恩諾沙星殘留酶聯(lián)免疫分析法的建立

穆洪濤， 李嘉慧， 劉鳳銀， 黃玉琦

（廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 廣東 廣州510303）

0 引言

喹諾酮類抗生素具有抗菌譜范圍廣、殺菌活性高及毒副作用較小的特點(diǎn)，對(duì)水生、陸生動(dòng)物的疾病預(yù)防與治療有良好的效果，因此被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床中［1］. 市場(chǎng)調(diào)研顯示，畜禽類產(chǎn)品中存在檢出喹諾酮類藥物超標(biāo)的現(xiàn)象［2－5］，殘留的藥物被人體攝入后會(huì)產(chǎn)生不良作用［6－9］，因此開發(fā)快速簡(jiǎn)便的喹諾酮類藥物檢測(cè)方法勢(shì)在必行. 目前檢測(cè)喹諾酮類藥物的方法主要有高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析法、膠體金免疫層析法等［10－16］. 色譜法雖然靈敏度高，重復(fù)性強(qiáng)，準(zhǔn)確性強(qiáng)，但對(duì)檢測(cè)樣品的處理要求較高，對(duì)儀器依賴強(qiáng)，不適于大批樣品的快速篩查；免疫法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、快速靈敏等特點(diǎn)，且樣品前處理方法簡(jiǎn)單，適用于大批量樣品的快速檢測(cè). 因此本研究選擇恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星3 種藥物為研究對(duì)象，通過(guò)制備高效的免疫原免疫動(dòng)物獲得抗恩諾沙星抗體，開發(fā)檢測(cè)恩諾沙星的酶聯(lián)免疫分析法.

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 主要試劑與材料

鹽酸恩諾沙星（≥98.0%）、甲磺酸達(dá)氟沙星（≥98.0%）、鹽酸沙拉沙星（≥98.0%）、氧氟沙星（≥98.0%）、環(huán)丙沙星（≥98.0%）、諾氟沙星（≥98.0%）、氟甲喹（≥98.0%）、噁喹酸（≥98.0%）、牛血清白蛋白（BSA，99%）、卵清白蛋白（OVA，99%）、1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，99%）、3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB，99%）、過(guò)氧化脲等，廣州齊云生物技術(shù)有限公司提供； BALB／c 雌性小鼠（3 周）和新西蘭雌性白兔（2 kg），廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供； 其他試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

SP－Max2300A 光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）、RT－3100 全自動(dòng)洗板機(jī)（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）、DK－8AD 電熱恒溫水熱槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、XP.5002 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、MX－F 震蕩儀（SCILOGEX）、PHSI－5 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）.

1.2 人工抗原的合成與鑒定

用紫外分光光度法測(cè)0.5 mg·mL－1ENR－BSA、ENR－OVA 在200 ～800 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)其峰值判斷人工抗原的偶聯(lián)情況.

1.3 動(dòng)物免疫及血清評(píng)價(jià)

1.3.1 BALB／c 雌性小鼠免疫

本研究先選用BALB／c 雌性小鼠（3 周）進(jìn)行腹部皮下和腿部肌肉注射免疫，初次免疫時(shí)使用弗氏完全佐劑與1 mg·mL－1的1.2 合成的ENR－BSA、DAN－BSA、SARA－BSA 等量混合乳化，后續(xù)改用弗氏不完全佐劑作為乳化劑，隔1 周免疫1 次，共進(jìn)行6 次免疫，最后1 次不使用乳化劑乳化，按100 μL／只的劑量給藥.

1.3.2 新西蘭大白兔免疫

選用新西蘭大白兔（2 kg）進(jìn)行背部皮下注射免疫，免疫次數(shù)和乳化方法同1.3.1 所述，所用免疫原為ENR－BSA、DAN－BSA，按1 mL／只的劑量給藥.

1.3.3 血清評(píng)價(jià)

將所得鼠抗血清進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其效價(jià)，以確定是否有抗體產(chǎn)生； 將所得的兔抗血清進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，篩選出高效的特異性強(qiáng)的抗體及檢測(cè)抗原，用于后續(xù)建立icELISA 方法.

1.4 最佳工作條件的優(yōu)化

1.4.1 最佳包被液稀釋度和抗體稀釋度

1）農(nóng)機(jī)裝備水平高。主要表現(xiàn)為裝備標(biāo)準(zhǔn)高，配套農(nóng)具數(shù)量多；科技含量高，自動(dòng)化、智能化、機(jī)電液一體化程度高。

使用棋盤滴定法，對(duì)酶標(biāo)板橫列進(jìn)行劃分，因素為抗體稀釋濃度，同一倍數(shù)設(shè)2 列，使用PBST 溶液按1、2、4、8、16、32 k 倍對(duì)一抗進(jìn)行稀釋； 再對(duì)豎列進(jìn)行劃分，因素為包被原稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)1 橫，使用包被緩沖液按1、2、4、8、16、32、64、128 k 倍對(duì)1 mg·mL－1的包被原進(jìn)行稀釋，進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)合ODmax值和IC50值對(duì)比，確定最佳包被稀釋度及一抗稀釋度.

1.4.2 一抗抗原最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間

在37℃條件下分別競(jìng)爭(zhēng)30、40、50 和60 min，進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)合ODmax值和IC50值對(duì)比，確定一抗抗原最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間.

1.4.3 酶標(biāo)抗體最佳稀釋度

使用PBST 溶液對(duì)酶標(biāo)抗體進(jìn)行3、4、5、6 k 倍稀釋，進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)合ODmax值和IC50值對(duì)比，確定酶標(biāo)抗體最佳稀釋度.

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

設(shè)置恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度梯度為0.05、0.25、1、4、20、100、500 μg·mL－1，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)值為x，實(shí)驗(yàn)所得的OD 值為y，在Origin 8.5 軟件內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對(duì)所得的曲線使用4 參數(shù)對(duì)數(shù)方程進(jìn)行擬合［17］，得到50%抑制值（IC50）和線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）.

1.6 特異性測(cè)試

分析7 種恩諾沙星結(jié)構(gòu)類似物：達(dá)氟沙星（DAN）、沙拉沙星（SARA）、氧氟沙星（OFL）、環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、噁喹酸（OXO）、氟甲喹（FLU）與一抗的交叉反應(yīng)，計(jì)算交叉反應(yīng)率［18］. 計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果

2.1 人工抗原的鑒定

使用碳化二亞胺法將恩諾沙星與BSA 偶聯(lián)作為免疫抗原，與OVA 偶聯(lián)作為包被抗原，紫外吸收光譜圖如圖1 所示. 由圖1 可以看出，經(jīng)過(guò)偶聯(lián)的人工抗原的峰值所在的位置較BSA、OVA 相比往左偏移，且2 種人工抗原所在的吸收光譜各自都在半抗原ENR 和偶聯(lián)蛋白BSA、OVA 之間，由此可以判斷，半抗原ENR 成功偶聯(lián)到載體蛋白BSA、OVA 上.

圖1 ENR、BSA、OVA、ENR－BSA 和ENR－OVA紫外掃描圖譜

2.2 血清評(píng)價(jià)

2.2.1 鼠抗血清

6 組鼠抗血清的效價(jià)結(jié)果如表1 所示，達(dá)氟沙星的效價(jià)最高（1∶125 000），恩諾沙星（1 ∶27 000）其次，均可用于新西蘭大白兔的免疫. 效價(jià)亦稱滴度，指某種抗血清與相應(yīng)的抗原發(fā)生沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)的能力，一般以顯現(xiàn)反應(yīng)的最高稀釋度來(lái)表示.

2.2.2 兔抗血清

2 組兔抗血清的效價(jià)結(jié)果如表1 所示，恩諾沙星效價(jià)較達(dá)氟沙星高，因此使用兔抗恩諾沙星血清來(lái)開發(fā)用于檢測(cè)恩諾沙星的icELISA. 其中，抑制率表示標(biāo)本在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中標(biāo)本對(duì)陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算：

2.3 icELISA 條件的優(yōu)化

棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原稀釋倍數(shù)和一抗稀釋倍數(shù)，單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化一抗抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、二抗稀釋倍數(shù)，通過(guò)ODmax和IC502 個(gè)指標(biāo)參考，從而得出最優(yōu)的條件參數(shù). 其中， ODmax值為標(biāo)本最大吸光值，IC50為半數(shù)抑制濃度.

表1 血清效價(jià)結(jié)果

2.3.1 最佳包被稀釋度及抗體稀釋度的確定

根據(jù)棋盤滴定法設(shè)計(jì)對(duì)包被原和一抗進(jìn)行一系列的梯度稀釋，從中選擇OD 值在1.0 ～1.5 的3 組進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，即A 組（64 000／16 000）、B 組（128 000／8 000）和C 組（32 000／32 000）（包被原稀釋倍數(shù)／一抗稀釋倍數(shù)），最終獲得的ODmax和IC50如表2 所示. 由表2 可知，當(dāng)包被原稀釋1∶64 000，一抗稀釋1∶16 000時(shí)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線ODmax值相對(duì)穩(wěn)定在1.0～1.5 之間，且IC50值相對(duì)較小，因此確定本設(shè)計(jì)使用的icELISA 方法的包被原稀釋1∶64 000，抗體稀釋1∶16 000.

表2 包被原稀釋度及一抗稀釋度的選擇

2.3.2 一抗抗原最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

設(shè)置一抗抗原反應(yīng)時(shí)間（30、40、50 和60 min），進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所得的ODmax和IC50如表3 所示.由表3 可知，一抗抗原反應(yīng)時(shí)間為60 min 時(shí)的IC50相對(duì)較低，且ODmax又相對(duì)穩(wěn)定在1.0～1.5 之間，因此選擇60 min 作為一抗抗原抗的反應(yīng)時(shí)間.

2.3.3 酶標(biāo)抗體最佳稀釋度的確定

設(shè)計(jì)的酶標(biāo)抗體使用PBST 緩沖液稀釋1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 和1∶6 000，進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所得的ODmax和IC50如表3 所示. 由表3 可知，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為5 000 倍時(shí)的IC50相對(duì)較低，且ODmax相對(duì)穩(wěn)定在1.0～1.5 之間，因此選擇酶標(biāo)抗體稀釋1∶5 000 作為酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù).

表3 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間和酶標(biāo)抗體稀釋度的選擇

2.4 icELISA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)合2.3 優(yōu)化的結(jié)果，最終得到本設(shè)計(jì)建立的icELISA 方法的最佳工作條件：使用包被緩沖液將人工抗原ENR－OVA 稀釋1 ∶64 000，在37 ℃恒溫水浴條件下孵育12 h，使用PBST 溶液將一抗稀釋1∶16 000；用PBS 溶液將藥物按0.05、0.25、1、4、20、100、500 μg·mL－1濃度進(jìn)行梯度稀釋，一抗與抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為60 min，使用PBST 溶液將酶標(biāo)抗體稀釋1∶5 000，進(jìn)行icELISA 實(shí)驗(yàn)，按1.5 方法繪制抑制曲線，如圖2 所示，IC50為4.539 μg·mL－1，線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.595～34.632 μg·mL－1.

圖2 抗恩諾沙星抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 交叉反應(yīng)的鑒定

一抗與7 種恩諾沙星結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率如下表4 所示. 由表4 可知，兔抗恩諾沙星血清與CIP、NOR、OFL 都有較高的交叉反應(yīng)率，均超過(guò)100%，與DAN、FLU、OXO 無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，說(shuō)明所建立的icELISA 方法除對(duì)恩諾沙星之外，對(duì)CIP、NOR、OFL、SARA 也有較好的識(shí)別作用，可以實(shí)現(xiàn)這幾種藥物的同時(shí)檢測(cè).

表4 抗ENR 抗體與7 種Qus 的CR

不同的國(guó)家和衛(wèi)生組織根據(jù)自身情況對(duì)檢測(cè)食品中恩諾沙星的殘留情況制定了不同的限量標(biāo)準(zhǔn)［19－20］，具體如表5 所示. 美國(guó)對(duì)恩諾沙星的檢測(cè)要求最高，不允許檢出； 中國(guó)對(duì)恩諾沙星的最大殘留限量要求低于一些國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)，為100 μg·kg－1. 依據(jù)中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，本測(cè)試方法的靈敏度還可以通過(guò)制備相應(yīng)的單克隆抗體建立檢測(cè)方法來(lái)提高.

表5 恩諾沙星的最大限量標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)論

合成并鑒定了人工免疫原和包被原，通過(guò)免疫BALB／c 小鼠初步篩選了可用的免疫原，進(jìn)一步免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體. 人工抗原ENR－OVA 稀釋1∶64 000，在37 ℃恒溫水浴條件下孵育12 h，一抗稀釋1 ∶16 000，一抗與抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)60 min，酶標(biāo)抗體稀釋1∶5 000 時(shí)最佳. 本方法的IC50為4.539 μg·mL－1，線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.595～34.632 μg·mL－1； 與DAN、FLU、OXO 無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，說(shuō)明所建立的icELISA 方法除對(duì)恩諾沙星之外，對(duì)CIP、NOR、OFL、SARA 有較好的識(shí)別作用，可以實(shí)現(xiàn)這幾種藥物的同時(shí)檢測(cè).