他克莫司血藥濃度及相關(guān)基因多態(tài)性與心臟移植術(shù)后新發(fā)糖尿病的相關(guān)性*

張敏，蔡杰，張菁，袁擁華，韓勇，周紅

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022)

移植術(shù)后新發(fā)糖尿病(new onset diabetes after transplantation，NODAT)是指患者移植前無糖尿病，移植術(shù)后發(fā)生的糖尿病，是器官移植術(shù)后常見的并發(fā)癥[1]。國際心肺移植學(xué)會(international society of heart and lung transplantation，ISHLT)報告顯示，心臟移植術(shù)后1年內(nèi)NODAT發(fā)病率為23.0%，5年上升至37%[2]。NODAT不僅可導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)、移植物功能減退或喪失，同時也與移植術(shù)后的嚴(yán)重感染和早期心血管并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)，最終影響患者的長期生存，而且是移植術(shù)后的獨立致死因素[1-3]。NODAT與性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、丙肝感染、糖尿病家族史、低鎂血癥和基因易感性等因素相關(guān)[1，3-5]。移植術(shù)后免疫抑制劑的使用也與NODAT的發(fā)生密切相關(guān)。目前，器官移植術(shù)后常用“鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurininhibitors，CNIs，主要是環(huán)孢素和他克莫司)+霉酚酸制劑(mycophenolic acid，MPA)+糖皮質(zhì)激素(glucocorticosteroids，GCs)”的三聯(lián)免疫抑制治療方案，其中，MPA對血糖幾乎無影響，移植術(shù)后由于大劑量GCs引起的短暫血糖升高可隨著GCs劑量的遞減恢復(fù)至正常水平[6]。因此，CNIs成為三聯(lián)免疫治療方案中引起 NODAT 的主要藥物。由于環(huán)孢素肝腎毒性大，目前臨床主要采用他克莫司進(jìn)行治療。然而，他克莫司濃度與NODAT的關(guān)系至今仍不明確。因此，筆者在本研究探究他克莫司血藥濃度與心臟移植術(shù)后NODAT的關(guān)系，旨在為降低他克莫司相關(guān)NODAT發(fā)生風(fēng)險提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 連續(xù)納入2016年6月1日—2018年10月31日于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院接受心臟移植手術(shù)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②接受首次心臟移植手術(shù)；③門診隨訪時間≥12個月；④自愿參與本次研究的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟移植術(shù)前有糖尿病史，降糖藥用藥史，空腹血糖≥7.0 mmol·L-1，血紅蛋白(A1c)≥6.5%患者；②接受聯(lián)合移植的患者，如心肝聯(lián)合移植，心肺聯(lián)合移植等。本研究已獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2資料收集 人口統(tǒng)計學(xué)資料和臨床資料通過查閱電子病歷收集。詳細(xì)記錄患者的以下信息：性別、年齡、BMI、移植術(shù)前診斷、血壓、血脂、吸煙史、低鎂血癥[血清鎂離子(Mg2+)水平<0.74 mmol·L-1][7]、合并他汀類藥物、總膽紅素、血清肌酐、他克莫司劑量和濃度、血糖和降糖方案。肌酐清除率的計算采用Cockcroft-Gault公式：肌酐清除率=(140-年齡)×體質(zhì)量×0.85(女性)÷(72×血清肌酐)[8]。本實驗他克莫司濃度為達(dá)治療窗時的濃度，并計算劑量校正濃度(the dose-adjusted tacrolimus trough concentration，C0/D)以排除給藥劑量、患者體質(zhì)量等因素對血藥濃度影響[9-10]。C0/D=血藥谷濃度/(劑量·體質(zhì)量-1)[(ng·mL-1)/(mg·kg-1·d-1)]。

1.3免疫抑制方案 所有移植受者均接受三聯(lián)免疫抑制治療，包括他克莫司、嗎替麥考酚酯和GCs。他克莫司(商品名：普樂可復(fù)，日本安斯泰來制藥有限公司，進(jìn)口藥品注冊證號：H20090692，規(guī)格：每粒0.5，1 mg)，起始劑量按0.06～0.08 mg·kg-1·d-1(每間隔12 h給藥1次)給藥，根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行劑量調(diào)整。嗎替麥考酚酯(商品名：驍悉，上海羅氏制藥有限公司，進(jìn)口藥品注冊證號：H20040552，規(guī)格：每粒 0.25 g)，按每次1 g，q12h，初始劑量給藥，根據(jù)患者耐受性和移植排斥反應(yīng)發(fā)生情況進(jìn)行劑量調(diào)整。醋酸潑尼松(武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H42021886，規(guī)格：每片 5 mg)，按1 mg·kg-1·d-1(bid)的起始劑量給藥，隨后逐漸減量，維持劑量為10 mg·d-1。

1.4基因位點和基因檢測 采集患者外周血2 mL，存于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，使用Magen核酸提取試劑盒(廣州美基生物技術(shù)有限公司)提取DNA。使用分光光度計(Thermo，Inc.，DE，USA)測定濃度和純度后，將DNA儲存在-80 ℃冰箱中。根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，選擇4個常見的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點[4，10]：rs2237895、rs5215、rs2276706和rs8450。SNPs采用飛行質(zhì)譜法進(jìn)行基因分型(北京六合華大基因科技有限公司)。所有樣品一式三份進(jìn)行分析，并包括陰性和陽性對照以確保結(jié)果的真實性。

1.5診斷標(biāo)準(zhǔn)及隨訪 根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association，ADA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，NODAT定義為移植術(shù)后(≥1個月)出現(xiàn)以下一種或多種情況：①至少2次空腹血糖≥7.0 mmol·L-1；②至少2次隨機(jī)血糖≥11.1 mmol·L-1；③正在接受飲食控制或降糖藥物治療[11]。診斷NODAT應(yīng)在移植術(shù)后至少1個月，以排除因移植術(shù)早期病情不穩(wěn)定、大劑量使用GCs以及感染等引起的短暫性高血糖[6]。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較使用成組設(shè)計資料的t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間比較使用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗進(jìn)行兩組間比較。用χ2分析進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。所有因素先進(jìn)行單因素分析，為避免重要變量的遺漏，將單因素分析中P<0.20的協(xié)變量納入多因素logistic回歸分析，逐步向前回歸分析與NODAT的獨立危險因素，并估算各相關(guān)因素的OR值及其95%置信區(qū)間(CI)。繪制ROC曲線并計算ROC曲線下面積(area under ROC curve，AUROC)以評價NODAT預(yù)測模型的效能。所有檢驗雙側(cè)P值，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者一般情況 本研究共納入心臟移植受者101例，其中NODAT 31例(30.7%)。隨訪中位時間456 d，四分位數(shù)間距(95，785) d，NODAT 3個月，6個月和1年發(fā)病率分別為24.8%，25.7%和29.7%?；颊呋举Y料見表1，NODAT組患者年齡(t=-2.47，P=0.016)和BMI(t=-2.09，P=0.043)顯著高于非NODAT組。其余各項指標(biāo)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2他克莫司血藥濃度與NODAT的關(guān)系 結(jié)果見圖1。NODAT組他克莫司C0/D顯著高于非NODAT組(中位濃度 139.3和96.0，P=0.025，WilcoxonW檢驗統(tǒng)計量=1898.0)。

2.3基因型與NODAT的關(guān)系 基因位點、最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)和Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果表2。四個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。本次研究人群的四個SNPs 位點的MAF與已報道的東亞人群的MAF相近。在研究的4個SNPs位點中，僅NR1I2 rs2276706基因型與NODAT相關(guān)，攜帶G等位基因的患者發(fā)生NODAT的比例顯著高于攜帶A等位基因患者(37.1% 和16.1%，χ2=4.46，P=0.038)，結(jié)果見表3。

2.4NODAT的影響因素及風(fēng)險預(yù)測模型 為進(jìn)一步考察NODAT的影響因素，本研究先對所有因素進(jìn)行單因素分析，再對P<0.20的因素進(jìn)行多因素logistic回歸分析。單因素分析結(jié)果顯示移植時年齡≥45歲、BMI≥25 kg·(m2)-1、高血壓、高脂血癥、他克莫司[C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]和NR1I2基因型的P<0.20。將以上變量納入多因素logistic回歸模型，結(jié)果顯示他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)[OR=4.52，95%CI(1.63，12.53)，P=0.004]、年齡≥45歲[OR=4.99，95%CI(1.65，15.10)，P=0.005]和BMI≥25 kg·(m2)-1[OR=3.70，95%CI(1.38，9.93)，P=0.009]是NODAT的獨立危險因素(表4)。基于以上危險因素構(gòu)建出2個NODAT的臨床預(yù)測模型，并繪制出臨床預(yù)測模型的ROC曲線(圖2)。風(fēng)險預(yù)測模型1納入移植時年齡≥45歲和BMI≥25 kg·(m2)-1兩種危險因素，AUROC為0.738(P<0.001)；風(fēng)險預(yù)測模型2在風(fēng)險預(yù)測模型1的基礎(chǔ)上納入他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)，AUROC提高到0.788(P<0.001)。

表1 兩組患者基本資料比較

圖1 他克莫司血藥濃度與NODAT的關(guān)系

表2 SNPs位點的分布

3 討論

他克莫司血藥濃度與NODAT的關(guān)系尚存爭議，本文探究他克莫司血藥濃度與心臟移植術(shù)后NODAT的關(guān)系，結(jié)果顯示NODAT患者他克莫司濃度顯著高于非NODAT患者，這與國內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果一致[12-15]。

表3 4個SNPs位點與NODAT的關(guān)系

表4 NODAT的獨立危險因素

圖2 NODAT風(fēng)險預(yù)測模型的ROC曲線

目前，很多研究關(guān)注用于判斷NODAT發(fā)生風(fēng)險的他克莫司血藥濃度值，但尚未得出一致結(jié)論。DCASTEDAL等[12]研究發(fā)現(xiàn)他克莫司的致糖尿病作用是劑量依賴性的，濃度高于10 ng·mL-1可增加糖尿病的風(fēng)險。而另一項研究發(fā)現(xiàn)濃度>15 ng·mL-1是新發(fā)糖尿病的危險因素[16]。本文使用他克莫司C0/D排除給藥劑量、患者體質(zhì)量等因素對濃度的影響，首次報道他克莫司C0/D≥110 ng·mL-1per mg·kg-1·d-1可顯著增加NODAT發(fā)生的風(fēng)險。

除了他克莫司血藥濃度，本文還發(fā)現(xiàn)NODAT的其他危險因素有患者的年齡(≥45歲)和BMI[≥25 kg·(m2)-1]。KIM等[3]對391例心臟移植受者的研究也表明年齡>45歲可增加NODAT發(fā)生的風(fēng)險。SHAH等[17]研究發(fā)現(xiàn)，從21歲開始，移植受者的年齡每增加10歲，NODAT的風(fēng)險增加29%。NODAT的風(fēng)險隨著年齡增長而增加，可能與年齡增長導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的功能逐漸減退相關(guān)[14，18]。BMI≥25 kg·(m2)-1是心臟移植術(shù)后NODAT發(fā)生的另一個危險因素，這與國外相關(guān)研究結(jié)果一致[2]。同時，已經(jīng)有研究證實包括控制體質(zhì)量在內(nèi)的生活方式干預(yù)能夠有效治療NODAT[19]。高BMI導(dǎo)致NODAT的機(jī)制可能與肥胖導(dǎo)致2型糖尿病的機(jī)制類似[20]。值得注意的是，本文進(jìn)一步評估他克莫司血藥濃度對NODAT的風(fēng)險預(yù)測能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，他克莫司C0/D[≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]可顯著改善NODAT風(fēng)險預(yù)測模型的預(yù)測效能。

NR1I2基因型在單因素分析中與NODAT相關(guān)，但多因素logistic回歸分析結(jié)果未得出一致結(jié)論。NR1I2編碼的PXR是調(diào)節(jié)他克莫司代謝酶(如CYP3A4和CYP3A5)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21]，其可能通過影響他克莫司血藥濃度而在單因素分析結(jié)果中表現(xiàn)為與NODAT相關(guān)。KCNQ1和KCNJ11均為2型糖尿病的易感基因，兩者也被發(fā)現(xiàn)與NODAT相關(guān)[22-23]。CRTC2調(diào)節(jié)糖代謝并且與腎移植術(shù)后NODAT的發(fā)生相關(guān)[24]。然而，本研究結(jié)果顯示KCNQ1rs2237895、KCNJ11rs5215和CRTC2rs8450位點的基因多態(tài)性與心臟移植術(shù)后NODAT無關(guān)，可能的原因是樣本量較小，因此，未來需要更大樣本的研究進(jìn)一步探討基因多態(tài)性與NODAT的關(guān)系。

綜上所述，他克莫司C0/D[≥110 ng·mL-1/(mg·kg-1·d-1)]、年齡(≥45歲)和BMI[≥25 kg·(m2)-1]是心臟移植術(shù)后發(fā)生NODAT的獨立危險因素。基于以上危險因素建立的NODAT風(fēng)險預(yù)測模型具有較好的預(yù)測能力。該模型中3個危險因素均為易收集的臨床資料，可便捷初步篩選出NODAT高危人群，以便及時干預(yù)。本研究樣本量小，需要開展更大樣本的研究驗證當(dāng)前結(jié)果。在未來，需開展前瞻性、大樣本、多中心的研究以探討更多與NODAT相關(guān)的因素。