椰子油降解菌的篩選及降解條件優(yōu)化

黃懷興，鄧毛程，李靜，吳林杰，蔡亮，王富程，黃潔華，林鏗淳，廖民聰

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州，510300)

椰蓉是椰肉榨汁后的副產(chǎn)物，油脂、蛋白質(zhì)、膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.6%、4.2%和23.2%[1]。研究表明，膳食纖維具有增加飽腹感、促進(jìn)腸道消化、預(yù)防便秘、降低血糖、降低血清膽固醇等功效，被譽(yù)為“第七大營(yíng)養(yǎng)素”[2-4]。椰子蛋白中氨基酸種類有18種，包含了人體必需的8種氨基酸，具有降血脂、降低膽固醇、提高免疫力等功效[5-8]。因此，椰蓉具有極高的綜合利用價(jià)值。

據(jù)調(diào)查，由于人們過(guò)多地?cái)z入脂肪、糖分等高能量物質(zhì)，我國(guó)超重、肥胖的成年人比例超過(guò)30%[9]，控制體重用配方食品已成為一類重要食品[10]。膳食纖維和蛋白質(zhì)是控制體重用配方食品的兩大基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11-12]，椰蓉若經(jīng)過(guò)脫脂處理，將成為控制體重用配方食品的優(yōu)質(zhì)原料。椰蓉脫脂方法有化學(xué)法、酶法和發(fā)酵法，其中化學(xué)法是最常用的方法[13-14]，采用化學(xué)法容易產(chǎn)生有機(jī)溶劑殘留的現(xiàn)象，而采用酶法和發(fā)酵法則相對(duì)安全。目前已有一些關(guān)于油脂生物降解的研究報(bào)道[15-18]，但能否應(yīng)用于椰蓉脫脂，關(guān)鍵在于菌種是否被允許用于食品領(lǐng)域。本研究擬篩選具有食品安全性的椰子油降解菌種，并分析該菌種的降解特性，為椰蓉脫脂以及綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種篩選材料：自然發(fā)酵5 d的椰漿；椰子油，菲律賓椰來(lái)香精煉食用椰子油；蛋白胨、酵母膏、瓊脂，市售生化試劑；正己烷、尿素、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、(NH4)2SO4等，市售分析純?cè)噭痪酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)引物和基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；Taq脫氧核糖核酸聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸，大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱，，濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-C2112F雙層可編程恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，廣州市康恒儀器有限公司；S-3000N掃描電鏡，日本日立公司； TprofessionalPCR儀，德國(guó)Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀，美國(guó)Syngene公司。

1.3 馴化培養(yǎng)與平板分離

馴化培養(yǎng)基(g/L)：椰子油50，酵母膏10，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調(diào)節(jié)pH 6.0。馴化培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，接入10%(體積分?jǐn)?shù))的自然發(fā)酵椰漿，于28 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)96 h，再轉(zhuǎn)接入新鮮的馴化培養(yǎng)基。重復(fù)操作馴化培養(yǎng)2次。

平板分離培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，牛肉膏10，氯霉素0.1，瓊脂 20，調(diào)節(jié)pH 6.0。制作平板后，將無(wú)菌的椰子油涂布在平板上，再將馴化培養(yǎng)液的稀釋液涂布于平板上，置于28 ℃下培養(yǎng)72 h。

斜面培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)。用接種針挑取平板上60個(gè)單菌落，分別接入斜面培養(yǎng)基，于28 ℃下培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌苔，置于4 ℃冰箱保藏備用。

1.4 搖瓶篩選

搖瓶篩選培養(yǎng)基(g/L)：椰子油40，酵母膏5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調(diào)節(jié)pH 6.0。搖瓶篩選培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，分別接入60株斜面菌種，置于28 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)120 h。然后，測(cè)定培養(yǎng)液中油脂殘余量，計(jì)算椰子油降解率，優(yōu)選出降解率最高的菌株。

1.5 菌種鑒定

觀察優(yōu)選菌株的菌落形態(tài)，并利用掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。按文獻(xiàn)提供的方法[19-21]，用氯仿-異戊醇法提取該菌種的DNA，采用通用引物NL1 (5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)和NL4 (5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)，用PCR擴(kuò)增26S rDNA的D1/D2區(qū)域。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板 2 μL，引物NL1/NL4(10 μmol/L)各2 μL，2×Tap PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃變性1 min，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36次，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)后，送至測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并使用軟件MEGA6.0以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 不同氮源優(yōu)選試驗(yàn)

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，酵母膏10，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 6.0。滅菌、冷卻后，接入斜面菌種，于28 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)20 h。

氮源篩選培養(yǎng)基(g/L)：椰子油40，不同氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl 5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 0.5，調(diào)節(jié)pH 6.0。分別以不同氮源配制培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后，接入10%的種子培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù))，于28 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)120 h，優(yōu)選最佳氮源。

1.7 氮源用量?jī)?yōu)選試驗(yàn)

以最佳氮源配制椰子油降解培養(yǎng)基，該氮源的添加量分別為2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 g/L，調(diào)節(jié)pH 6.0，按1.6所述方法進(jìn)行接種以及培養(yǎng)，優(yōu)選氮源的最佳添加量。

1.8 添加其他碳源試驗(yàn)

按照氮源最佳的復(fù)配方案配制椰子油降解培養(yǎng)基，分別添加0、2.5、5、7.5、10 g/L的葡萄糖、檸檬酸鈉，調(diào)節(jié)pH 6.0，按1.6所述方法進(jìn)行接種以及培養(yǎng)，優(yōu)選最佳的外加碳源及用量。

1.9 油脂殘余量測(cè)定

參照文獻(xiàn)油脂提取方法[22]，用等體積的氯仿對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行萃取2次，取下層溶液，用0.2 μm有機(jī)濾膜抽濾，除去菌體，獲取萃取液，70 ℃下加熱蒸發(fā)去除氯仿，得到殘余油脂。稱量殘余油脂質(zhì)量，計(jì)算椰子油降解量以及降解率。

1.10 生物量測(cè)定

將離心分離所得的菌體置于105 ℃的烘箱中，干燥至恒重，稱量質(zhì)量，計(jì)算發(fā)酵液中的干菌體濃度[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

經(jīng)搖瓶篩選，60個(gè)菌株對(duì)椰子油降解率的分布為2.78%～63.75%，有7個(gè)菌株的降解率>50%，如圖1所示。其中，菌株YD22在60個(gè)菌株中的椰子油降解率最高，故優(yōu)選為進(jìn)一步研究的對(duì)象。該菌株的菌落如圖2所示，菌落呈乳白色，邊緣不整齊，表面干燥而呈現(xiàn)出皺褶。利用普通顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌體，如圖3所示，菌體呈現(xiàn)橢圓型，有芽體，具有酵母形態(tài)特征。

將菌種YD22的26S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在線數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌與很多解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)的相似度達(dá)到99%。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示，菌種YD22與YarrowialipolyticaZIM 2416(NCBI登錄號(hào)HE660067.1)的親緣關(guān)系最近，故被鑒定為解脂亞羅酵母。解脂亞羅酵母具有常見釀酒酵母不具備的特性，通常被用于檸檬酸、異檸檬酸、蛋白酶、脂肪酶、芳香型化合物、二元羧酸、單細(xì)胞油脂、生物表面活性劑等生物合成的研究[24-25]。解脂亞羅酵母能夠廣泛利用糖類、醇類以及一些疏水性化合物作為碳源，近年來(lái)又經(jīng)常被用于油脂污染廢水生物修復(fù)、油作物廢料綜合利用等領(lǐng)域[26-27]，菌種YD22所具有的椰子油降解性能與這些研究結(jié)果是一致的。另外，解脂亞羅酵母被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)為是具有食品安全性的微生物[28]。

圖1 降解率大于50%的菌株Fig.1 Strains of degradation rate above 50%

圖2 菌種YD22的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain YD22

圖3 菌種YD22的電子顯微鏡掃描照片(×10 000)Fig.3 Scanning electronmicroscope(SEM) photograph of strain YD22

圖4 菌種YD22的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YD22

2.2 不同氮源對(duì)降解的影響

如圖5所示，椰子油降解率與生物量呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。當(dāng)環(huán)境條件和生長(zhǎng)階段相同時(shí)，菌體對(duì)椰子油具有比較穩(wěn)定的比利用速率，單位體積內(nèi)菌體量越大，椰子油的利用率也越大。因此，較大的生物量可以促進(jìn)椰子油降解。已有研究表明，酵母浸粉、玉米漿等有機(jī)氮源不僅含有微生物生長(zhǎng)所需的氮素物質(zhì)，還含有比較豐富的生長(zhǎng)因子，對(duì)酵母增殖有利[29-30]。從圖5可以看出，有機(jī)氮源在促進(jìn)酵母增殖和椰子油降解等方面的效果明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。其中，以酵母膏為氮源時(shí)，生物量與椰子油降解率最大，故選擇酵母膏作為最佳氮源。

圖5 不同氮源對(duì)椰子油降解的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on degradation of coconut oil

2.3 酵母膏用量對(duì)降解的影響

以不同用量的酵母膏配制培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。在一定范圍內(nèi)，隨著酵母膏用量的增加，生物量與椰子油降解率均呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢(shì)。再次證明，椰子油降解與酵母增殖具有一定相關(guān)性，適當(dāng)增加酵母膏用量，有利于促進(jìn)酵母增殖，從而可以提高椰子油降解率。當(dāng)酵母膏質(zhì)量濃度增加至10 g/L時(shí)，氮源已不是微生物生長(zhǎng)與代謝的限制因素，此時(shí)的椰子油降解率與生物量趨于最大，繼續(xù)增大酵母膏用量，對(duì)酵母增殖和椰子油降解的影響微弱。因此，酵母膏的最佳用量選擇為10 g/L。

圖6 酵母膏用量對(duì)椰子油降解的影響Fig.6 Effect of yeast extract dosage on degradation of coconut oil

2.4 外加碳源對(duì)降解的影響

在培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖和檸檬酸鈉，結(jié)果如圖7和圖8所示。葡萄糖和檸檬酸鈉是容易利用碳源，它們被適量添加后，能夠優(yōu)先被酵母利用，對(duì)促進(jìn)酵母增殖與椰子油降解具有一定作用。但是，在無(wú)外加碳源的培養(yǎng)基中，最終pH值下降至3.75，說(shuō)明培養(yǎng)后期的pH已經(jīng)不適宜酵母菌代謝。葡萄糖是生理酸性物質(zhì)，添加量過(guò)大時(shí)，會(huì)引起pH較大幅度下降，對(duì)酵母進(jìn)一步增殖和生理代謝反而不利。從圖7可以看出，葡萄糖用量不宜過(guò)大，當(dāng)葡萄糖用量為5 g/L時(shí)，生物量和椰子油降解率達(dá)到最高，干菌體質(zhì)量濃度為20.15 g/L，椰子油降解率為76.54%。檸檬酸鈉是生理堿性物質(zhì)，其代謝會(huì)引起pH上升，將對(duì)椰子油代謝所引起pH下降具有一定的調(diào)節(jié)作用。從圖8可以看出，隨著檸檬酸鈉用量逐漸增加，生物量和椰子油降解率也逐漸增大。當(dāng)檸檬酸鈉用量為7.5 g/L時(shí)，干菌體質(zhì)量濃度和椰子油降解率達(dá)到最大，分別為22.49 g/L和85.76%。而后，檸檬酸鈉用量繼續(xù)增加時(shí)，生物量和椰子油降解率反而下降。在質(zhì)量濃度為10 g/L檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中，雖然最終pH值顯示為6.12，但是，檸檬酸鈉被利用過(guò)程中的pH卻超過(guò)了8.0，對(duì)酵母產(chǎn)生了抑制作用。通過(guò)比較無(wú)外加碳源、添加葡萄糖、添加檸檬酸鈉的降解效果，優(yōu)選質(zhì)量度為7.5 g/L 檸檬酸鈉為最佳外加碳源，其降解率是無(wú)外加碳源的1.2倍。在已報(bào)道的一些油脂降解研究中[15-16,31]，油脂初始質(zhì)量濃度通常低于10 g/L，油脂降解率一般低于80%。與這些已知的油脂降解菌相比，本實(shí)驗(yàn)的椰子油初始質(zhì)量濃度與降解率較高。

圖7 葡萄糖用量對(duì)椰子油降解的影響Fig.7 Effect of glucose dosage on degradation of coconut oil

圖8 檸檬酸鈉用量對(duì)椰子油降解的影響Fig.8 Effect of sodium citrate dosage on degradation of coconut oil

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵椰漿中，篩選獲得1株椰子油高效降解菌株YD22。經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)與26S rDNA鑒定，該菌株被確定為解脂亞羅酵母。菌種YD22對(duì)椰子油的降解率與其生物量具有相關(guān)性，生物量越高，越有利于微生物降解椰子油。在氮源篩選試驗(yàn)中，酵母膏對(duì)酵母增殖和椰子油降解的促進(jìn)作用最顯著，被優(yōu)選為最佳氮源，其最佳用量為10 g/L。在酵母膏為氮源的椰子油培養(yǎng)基中，適量添加葡萄糖和檸檬酸鈉，可提高生物量和椰子油降解率。其中，在40 g/L椰子油培養(yǎng)基中，添加7.5 g/L檸檬酸鈉時(shí)，椰子油降解效果最好，降解率達(dá)到85.76%，明顯高于無(wú)外加碳源的培養(yǎng)基。與已知的油脂降解菌相比，菌種YD22是可用于食品的菌種，且對(duì)椰子油具有很強(qiáng)的降解能力，在食品工業(yè)中具有應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，氮源和外加碳源的研究結(jié)果，為油脂降解領(lǐng)域的研究與生產(chǎn)提供參考。