冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗AsA-GSH 循環(huán)的調(diào)控效應(yīng)研究

李進(jìn)，翟夢(mèng)華，于春欣，王莉，張軍高，周小云，梁晶，段留生*，雷斌*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/ 農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心，北京100193）

棉花（Gossypium hirsutum L.）是新疆重要的經(jīng)濟(jì)作物，2019 年種植面積為254.05 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)為500.20 萬(wàn)t， 分別占全國(guó)棉花種植面積和總產(chǎn)的76.0%和84.9%，已然形成了“世界棉花看中國(guó)，中國(guó)棉花看新疆”的格局。 新疆棉花規(guī)?；?、機(jī)械化和集約化發(fā)展的同時(shí)面臨諸多問(wèn)題，尤其是苗期“倒春寒”和低溫冷害造成的死苗問(wèn)題亟待解決[1-3]。 因此，探索棉花苗期防災(zāi)減災(zāi)和抗低溫技術(shù)手段是現(xiàn)階段新疆棉花提質(zhì)增效研究中必不可少的內(nèi)容，也對(duì)新疆棉花產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量持續(xù)健康發(fā)展具有理論指導(dǎo)和實(shí)踐意義。

低溫脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）， 引起膜脂過(guò)氧化程度增加，造成膜系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致植物生理生化代謝紊亂，嚴(yán)重抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育[4-6]?？箟难?谷胱甘肽（Ascorbate-glutathione, AsA-GSH）循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除活性氧的重要途徑，抗氧化物質(zhì)和酶類共同參與植物細(xì)胞中ROS 清除[7-9]。 已有研究表明， 低溫脅迫下2, 4- 表油菜素內(nèi)酯（2,4-Epibrassinolide, EBR） 和5- 氨 基 乙 酰 丙 酸（5-Aminolevulinic acid,ALA）能顯著提高辣椒幼苗保護(hù)酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)含量[10-11]，水楊酸（Salicylic acid,SA）也可以誘導(dǎo)枇杷[12]和甜瓜[13]組織內(nèi)抗氧化酶活性升高，激活組織中AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)，提高植株耐低溫性能，緩解低溫脅迫對(duì)植株造成的傷害，但研究主要集中在果蔬等特色小宗經(jīng)濟(jì)作物上。

冠菌素（Coronatine, COR）是丁香假單胞菌分泌的1 種代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與茉莉酸類（Jasmonic acid, JA）相似，且生物活性是JA的100～10 000 倍， 具有調(diào)控作物生長(zhǎng)和提高作物抗逆性的作用[14-16]。 研究表明，冠菌素可以增強(qiáng)冬小麥耐旱性和抗高溫性[17-18]，提高水稻抗旱性[19]和玉米抗冷性[20]，緩解棉花苗期鹽脅迫[21-23]。 然而現(xiàn)階段研究緩解棉花幼苗低溫脅迫的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要集中在EBR 和SA 上，研究?jī)?nèi)容多為幼苗生長(zhǎng)、光合熒光特性、酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等方面[24-26]，外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控低溫脅迫下棉花幼苗AsA-GSH 循環(huán)代謝研究較少，尤其是根、莖、葉中同時(shí)研究的更少見(jiàn)。 基于此，本研究以新陸早57 號(hào)為試驗(yàn)材料， 冠菌素為供試植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，4 ℃/4 ℃（晝/ 夜）為低溫脅迫溫度，25 ℃/25 ℃（晝/ 夜）為對(duì)照溫度，研究冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗根、 莖和葉AsA-GSH 循環(huán)中抗氧化物質(zhì)含量、 氧化還原狀態(tài)和抗氧化酶活性的變化規(guī)律， 揭示冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗的調(diào)控效應(yīng)， 豐富棉花耐低溫機(jī)理和高產(chǎn)栽培理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花品種為新陸早57 號(hào)， 由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供；供試植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為冠菌素，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心提供； 基質(zhì)為丹麥品氏基質(zhì)（PINDSTRUP），營(yíng)養(yǎng)缽為育苗營(yíng)養(yǎng)缽（規(guī)格：下底直徑×上口直徑×高度：6 cm×8.5 cm×10 cm），基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)缽購(gòu)于新疆明珠花卉市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年2—10 月在農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （烏魯木齊）進(jìn)行。 挑選籽粒飽滿、大小均勻的棉花種子，75%酒精消毒120 s，無(wú)菌水沖洗3 次，將棉種播于裝滿基質(zhì)的育苗營(yíng)養(yǎng)缽中， 每缽9 粒種子， 共計(jì)100缽。 幼苗頂土前用農(nóng)用地膜封口，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照強(qiáng)度：100 μmol·m－2·s－1，光暗周期為14 h/10 h， 溫度：28 ℃/22 ℃， 相對(duì)濕度：70%～75%），子葉平展時(shí)每缽定苗4 株，每天補(bǔ)充適量蒸餾水，長(zhǎng)至2 葉期舍棄長(zhǎng)勢(shì)較差且不整齊的營(yíng)養(yǎng)缽，篩選長(zhǎng)勢(shì)較好且整齊一致的幼苗進(jìn)行處理。 本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 個(gè)處理：噴施清水常溫處理（CK），噴施冠菌素常溫處理（COR），噴施清水低溫處理（LT）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR），其中低溫處理為4 ℃/4 ℃（晝/ 夜），常溫處理為25 ℃/25 ℃（晝/ 夜）， 冠菌素濃度參考Xie 等[21-23]在棉花中確定的最適濃度（0.01 μmol·L－1）。 CK 和LT 處理噴施等體積清水，噴施時(shí)保證霧滴在葉片正反表面均勻分布，且不超過(guò)流失點(diǎn)， 每個(gè)處理重復(fù)3 次。 噴施結(jié)束后將CK 和COR 處理置于1 個(gè)培養(yǎng)箱（溫度：25 ℃/25 ℃），LT 和LT＋COR 處理置于另1 個(gè)同款培養(yǎng)箱（溫度：4 ℃/4 ℃）。處理1 d 后采集4 個(gè)處理根、莖和葉樣品，測(cè)定生理指標(biāo)。 試驗(yàn)期間每個(gè)處理其他環(huán)境條件及培養(yǎng)措施均一致。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

取各處理2 葉期棉花幼苗植株，自來(lái)水沖洗表面殘留基質(zhì)等雜質(zhì)后再用蒸餾水迅速清洗3次，濾紙吸干表面水漬，用剪刀從每株棉花幼苗子葉節(jié)處剪開(kāi)（根選取子葉節(jié)以下部位，莖選取子葉節(jié)以上主干部位，葉片選取第2 片真葉）。 各處理根、莖或葉采集樣品均為15 株混合樣，每處理約1.0 g，重復(fù)3 次，合計(jì)約3.0 g。 錫箔紙包好標(biāo)記后迅速放入裝有液氮的泡沫箱中，經(jīng)液氮速凍后保存于－80 ℃冰箱中用于測(cè)定還原型抗壞血酸（Reduced ascorbic acid,AsA）、氧化型抗壞血酸 （Dehydroascorbate,DHA）、 還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione, GSH） 和氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione, GSSG）含量，計(jì)算抗壞血酸含量、還原型和氧化型抗壞血酸的含量比（本文用AsA/DHA 表示）、谷胱甘肽含量、還原型和氧化型谷光甘肽的含量比（本文用GSH/GSSG 表示）；測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）、單脫氫抗壞血酸還原 酶 （Monodehydroascorbate reductase, MDHAR）、 脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase, DHAR）、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPX） 和谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase,GR）活性。

準(zhǔn)確稱取4 個(gè)處理根、 莖和葉樣品各0.1 g，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司研發(fā)的各指標(biāo)試劑盒提取樣品的上清液，置于冰盒內(nèi)待測(cè)。 W為鮮樣本質(zhì)量（g），Cpr為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg·mL－1）。

1.3.1 AsA 含量。 按照AsA 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：AsA-1-W） 說(shuō)明書配制空白管和測(cè)定管待測(cè)液，靜置20 min 后吸取200 μL 加入96 孔板中，酶標(biāo)儀在420 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)測(cè)和A空，△A＝A測(cè)－A空。 計(jì)算公式：AsA 含量（μmol·g－1）＝227.27×（△A＋0.018）÷W。

1.3.2 DHA 含量。 按照DHA 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：DHA-1-W） 說(shuō)明書配制空白管和測(cè)定管待測(cè)液，迅速混勻后在265 nm 處測(cè)定10 s 和130 s 吸光值A(chǔ)空1、A空2和A測(cè)1、A測(cè)2，△A空＝A空2－A空1，△A測(cè)＝A測(cè)2－A測(cè)1。 計(jì) 算 公 式：DHA 含 量（μmol·g－1）＝100×△A測(cè)÷△A空÷W。

1.3.3 GSH 含量。 按照GSH 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：GSH-1-W） 說(shuō)明書配制空白管和測(cè)定管待測(cè)液。混勻靜置2 min 后在412 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)空和A測(cè)。 計(jì) 算 公 式：GSH 含 量 （nmol·g－1）＝1.334×（A測(cè)－A空）÷W。

1.3.4 GSSG 含量。 按照GSSG 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：GSSG-1-W）說(shuō)明書配制待測(cè)混合液。 混勻后在412 nm 處測(cè)定30 s 和150 s 吸光值A(chǔ)1和A2，△A＝A2－A1。計(jì)算公式：GSSG 含量（nmol·g－1）＝72.46×（△A＋0.001 1）÷W。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。 按照蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：BCAP-1-W）說(shuō)明書配制空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管待測(cè)液，60 ℃保溫30 min 后加入96 孔板在562 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)，分別記為A空、A標(biāo)和A測(cè)。 計(jì)算公式：Cpr（mg·mL－1）＝0.5×（A測(cè)－A空）÷（A標(biāo)－A空）。

1.3.6 APX 活性。 按照APX 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：APX-1-W） 說(shuō)明書配制待測(cè)液， 迅速混勻后在290 nm 處 測(cè) 定10 s 和130 s 吸 光 值A(chǔ)1和A2，△A＝A1－A2。 計(jì)算公式：APX 活性（μmol·min－1·mg－1）=3.58×△A÷Cpr。 以25 ℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol AsA 為1 個(gè)酶活單位。

1.3.7 MDHAR 活性。按照MDHAR 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：MDHAR-1-W）說(shuō)明書配制待測(cè)液，迅速混勻后在340 nm 處測(cè)定30 s 和150 s 吸光值A(chǔ)1和A2，△A ＝A1－A2。 計(jì) 算 公 式：MDHAR 活 性（nmol·min－1·mg－1）=1 608×△A÷Cpr。 以25 ℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol NADH 為1 個(gè)酶活單位。

1.3.8 DHAR 活性。按照DHAR 測(cè)定試劑盒（貨號(hào):DHAR-1-W）說(shuō)明書配制待測(cè)液，迅速混勻后在265 nm 處測(cè)定30 s 和150 s 吸光值A(chǔ)1和A2，△A＝A2－A1。 計(jì)算公式：DHAR 活性 （nmol·min－1·mg－1）＝184×△A÷Cpr。 以25 ℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1 nmol AsA 為1 個(gè)酶活單位。

1.3.9 GPX 活性。 按照GPX 測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：GPX-1-W） 說(shuō)明書配制空白管和測(cè)定管待測(cè)液，迅速混勻后在340 nm 處測(cè)定10 s 和190 s 吸光值A(chǔ)空1、A空2和A測(cè)1、A測(cè)2，△A空＝A空1－A空2，△A測(cè)＝A測(cè)1－A測(cè)2。計(jì)算公式：GPX 活性（nmol·min－1·mg－1）＝1 072×（△A測(cè)－△A空）÷Cpr。 以25 ℃中每毫克蛋白每分鐘催化1 nmol NADPH氧化為1 個(gè)酶活單位。

1.3.10 GR 活性。 按照GR 測(cè)定試劑盒 （貨號(hào)：GR-1-W）說(shuō)明書配制空白管和測(cè)定管待測(cè)液，迅速混勻后在340 nm 處測(cè)定10 s 和190 s 吸光值A(chǔ)空1、A空2和A測(cè)1、A測(cè)2，△A空＝A空1－A空2，△A測(cè)＝A測(cè)1－A測(cè)2。 計(jì)算公式：GR 活性（nmol·min－1·mg－1）＝1 072×（△A測(cè)－△A空）÷Cpr。 以25 ℃和pH 8.0 條件下每毫克蛋白每分鐘催化1 nmol NADPH 氧化為1 個(gè)酶活單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，SPSS Statistics 25.0 軟 件 進(jìn) 行 方 差 分 析 （P ＜0.05）， 鄧肯氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗抗壞血酸代謝酶活性的影響

圖1A 顯示，噴施冠菌素常溫處理（COR）與噴施清水常溫處理 （CK） 相比， 棉花幼苗根中APX 活性無(wú)顯著性差異， 莖中APX 活性顯著高于CK，葉中APX 活性與CK 差異不顯著。 噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗根中APX 活性與CK 無(wú)顯著性差異，莖和葉中APX 活性較CK 顯著降低8.93%和5.67%。 噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根中APX 活性較LT 無(wú)顯著性差異，莖中APX 活性顯著高于LT，而葉中APX 活性較LT 有所升高，但差異不顯著。 說(shuō)明低溫脅迫抑制了棉花幼苗莖和葉中APX 活性，噴施COR 可提高莖和葉中APX 活性。

圖1 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官APX、MDHAR 和DHAR 活性的影響Fig. 1 Effects of coronatine on APX, MDHAR and DHAR activities in the vegetative organ of cotton seedling under low temperature stress

由圖1B 可以看出， 噴施冠菌素常溫處理（COR）后棉花幼苗根、莖和葉中MDHAR 活性顯著高于噴施清水常溫處理（CK）；噴施清水低溫處理（LT）后根和莖中MDHAR 活性較CK 差異不顯著， 葉中MDHAR 活性較CK 顯著降低4.69%；而噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后根、莖和葉中MDHAR 活性較LT 顯著升高24.71%、9.50%和10.87%，且COR 和（LT＋COR）處理后棉花幼苗根和莖中MDHAR 活性差異不顯著，葉中MDHAR 活性差異顯著。說(shuō)明低溫抑制了棉花幼苗根、莖和葉中MDHAR 活性，噴施COR 后可提高根、莖和葉中MDHAR 活性。

圖1C 表明，噴施冠菌素常溫處理（COR）后棉花幼苗根、莖和葉中DHAR 活性顯著高于噴施清水常溫處理（CK）；噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗根、莖和葉中DHAR 活性與CK 差異不顯著；噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根和莖中DHAR 活性較LT 升高不顯著，僅葉中DHAR 活性較LT 顯著升高28.05%。 說(shuō)明低溫對(duì)棉花幼苗根、 莖和葉中DHAR 活性影響較小，但噴施COR 可顯著提高根、莖和葉中DHAR活性。

2.2 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗抗壞血酸含量的影響

圖2A 顯示，棉花幼苗根中AsA 含量在噴施冠菌素常溫處理（COR）、噴施清水低溫處理（LT）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）之間無(wú)顯著差異，三者均與噴施清水常溫處理（CK）有顯著差異，分別增加27.35%、20.63%和27.80%；COR、LT 和（LT＋COR）處理下棉花幼苗莖中AsA 含量較CK 分別增加103.08%、84.62%和114.23%，（LT＋COR）處理顯著高于LT，與COR 處理差異不顯著； 棉花幼苗葉中AsA 含量在COR、LT 和（LT＋COR） 處理后較CK 分別增加216.52%、96.09%和122.17%，各處理之間差異顯著。 說(shuō)明棉花幼苗根、 莖和葉為適應(yīng)低溫脅迫而產(chǎn)生AsA，噴施COR 能進(jìn)一步積累AsA，葉中AsA 含量變化幅度較大。

圖2 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官AsA、DHA 和抗壞血酸含量的影響Fig. 2 Effects of coronatine on AsA, DHA and ascorbate contents in the vegetative organ of cotton seedling under low temperature stress

圖2B 表明， 與噴施清水常溫處理 （CK）相比，噴施冠菌素常溫處理（COR）和噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗根中DHA 含量均未達(dá)到顯著性差異，噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后根中DHA 含量顯著增加24.39%；LT 處理后棉花幼苗莖中DHA 含量較CK 顯著減少31.19%，葉中DHA 含量與CK 差異不顯著， 僅減少12.11%；（LT＋COR）處理下莖和葉中DHA 含量較LT 顯著增加44.00%和24.44%。 （LT＋COR）處理后莖中DHA 含量顯著低于COR，葉中DHA含量與COR 處理間差異不顯著。 說(shuō)明噴施COR可以加速抗壞血酸系統(tǒng)代謝， 增加棉花幼苗根、莖和葉中DHA 含量。

圖2C 表明，噴施冠菌素常溫處理（COR）、噴施清水低溫處理 （LT） 和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根、莖和葉中抗壞血酸含量較噴施清水常溫處理（CK）顯著增加18.18%～27.65%、50.82%～84.51%和39.09%～101.23%，且（LT＋COR）處理后莖和葉中抗壞血酸含量顯著高于LT。說(shuō)明低溫或COR 均能誘導(dǎo)棉花幼苗根、莖和葉積累抗壞血酸，但COR 誘導(dǎo)作用更顯著。

由圖2D 可以看出， 噴施冠菌素常溫處理（COR）、噴施清水低溫處理（LT）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR） 后棉花幼苗根中AsA/DHA與噴施清水常溫處理（CK）無(wú)顯著性差異，莖和葉中AsA/DHA 顯著增加47.70%～167.36%和104.44%～223.33%，且葉中增幅較大。

2.3 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗谷胱甘肽代謝酶活性的影響

圖3A 顯示，噴施冠菌素常溫處理（COR）、噴施清水低溫處理 （LT） 和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根中GPX 活性較噴施清水常溫處理 （CK） 顯著升高10.55%、7.45%和22.37%，COR 和LT 處理間無(wú)顯著性差異， 且顯著低于（LT＋COR）處理；LT 處理對(duì)棉花幼苗莖中GPX 活性無(wú)影響，COR 處理后棉花幼苗莖中GPX 活性與CK 差異不顯著， 但較CK 增加4.17%，而（LT＋COR）處理后棉花幼苗莖中GPX活性較CK 顯著增加7.08%；COR、LT 和 （LT＋COR） 處理后棉花幼苗葉中GPX 活性較CK 顯著升高10.06%、17.69%和14.13%。說(shuō)明棉花幼苗根、莖和葉通過(guò)升高GPX 活性來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，噴施COR 可顯著提高根、莖和葉中GPX 活性。

由圖3B 可知，噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗根、莖和葉中GR 活性與噴施清水常溫處理 （CK） 無(wú)顯著差異； 噴施冠菌素常溫處理（COR）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根和莖中GR 活性顯著升高， 較CK 分別升高18.68%～22.62%和46.75%～60.45%， 葉中GR 活性較CK 差異不顯著。

圖3 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官GPX 和GR 活性的影響Fig. 3 Effects of coronatine on GPX and GR activities in the vegetative organ of cotton seedling under low temperature stress

2.4 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗谷胱甘肽含量的影響

圖4A 顯示， 與噴施清水常溫處理 （CK）相比，噴施冠菌素常溫處理（COR）可以增加棉花幼苗根、莖和葉中GSH 含量，只有在莖中差異達(dá)到顯著水平。噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗根和莖中GSH 含量較CK 顯著降低5.53%和16.15%，葉中GSH 含量較CK 降低5.37%，但差異不顯著，且噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根、莖和葉中GSH 含量較LT 顯著升高4.55%、7.66%和21.00%；COR 和 （LT＋COR）處理后棉花幼苗根和莖中GSH 含量差異顯著，葉中GSH 含量差異不顯著。 說(shuō)明低溫脅迫抑制了GSH 產(chǎn)生，噴施COR 可增加GSH 含量。

由圖4B 可以看出， 噴施冠菌素常溫處理（COR）、噴施清水低溫處理（LT）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根中GSSG 含量較噴施清水常溫處理 （CK） 顯著增加15.26%、15.07%和17.03%，莖中GSSG 含量與CK 無(wú)顯著性差異， 而LT 處理后棉花幼苗葉中GSSG 含量較CK 顯著減少36.02%，（LT＋COR） 處理后棉花幼苗葉片GSSG 含量較LT 顯著升高23.18%，且COR 處理GSSG 含量顯著低于（LT＋COR）。

圖4C 表明，噴施清水低溫處理（LT）后棉花幼苗莖中谷胱甘肽含量較噴施清水常溫處理（CK）顯著下降，根和葉中差異不顯著；噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后根和葉中谷胱甘肽含量顯著高于LT，莖中無(wú)顯著性差異。 說(shuō)明低溫抑制了棉花幼苗根、 莖和葉中谷胱甘肽的積累，噴施COR 能誘導(dǎo)增加棉花幼苗根、 莖和葉中谷胱甘肽含量。

圖4 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官GSH、GSSG 和谷胱甘肽含量的影響Fig. 4 Effects of coronatine on GSH, GSSG and glutathione contents in the vegetative organ of cotton seedling under low temperature stress

由圖4D 可知，噴施清水低溫處理（LT）和噴施冠菌素低溫處理（LT＋COR）后棉花幼苗根中GSH/GSSG 較噴施清水常溫處理（CK）顯著下降17.62%和15.63%， 而噴施冠菌素常溫處理（COR） 較CK 差 異 不 顯 著； 莖 中 各 處 理 的GSH/GSSG 與CK 無(wú)顯著性差異；COR 和LT 處理后棉花幼苗葉中GSH/GSSG 比CK 顯著增加79.52%和14.10%，而（LT＋COR）處理后棉花幼苗葉中GSH/GSSG 較CK 增加不顯著， 僅為11.23%。 說(shuō)明低溫脅迫造成棉花幼苗根中GSH/GSSG 下降，葉中GSH/GSSG 增加，對(duì)莖無(wú)影響， 噴施COR 常溫處理對(duì)葉中GSH/GSSG 影響較大。

3 討論

3.1 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗抗壞血酸代謝酶活性及抗氧化物質(zhì)含量的影響

AsA 是AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)中清除活性氧的重要抗氧化物質(zhì)，在APX 作用下與H2O2反應(yīng)生成H2O，從而清除H2O2的毒性。 AsA 被氧化形成MDHA， 部分MDHA 進(jìn)一步氧化形成DHA，而MDHA 和DHA 分別在MDHAR 和DHAR 的催化下又可以生成AsA[27-28]。 刁倩楠等[13]研究表明，甜瓜幼苗經(jīng)6 ℃低溫脅迫7 d，其葉片中APX 活性升高26.83%， 而DHAR 活性、AsA、DHA 含量及AsA/DHA 顯著降低54.54%、68.29%、74.51%和76.37%，噴施1.0 mmol·L－1SA 能明顯提高葉片 中 APX 和 DHAR 活 性、AsA 含 量 和AsA/DHA。 相昆等[29]研究表明，核桃幼苗經(jīng)8 ℃低溫脅迫3 d， 其葉片APX、DHAR 活性、AsA 含量及AsA/DHA 下降，DHA 含量升高， 噴施硝普鈉（Sodium nitroprusside, SNP）后核桃幼苗葉片APX 活性顯著升高，AsA 和DHA 含量增加。Nahar 等[30]研究表明，綠豆幼苗經(jīng)6 ℃低溫脅迫5 d 時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，AsA-GSH 循環(huán)中非酶物質(zhì)和酶類活性比例發(fā)生變化， 當(dāng)噴施亞精胺（Spermidine, Spd） 時(shí)AsA 和GSH 含 量、AsA/DHA 和GSH/GSSG 均 增 加，APX、MDHAR、DHAR 和GR 活性也升高，而DHA 和GSSG 含量減少。 本研究表明，4 ℃低溫脅迫抑制了棉花幼苗抗氧化酶活性，降低了棉花幼苗根、莖和葉清除活性氧能力， 引起AsA 轉(zhuǎn)化受阻， 造成根、 莖和葉中AsA 含量高于CK，且在DHAR 催化作用下可將DHA 轉(zhuǎn)化為AsA，使得棉花幼苗莖和葉DHA 含量低于CK，從而引起AsA/DHA 增加。噴施COR常溫或低溫處理均能誘導(dǎo)棉花幼苗根、莖和葉中抗氧化酶活性升高， 增加清除活性氧的能力，提升AsA 轉(zhuǎn)化效率， 同時(shí)MDHA 和DHA 分別在MDHAR 和DHAR 的催化作用下轉(zhuǎn)化為AsA，造成根、 莖和葉中AsA 含量高于CK， 根和葉中DHA 轉(zhuǎn)化效率高于莖， 導(dǎo)致莖中DHA 含量增加，且莖中AsA 含量增加幅度大于DHA，莖和葉中AsA/DHA 增加，使根中AsA/DHA 無(wú)變化，各指標(biāo)變化規(guī)律與甜瓜、核桃及綠豆上研究結(jié)果較一致[13,29-30]。由此可見(jiàn)，噴施COR 可以提高DHAR和MDHAR 活性，從而增加AsA 的產(chǎn)生速率，且維持APX 活性來(lái)減少AsA 轉(zhuǎn)化速率， 最終增加棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官中AsA 及抗壞血酸含量，提高AsA/DHA，增強(qiáng)棉花幼苗抗低溫能力。

3.2 冠菌素對(duì)低溫脅迫下棉花幼苗谷胱甘肽代謝酶活性及抗氧化物質(zhì)含量的影響

GSH 作為AsA-GSH 循環(huán)中重要的抗氧化劑之一，可維持膜蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 GPX 和DHAR 能特異催化GSH 生成GSSG，而GR 可催化GSSG生成GSH， 其活性水平與細(xì)胞GSH 庫(kù)關(guān)系密切[31-32]。 黃志明等[12]研究表明，枇杷幼果經(jīng)低溫脅迫后噴施70 mg·L－1SA 可以增加GSH 含量和GSH/GSSG， 降低GSSG 含量， 同時(shí)提高GR 和GPX 活性。 Liu 等[33]研究表明，番茄幼苗經(jīng)8 ℃低溫脅迫24 h 時(shí)GSH 和GSSG 含量均增加，但GSSG 含量增加較多，使GSH/GSSG 減小，且GR活性降低；當(dāng)噴施25 mg·L－1ALA 時(shí)GSH 含量、GSH/GSSG 及GR 活性均增加，而GSSG 含量減少。 本研究結(jié)果顯示， 較高活性水平的GPX 和DHAR 能催化GSH 生成GSSG，造成根、莖和葉中GSH 含量下降，使根中GSH 含量增加，但葉中GPX 和DHAR 活性低于根和莖， 導(dǎo)致GSSG含量隨之減少， 然而莖中GR 活性高于根和葉，加速了GSSG 的轉(zhuǎn)化速率，導(dǎo)致莖中GSSG 含量無(wú) 變 化； 最 終 根 中GSH/GSSG 下 降， 莖 中GSH/GSSG 無(wú)變化， 葉中GSH/GSSG 增加，即棉花幼苗根、莖和葉通過(guò)升高或維持GPX 和GR活性在正常水平來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境。 低溫脅迫對(duì)棉花幼苗根損傷程度較大。 此外，噴施COR 常溫處理增加了棉花幼苗根、 莖和葉清除活性氧能力，GPX 和DHAR 活性升高加速了循環(huán)代謝， 保證細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。 噴施COR 造成棉花幼苗根、莖和葉中GSH 含量增加，噴施COR 常溫處理引起根中GSSG 含量增加， 莖中GSSG 含量無(wú)變化，葉中GSSG 含量隨之減少， 而噴施COR 低溫處理引起根和莖中GSSG 含量無(wú)變化， 而葉中GSSG 含量增加；噴施COR 引起根中GSH/GSSG下降，莖中GSH/GSSG 無(wú)變化，葉中GSH/GSSG增加。 因此，噴施COR 可以提高GPX 和GR 活性， 從而使GSH 含量和GSH/GSSG 維持在較高水平，提高棉花幼苗抗低溫能力。

4 結(jié)論

棉花幼苗通過(guò)抑制APX 和MDHAR 活性、升高GPX 活性、 維持DHAR 和GR 活性來(lái)調(diào)節(jié)根、 莖和葉中抗氧化物質(zhì)含量和氧化還原狀態(tài)，以適應(yīng)低溫脅迫。 4 ℃低溫脅迫對(duì)棉花幼苗根損傷程度最大。 噴施COR 可以激活棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官中AsA-GSH 循環(huán)代謝，通過(guò)提高DHAR 和MDHAR 活性來(lái)增加AsA 的產(chǎn)生速率，通過(guò)維持APX 活性來(lái)減少AsA 轉(zhuǎn)化速率， 最終增加棉花幼苗營(yíng)養(yǎng)器官中AsA 和抗壞血酸含量， 提高AsA/DHA； 此外， 噴施COR 可以升高GPX 和GR 活性使GSH 含量和GSH/GSSG 維持在較高水平， 用來(lái)清除棉花幼苗組織中過(guò)多的H2O2，保證細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，提高棉花幼苗抗低溫能力。 低溫脅迫下噴施COR 對(duì)葉片緩解作用最強(qiáng)。