氧化苦參堿對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌中Bcl-2及Bax表達(dá)的影響及意義

田琳 何春枝 陳詠麗 董善武

(武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院兒科，湖北 武漢 430000)

臨床醫(yī)學(xué)將由病毒感染導(dǎo)致的心肌組織炎癥病變稱(chēng)為病毒性心肌炎，是一種臨床較為常見(jiàn)的感染性心肌疾病〔1，2〕。病毒性心肌炎主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、倦怠、惡心嘔吐等，隨著病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)胸痛、心悸、呼吸困難等癥狀〔3〕。目前臨床較為常用的治療病毒性心肌炎的手段為使用抗病毒藥物進(jìn)行治療，但治療效果并不十分理想，因此許多專(zhuān)家學(xué)者致力于使用中藥治療病毒性心肌炎的研究。氧化苦參堿是一種廣譜的生物堿，主要提取自苦參、廣豆根，具有抗炎、抑瘤、利尿、調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理作用，臨床用途較廣泛，氧化苦參堿具有神經(jīng)保護(hù)及心肌細(xì)胞保護(hù)作用，但是關(guān)于氧化苦參堿治療病毒性心肌炎的研究還較少〔4，5〕。本研究建立病毒性心肌炎小鼠模型，使用氧化苦參堿干預(yù)，觀察效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取25只SD雄性小鼠〔湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0017〕，3～6月齡，平均(4.5±1.3)月齡，體重212～247 g，平均體重(228.9±12.5)g。小鼠均于干凈籠子內(nèi)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為室溫(22.5±2.6)℃，相對(duì)濕度35%～40%，光照12 h/d，喂養(yǎng)7 d。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機(jī)選取5只小鼠為正常組，不做處理，其余20只小鼠建立病毒性心肌炎模型：使用0.2 ml CVB3病毒稀釋液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射接種，共接種4次，每?jī)纱沃g間隔5 d，第4次接種1 d之后開(kāi)始用藥干預(yù)。正常組與模型組小鼠均使用生理鹽水進(jìn)行干預(yù)；藥物對(duì)照組小鼠使用100 mg/kg利巴韋林溶液進(jìn)行干預(yù)，1次/d；低劑量組小鼠使用6.25 mg/kg氧化苦參堿溶液進(jìn)行干預(yù)，1次/d；高劑量組小鼠使用25 mg/kg氧化苦參堿溶液進(jìn)行干預(yù)，1次/d。各組小鼠均干預(yù)14 d。

1.2.2心功能指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)所有大鼠進(jìn)行麻醉處理，使小鼠保持仰臥位并進(jìn)行固定、剃毛。將小鼠的軀體向左傾斜30°左右，并將多普勒超聲檢測(cè)儀探頭置于小鼠胸骨的左側(cè)，使探頭與小鼠胸骨中線(xiàn)部位保持10～30°夾角，對(duì)心功能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 對(duì)各組小鼠進(jìn)行全麻處理，采用斷頭法處死，取心尖部心肌組織，液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm做連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè) 使用酶法速率法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-8、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；使用免疫透射比濁法檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)水平；使用Western印跡法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F值檢驗(yàn)、單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織病理學(xué)觀察 正常組心肌纖維排列整齊且胞質(zhì)豐富均勻，細(xì)胞間隙正常，無(wú)病理變化；模型組可見(jiàn)多數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且伴有心肌細(xì)胞壞死情況，高劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞壞死情況明顯緩解，心肌纖維數(shù)量增多，心肌損傷獲得改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織病理組織學(xué)觀察(HE，×200)

2.2各組心功能指標(biāo)水平比較 模型組左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)水平高于正常組，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)水平低于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；藥物對(duì)照組、低、高劑量組LVEDd、LVESd水平均低于模型組，LVEF水平高于模型組，且高劑量組LVEDd、LVESd水平均低于藥物對(duì)照組、低劑量組，LVEF水平高于藥物對(duì)照組、低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組LDH、CK-MB、CK水平比較 模型組LDH、CK-MB、CK水平均高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；藥物對(duì)照組、低、高劑量組LDH、CK-MB、CK水平均低于模型組，且高劑量組LDH、CK-MB、CK水平均低于其他兩組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心功能指標(biāo)水平及LDH、CK-MB、CK水平比較

2.4各組IL-8、CRP、TNF-α水平比較 模型組IL-8、CRP、TNF-α水平均高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；藥物對(duì)照組、低、高劑量組IL-8、CRP、TNF-α水平均低于模型組，且高劑量組IL-8、CRP、TNF-α水平均低于其他兩組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5各組MDA、SOD、GSH-Px水平比較 模型組MDA水平高于正常組，SOD、GSH-Px水平低于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；藥物對(duì)照組、低、高劑量組MDA水平低于模型組，SOD、GSH-Px水平高于模型組，且高劑量組MDA水平低于藥物對(duì)照組、低劑量組，SOD、GSH-Px水平高于藥物對(duì)照組、低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組IL-8、CRP、TNF-α、MDA、SOD、GSH-Px水平比較

2.6各組Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 模型組Bcl-2表達(dá)低于正常組，Bax表達(dá)高于正常組；藥物對(duì)照組、低、高劑量組Bcl-2表達(dá)高于模型組，Bax表達(dá)低于模型組，且高劑量組Bcl-2表達(dá)高于藥物對(duì)照組、低劑量組，Bax表達(dá)低于藥物對(duì)照組、低劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

3 討 論

臨床研究表明，病毒性心肌炎癥狀的發(fā)生發(fā)展會(huì)對(duì)患者心功能造成嚴(yán)重的影響，LVEDd、LVESd、LVEF是臨床較為常用的評(píng)價(jià)機(jī)體心功能的指標(biāo)〔6,7〕。本研究結(jié)果說(shuō)明使用氧化苦參堿干預(yù)能夠明顯改善病毒性心肌炎小鼠心功能。

CK、CK-MB、LDH能夠較為直觀、準(zhǔn)確地反映出機(jī)體心肌損傷的程度，其表達(dá)水平的變化與病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CK在機(jī)體心肌及骨骼肌中大量表達(dá)，是較為常用的心血管疾病的診斷指標(biāo)〔8〕；CK-MB作為CK的特異性同工酶，在機(jī)體心肌細(xì)胞中大量表達(dá)〔9〕；LDH作為一種非特異性心肌酶，在心肌組織中大量表達(dá)〔10〕。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎小鼠CK、CK-MB、LDH水平呈現(xiàn)異常高表達(dá)，使用高劑量氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù)后，CK、CK-MB、LDH水平明顯下降，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是使用高劑量氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù)，能夠減輕病毒性心肌炎小鼠心肌組織損傷嚴(yán)重程度，調(diào)控CK、CK-MB、LDH水平。

病毒性心肌炎癥狀的發(fā)生發(fā)展通常會(huì)伴隨機(jī)體炎癥反應(yīng)〔11〕。IL-8水平與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔12〕。CRP主要由肝臟合成的糖蛋白，在人機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)、腫瘤及組織損傷時(shí)，其會(huì)呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)，屬于一種急性期反應(yīng)物，在臨床上常被用作檢測(cè)炎性反應(yīng)及免疫防御功能的標(biāo)志物〔13〕。TNF-α一種多功能炎癥細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在炎癥部位聚集，刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8等因子，從而使機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展伴隨著機(jī)體心肌組織炎癥反應(yīng)。使用高劑量氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù)后，IL-8、CRP、TNF-α水平明顯下降，說(shuō)明使用氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)控IL-8、CRP、TNF-α水平，減輕病毒性心肌炎小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)，從而起到心肌保護(hù)作用。

MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，MDA的異常表達(dá)會(huì)加劇細(xì)胞膜的受損傷程度，還可以影響線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物及線(xiàn)粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性〔15〕。SOD是一種可以對(duì)超氧陰離子的自由基進(jìn)行清除的一種抗氧化酶，在機(jī)體中廣泛存在，是細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能完整性的保護(hù)性酶〔16〕。GSH-Px作為一種重要的過(guò)氧化物酶，能夠?qū)C(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物清除，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整性〔17〕。本研究結(jié)果說(shuō)明氧化苦參堿能夠調(diào)控MDA、SOD、GSH-Px水平，從而起到改善病毒性心肌炎小鼠抗氧化能力、減輕心肌細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重程度的作用。

病毒性心肌炎癥狀的發(fā)生發(fā)展誘發(fā)機(jī)體心肌細(xì)胞凋亡〔18〕。Bcl-2、Bax是線(xiàn)粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，二者表達(dá)水平的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔19,20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明氧化苦參堿能夠?qū)cl-2、Bax的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而起到抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡、減輕心肌受損嚴(yán)重程度的作用。

綜上所述，使用高劑量氧化苦參堿對(duì)病毒性心肌炎小鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠改善小鼠心功能及心肌酶水平，抑制炎癥反應(yīng)，提升抗氧化能力，調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)，減輕小鼠心肌受損嚴(yán)重程度。