe3+和Cu2+與其他金屬離子共存時(shí)L在540 nm處的熒光變化(圖5)。結(jié)果證實(shí)，在其它陽離子共存時(shí)也不影響L同時(shí)識(shí)別Fe3+和Cu2+，說明L對(duì)Fe3+/Cu2+具有較強(qiáng)的選擇性識(shí)別。

圖5 Fe3+、Cu2+與其他離子共存時(shí)L的熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensity of L when Fe3+and Cu2+coexist with other ions

2.4 探針L的抗酸性實(shí)驗(yàn)

圖6顯示，由于嗎啉環(huán)上O原子為電負(fù)性，N原子是三級(jí)N且吡啶環(huán)上N原子富電子性，L受pH的影響很大。當(dāng)pH≤4時(shí)，熒光淬滅完全；pH＞4時(shí)，熒光強(qiáng)度沒有變化，說明嗎啉環(huán)上O原子、N原子以及吡啶環(huán)上N原子容易質(zhì)子化。結(jié)果表明，L在pH值為5～7時(shí)熒光強(qiáng)度基本不變，具有良好的傳感性能，可應(yīng)用于生物領(lǐng)域。

圖6 不同pH值時(shí)L在乙腈中的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of L in acetonitrile with different pH values

2.5 探針L的紫外吸收性能

圖7顯示，L在267和380 nm有吸收峰。加入Fe3+后L的這2個(gè)吸收峰強(qiáng)度增大，加入Cu2+后L在267 nm的峰強(qiáng)度增大，在380 nm的峰強(qiáng)度減小，其它離子對(duì)L無影響。在Fe3+和Cu2+對(duì)L的紫外滴定實(shí)驗(yàn)中，加入Fe3+后L在267和380 nm的強(qiáng)度逐漸增大(圖8)；加入Cu2+后L在267 nm的峰強(qiáng)也是逐漸增大，在380 nm的強(qiáng)度卻是逐漸減小，但強(qiáng)度變化都不明顯(圖9)。在H+對(duì)L紫外滴定實(shí)驗(yàn)中，隨著pH值減小，紫外吸收強(qiáng)度逐漸減小。當(dāng)pH≤4時(shí)，強(qiáng)度突然減小，吸收峰位藍(lán)移(圖10)。實(shí)驗(yàn)證明探針L對(duì)Cu2+、Fe3+具有較強(qiáng)的選擇性識(shí)別。

圖7 加入不同陽離子后L在乙腈中的紫外光譜Fig.7 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of various cations

圖8 加入不同濃度Fe3+后L在乙腈中的紫外光譜Fig.8 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of iron ion with different concentrations

圖9 加入不同濃度Cu2+后L在乙腈中的紫外光譜Fig.9 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of copper ion with different concentrations

圖10 在不同pH值時(shí)L在乙腈中的紫外光譜Fig.10 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile with different pH values

2.6 探針L的NOR邏輯門研究

由于加入Fe3、Cu2+和H+后探針L熒光淬滅，考察了加入1種、2種或者3種離子組合時(shí)L的熒光強(qiáng)度變化。圖11顯示，加入Cu2+、Fe3+和H+不同的組合后，L釋放出不同的熒光輸出信號(hào)，因此，可利用L與Cu2+、Fe3+配位作用以及H+質(zhì)子化作用產(chǎn)生的存儲(chǔ)功能構(gòu)建NOR邏輯門。

在 L 的乙腈溶液(1.0 μmol·L-1)中分別加入 Fe3+(2.0 μmol·L-1)、Cu2+(2.0 μmol·L-1)和 H+(2.0 μmol·L-1)，在激發(fā)波長為360 nm下測(cè)其熒光強(qiáng)度。以蒽(1.0 μmol·L-1)為參比(室溫，Φf=0.36)，運(yùn)用公式 Yu=(Ys×Fu×As)/(Fs×Au)計(jì)算出量子產(chǎn)率(表 1)，其中Yu為待測(cè)物質(zhì)的量子產(chǎn)率，Ys為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量子產(chǎn)率，F(xiàn)s為蒽的熒光積分強(qiáng)度，As為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在360 nm時(shí)的紫外吸收峰的強(qiáng)度，F(xiàn)u和Au分別為L的熒光積分強(qiáng)度和紫外吸收強(qiáng)度。

圖11 加入不同組合的Fe3+、Cu2+和H+后L在乙腈中的熒光強(qiáng)度Fig.11 Fluorescence intensity of L in acetonitrile upon addition of different combinations of Cu2+,Fe3+and H+

表1 在1.0 μmol·L-1的L的乙腈溶液中加入Fe3+、Cu2+和H+的不同組合時(shí)的量子產(chǎn)率Table 1 Fluorescence quantum yield of L upon addition of different combinations of Fe3+,Cu2+and H+in acetonitrile

規(guī)定量子產(chǎn)率數(shù)值大于0.3時(shí)輸出信號(hào)為1，小于0.3時(shí)輸出信號(hào)為0，即沒有離子存在時(shí)輸出信號(hào)為1；若Fe3+、Cu2+和H+中任何一種離子存在時(shí)，輸出信號(hào)為0，得到L的真值表(表2)。因此，在L溶液中加入不同組合的Fe3+、Cu2+和H+時(shí)滿足NOR邏輯門條件，可構(gòu)建三輸入NOR分子邏輯門(圖12)。

圖12 L的NOR邏輯門循環(huán)示意圖Fig.12 Circulation diagram of NOR logic gate for L

表2 L的NOR邏輯門真值表Table 2 Truth table of NOR logic gate for L

2.7 探針L的識(shí)別機(jī)理研究

探針L對(duì)Fe3+和Cu2+具有較好識(shí)別效果且呈現(xiàn)“開-關(guān)”特性，主要原因是L中包含一個(gè)具有較高量子產(chǎn)率的熒光基團(tuán)蒽，還包含電子給體吡唑上的氮，可向熒光基團(tuán)發(fā)生PET過程；而金屬Fe3+、Cu2+含有空d軌道，當(dāng)L結(jié)合Fe3+、Cu2+后，這2種離子本身又使得熒光基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移到空d軌道，發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移過程或電子轉(zhuǎn)移過程，導(dǎo)致熒光淬滅。另外，根據(jù)軟硬酸堿理論，F(xiàn)e3+、Cu2+在嗎啉環(huán)雜原子配位作用及芳環(huán)上π電子等弱非共價(jià)鍵的協(xié)同作用下能夠被主體很好地識(shí)別，可能是嗎啉環(huán)雜原子作為軟給體原子與軟金屬銅、鐵有強(qiáng)的親和力，分別形成Fe…O與Fe…N、Cu…O與Cu…N的五元環(huán)配合物(Scheme 2)[6,20-22]。隨著Fe3+濃度增加，L熒光強(qiáng)度逐漸降低并發(fā)生紅移，可能是由于吡啶環(huán)上N原子和吡唑環(huán)上N原子同時(shí)參與配位形成穩(wěn)定六元環(huán)配合物，熒光淬滅被抑制。

Scheme 2 L對(duì)Fe3+(a)和Cu2+(b)的識(shí)別機(jī)理Scheme 2 Proposed recognition mechanism of L to Fe3+(a)and Cu2+(b)

3 結(jié) 論

合成了一種熒光分子傳感器嗎啉衍生物(L)，利用1H NMR、13C NMR表征了化合物結(jié)構(gòu)，通過熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜研究了L對(duì)陽離子的識(shí)別性能。結(jié)果表明，探針L對(duì)Fe3+和Cu2+具有較強(qiáng)的選擇性識(shí)別，量子產(chǎn)率分別為0.21和0.14；同時(shí)，L溶液顏色從淡黃色分別變?yōu)樽睾稚退{(lán)色，裸眼可判斷L選擇性識(shí)別Fe3+和Cu2+。L對(duì)Fe3+和Cu2+具有較強(qiáng)識(shí)別的原因，可能是L環(huán)上雜原子與Fe3+/Cu2+配位形成配合物過程中，發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過程導(dǎo)致熒光淬滅，是一個(gè)典型“on-off”開關(guān)熒光化學(xué)傳感器。因此，L有望應(yīng)用于農(nóng)藥檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、工業(yè)傳感、醫(yī)藥科學(xué)、毒品分析、生物學(xué)等領(lǐng)域檢測(cè)鐵離子和銅離子。

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