茵陳苓桂劑對非酒精性脂肪肝病大鼠脂代謝及氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響

吳迪 楊晉翔 謝春娥 李峰 李軍祥 薛曉軒 王允亮 袁亞利 王乾皓 焦瑤

非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指患者在無過量飲酒史的情況下，肝臟出現(xiàn)以肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥反應(yīng)為主要特征的病理變化，包含多個(gè)病變過程，可由單純性脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎甚至是肝纖維化、肝硬化及肝癌[1]。在世界上，NAFLD的患病率約25%[2]，而目前中國患病率在12.5%～35.4%[3]，引起大家的格外注意。由于NAFLD是多因素所導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前得到大家廣泛認(rèn)可的是“二次打擊學(xué)說”，其中氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是“第二次打擊”的核心機(jī)制[4]。治療上，單種藥物治療機(jī)制比較單一，甚至還具有一定的副作用，中藥可多方面進(jìn)行調(diào)節(jié)，作用于不同的靶點(diǎn)。茵陳苓桂劑以溫運(yùn)清利法為治療大法，臨床研究[5]發(fā)現(xiàn)其對痰濁內(nèi)阻、濕熱瘀結(jié)者具有很好的治療效果，因此本研究通過觀察不同劑量的茵陳苓桂劑對NAFLD模型大鼠脂代謝、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，探討茵陳苓桂劑治療NAFLD的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼料

SPF級雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，均購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。高脂飼料配方為：78.8%基礎(chǔ)飼料+10%蛋黃粉+10%豬油+1%膽固醇+0.2%膽酸鈉，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，許可證號：SCXK(京)2015-0015。

1.2 主要藥物與試劑

茵陳苓桂劑(茵陳18 g、梔子9 g、大黃6 g、茯苓12 g、桂枝9 g、白術(shù)6 g、甘草6 g、絞股藍(lán)15 g、水飛薊12 g)采用中藥配方顆粒，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院。陽性對照藥為：多烯磷脂酰膽堿，賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H20059010。

血清天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)，ELISA測定血清及肝組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)試劑盒均購自南京建成。

1.3 主要儀器

Rm-2235石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司)、OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、全自動生化分析儀(日立，7600)、EG1150H包埋機(jī)(德國萊卡公司)、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)、3K18離心機(jī)(sigma)、Multiskan MK3等。

1.4 動物分組、造模與給藥

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組10只，造模組50只，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，所有大鼠均自由攝食、飲水。第8周末，隨機(jī)處死造模組大鼠2只，取肝組織做病理切片提示造模成功。將造模組大鼠隨機(jī)分為中藥高、中、低劑量組及西藥組，每組10只，剩余為模型組。飼養(yǎng)8周后開始藥物灌胃干預(yù)治療，給藥劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進(jìn)行折算，中藥組給予茵陳苓桂劑，其中低劑量治療組為4.9 g/kg、中劑量治療組為9.8 g/kg、高劑量治療組為19.6 g/kg，西藥組予以多烯磷脂酰膽堿0.15 g/kg，正常組和模型組給予等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本采集與觀察指標(biāo)

末次給藥后禁食24小時(shí)，次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，其中茵陳苓桂劑中劑量組的2只大鼠因不耐受麻醉而死亡。腹主動脈取血，經(jīng)3000 r/min離心15分鐘后，分離出血清，并于-80℃下保存。取出肝臟，將肝組織分出2小塊，1塊置于4%的多聚甲醛液中固定，另1塊-80℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 大鼠一般情況 每天觀察并記錄大鼠的精神狀況、飲食及活動度、毛發(fā)光澤度等一般情況，在自由進(jìn)食和飲水情況下，每周固定稱量大鼠體重1次。

1.5.2 檢測指標(biāo) 取肝組織于4%多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，常規(guī)HE免疫組織化學(xué)染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化情況，NAFLD活動度積分(NAFLD activity score，NAS)參考《中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》[6]。NAS積分(0～8分)：肝細(xì)胞脂肪變：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，百分?jǐn)?shù)四舍五入以整數(shù)計(jì)算方式。小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)：0分，無；1分(<2個(gè))；2分(2～4個(gè))；3分(>4個(gè))。肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。NAS積分為三者之和，小于3分可排除非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，大于4分則可診斷NASH，3～4分為NASH可能。取離心后的血清，使用全自動生化儀檢測大鼠肝酶以及血脂水平，將肝組織勻漿后，按照ELISA試劑盒的說明書測定各組大鼠的血清及肝組織MDA、SOD、GSH-PX的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組NAFLD大鼠的一般情況

正常組大鼠進(jìn)食正常，活動靈敏，毛發(fā)有光澤。模型組大鼠精神萎靡、活動遲緩，毛發(fā)顏色較深、光澤感較差，飲食正常，排泄正常，體重增長較快。與模型組比較，西藥組、中藥各劑量組大鼠精神狀態(tài)、活動量、毛發(fā)光澤度及體重增長情況均有所改善。

2.2 各組NAFLD大鼠肝組織病理觀察

正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝小葉、肝細(xì)胞未見明顯異常；模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪變、氣球樣變，胞質(zhì)內(nèi)可見圓形空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞、炎細(xì)胞浸潤、少許點(diǎn)狀壞死；中藥各劑量組及西藥組大鼠肝細(xì)胞脂肪變、脂肪空泡、肝小葉結(jié)構(gòu)及炎細(xì)胞浸潤均較模型組有不同程度的改善，見圖1。與正常組相比，模型組大鼠肝組織脂肪變性情況、NAS積分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥各劑量組和西藥組大鼠NAS積分均下降(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 茵陳苓桂劑對各組大鼠肝組織脂肪變性及NAS的影響

2.3 各組NAFLD大鼠肝酶及脂代謝情況

模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明顯高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，西藥組與中藥高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均降低(P<0.05或P<0.01)，中藥低劑量組大鼠血清AST、TC顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見表2。

注：A正常組；B模型組；C中藥高劑量組；D中藥中劑量組；E中藥低劑量組；F西藥組

表2 各組NAFLD大鼠血清酶學(xué)及血脂水平比較

2.4 各組NAFLD大鼠血清SOD、GSH-PX、MDA的比較

與正常組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-PX水平顯著降低(P<0.01)，而MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，西藥組與中藥高、低劑量組SOD、GSH-PX均升高(P<0.05，P<0.01)，中藥中劑量組GSH-PX顯著升高(P<0.01)，中藥高劑量組MDA降低(P<0.05)。與西藥組比較，中藥高劑量組GSH-PX顯著升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組NAFLD大鼠血清SOD、GSH-PX、MDA水平比較

2.5 各組NAFLD大鼠肝組織SOD、GSH-PX、MDA的比較

與正常組比較，模型組大鼠肝組織SOD、GSH-PX水平降低(P<0.05)，而MDA水平升高(P<0.05)。與模型組比較，西藥組與中藥高、中、低劑量組GSH-PX均顯著升高(P<0.01)，西藥組與中藥高劑量組SOD水平升高(P<0.01)，而只有中藥高劑量組MDA水平降低(P<0.05)。與西藥組比較，中藥高劑量組GSH-PX水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組NAFLD大鼠肝組織SOD、GSH-PX、MDA水平比較

3 討論

人體脂質(zhì)代謝在肝臟內(nèi)最為活躍，而脂肪肝是肝臟易發(fā)疾病，防治脂肪肝不僅僅對肝臟有益，而且對心血管也極為重要。在發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化是NAFLD“第二次打擊”中主要影響因素，肥胖、代謝紊亂、藥物等各種原因?qū)е轮x異常，使過多脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)堆積形成脂肪性病變，在此基礎(chǔ)上引起氧化應(yīng)激，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化和肝臟抗氧化能力失常。氧化應(yīng)激過程中可產(chǎn)生更多的活性氧自由基，活性氧自由基對肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)及蛋白質(zhì)進(jìn)一步氧化，改變肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加重肝細(xì)胞的炎癥滲出和壞死，使NAFLD進(jìn)一步惡化[7-8]。

脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一是脂質(zhì)過氧化物(如MDA)，其水平的高低與脂質(zhì)過氧化程度成正比，MDA可以引起炎癥，又可以促進(jìn)活性氧自由基的形成。在機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中，SOD與GSH-PX具有重要作用，均可有效的分解過氧化物、脂質(zhì)過氧化物，中止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，二者水平的高低代表著機(jī)體清除氧自由基的能力[9]。SOD、GSH-PX與MDA在機(jī)體內(nèi)保持平衡，若機(jī)體的氧自由基產(chǎn)生和消除失衡，便可導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)蓄積，當(dāng)MDA異常升高時(shí)，便超出了SOD及GSH-PX的清除能力，不能保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷，便發(fā)生肝細(xì)胞脂質(zhì)過度氧化，損傷線粒體、溶酶體，最終加重肝細(xì)胞脂肪變、炎癥壞死，加速了向肝纖維化、肝硬化的轉(zhuǎn)變[10-12]。

中醫(yī)將NAFLD歸屬為“癥瘕”“積聚”“肝痞”“脅痛”“痰濁”“肥氣”等范疇。其病因病機(jī)多與外感寒邪、過食肥甘、勞逸失常，情志失調(diào)，肝腎虧虛等有關(guān)。根據(jù)中醫(yī)理論，認(rèn)為本病病位在肝，與脾腎有關(guān)，肝失疏泄、脾運(yùn)化障礙，日久傷腎，導(dǎo)致氣血運(yùn)行受阻、痰濕不化，因此形成病理產(chǎn)物痰、濕、熱、瘀相互搏結(jié)于肝臟，主要病機(jī)關(guān)鍵為痰濁內(nèi)阻、濕熱瘀結(jié)[13-14]。茵陳苓桂劑由茵陳蒿、梔子、大黃、茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草、絞股藍(lán)等組成，方中茵陳蒿清熱祛濕、疏肝利膽；茯苓、白術(shù)健脾祛濕；絞股藍(lán)、梔子、水飛薊利濕化痰、清熱解毒、疏利肝膽；桂枝溫陽化氣利水；大黃瀉熱逐瘀；甘草益氣和中、調(diào)和諸藥。全方既有溫補(bǔ)，又有清泄，共湊溫化痰濁、清利濕熱、祛除瘀結(jié)之效，使脾氣健旺，肝膽疏泄，氣血調(diào)暢，陽氣得運(yùn)，化痰濕，祛瘀阻[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平較正常組顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，西藥組與中藥高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均降低，中藥低劑量組大鼠血清AST、TC顯著降低(P<0.05或P<0.01)。氧化應(yīng)激指標(biāo)方面，與正常組比較，模型組大鼠血清、肝組織SOD、GSH-PX水平降低，而MDA水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，西藥組與中藥中、低劑量組血清與肝組織GSH-PX均升高(P<0.01)，西藥組與中藥低劑量組血清SOD升高(P<0.05)，而西藥組肝組織SOD升高(P<0.01)，中藥高劑量組血清、肝組織MDA降低，GSH-PX及SOD水平升高(P<0.05或P<0.01)。與西藥組比較，中藥高劑量組血清、肝組織GSH-PX顯著升高(P<0.01)。肝組織病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，各給藥組肝組織脂肪變、炎細(xì)胞浸潤、肝小葉結(jié)構(gòu)均有所改善，NAS積分降低(P<0.05或P<0.01)。

由此可見，茵陳苓桂劑可有效調(diào)節(jié)NAFLD大鼠的血脂和肝酶，降低大鼠血清、肝組織MDA水平，提高SOD、GSH-PX活性，因此能保護(hù)肝功能，調(diào)節(jié)脂代謝，改善肝臟病理損傷，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化能力，提示其調(diào)節(jié)氧化-抗氧化系統(tǒng)的能力可能是茵陳苓桂劑治療NAFLD的作用機(jī)制之一，臨床上的治療效果可能與上述作用有關(guān)。