花生突變體創(chuàng)制與品質(zhì)性狀分析

遲曉元，徐 赫，許 靜，王 通，陳 娜，潘麗娟，陳明娜，王 冕，孫 杰，袁 美，梁成偉*，禹山林*

(1.山東省花生研究所,山東 青島266100；2.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東 青島266042)

花生是我國(guó)重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物[1]。我國(guó)花生種植面積在世界上排名第二位,產(chǎn)量排名第一位[2]。但是目前我國(guó)的花生品種面臨著遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄、品種過于單一化的問題,尤其是優(yōu)異種質(zhì)資源匱乏和過分依賴少數(shù)骨干親本資源的問題[2-3]。變異豐富的種質(zhì)資源是對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行持續(xù)改良、拓寬現(xiàn)有品種遺傳背景、避免毀滅性病蟲害的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。因此,實(shí)現(xiàn)花生種質(zhì)突破,培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)花生新品種是花生育種工作的重要目標(biāo)。

利用誘變手段創(chuàng)制突變種質(zhì)是作物種質(zhì)改良和理論研究的重要途徑[5]。近幾年來,一些國(guó)內(nèi)學(xué)者開展了花生突變體的相關(guān)研究,主要采用的誘變方法有60Co-γ射線、快中子、離子束、激光、高能混合粒子場(chǎng)、EMS、硫酸二乙酯(DES)、平陽(yáng)霉素等。構(gòu)建了多個(gè)花生突變體庫(kù),獲得了農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀發(fā)生改變的花生突變體材料,包括高賴氨酸含量、高油、高油酸、耐鹽性強(qiáng)、耐旱性強(qiáng)等材料,并選育了魯花6號(hào)、花育32號(hào)、花育40號(hào)、宇花5號(hào)、宇花7號(hào)、宇花9號(hào)等花生品種[2,5-14]。

誘變具有操作簡(jiǎn)單、變異率高等特點(diǎn),突變性狀通常穩(wěn)定較快,可縮短育種周期,加快育種進(jìn)程,提高育種效率,縮短花生品種的改良進(jìn)程[5]。本研究誘導(dǎo)產(chǎn)生花生突變體,研究花生的突變特性和品質(zhì)性狀變異情況,并對(duì)不同誘變方式的誘變效應(yīng)進(jìn)行分析,采用KASP方法對(duì)突變體高油酸基因型進(jìn)行鑒定。本研究豐富了花生的種質(zhì)資源,為培育花生優(yōu)異新品種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用花生8個(gè)品種(種質(zhì))魯花6號(hào)(LH6)、花育19號(hào)(HY19)、花育20號(hào)(HY20)、花育23號(hào)(HY23)、花育32號(hào)(HY32)、花育33號(hào)(HY33)、四粒紅(SLH)、龍花生(DP)用于突變體的創(chuàng)制,材料由山東省花生研究所遺傳育種課題組提供。對(duì)照與處理后的花生種子在萊西花生試驗(yàn)基地單粒播種。

1.2 誘變方法

根據(jù)前人研究方法并進(jìn)行改良,采用EMS溶液處理、60Co-γ射線和快中子輻照三種方法[5-6,13]。每種誘變方式分別處理每個(gè)花生品種(種質(zhì))900粒,以未誘變親本作為對(duì)照。將誘變處理后的M0代種子種植于大田,對(duì)M1代進(jìn)行單株收獲。經(jīng)過M2～M7代多年篩選后獲得了一個(gè)含有1623份種質(zhì)的花生突變體庫(kù)。各品種(種質(zhì))突變體數(shù)目見表1。

表1花生突變體數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 1 Number of peanut mutants

1.3 品質(zhì)性狀檢測(cè)方法

采用近紅外光譜儀測(cè)定花生種子含油量、蛋白質(zhì)含量、油酸含量、亞油酸含量等品質(zhì)性狀。以未誘變材料為對(duì)照,對(duì)照品種(種質(zhì))的品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如表2。

1.4 KASP技術(shù)SNP檢測(cè)

高油酸突變體的單株葉片采用天根?高效植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。使用Pultton超微量紫外分光光度計(jì)、260nm波長(zhǎng)下測(cè)定DNA樣品濃度,分析質(zhì)量[15]。選取合格的樣品送往金玉中標(biāo)記有限公司進(jìn)行SNP檢測(cè)。引物序列如下。

FAD2A引物:A003151-FAM:GTTTTGGGACAAACACTTCGTT；A003151-VIC:GTTTTGGGACAAACACTTCGTC；A003151-Com:CGCCACCACTCCAACACC

FAD2B引物:A003153-FAM:CAAACACTTCGTCGCGGTCT；A003153-VIC:AAACACTTCGTCGCGGTCG；A003153-Com:CCGCCACCACTCCAACACA

1.5 統(tǒng)計(jì)與繪圖方法

利用SPSS 24軟件[16]對(duì)各品質(zhì)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Excel 2010和Adobe Illustrator CS5對(duì)其進(jìn)行制表和繪圖。

表2 對(duì)照花生品種(種質(zhì))的品質(zhì)性狀Table 2 Quality traits of the control peanut varieties (germplasms)

表3 各花生品種(種質(zhì))品質(zhì)性狀變異系數(shù)Table 3 Coefficient of variation of peanut quality traits/%

表4 花生品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of peanut quality traits

表5 花生品質(zhì)性狀的主成分分析Table 5 Principal component analysis of peanut quality traits

2 結(jié)果與分析

2.1 花生突變體的創(chuàng)制及性狀變異分析

由表3可看出,魯花6號(hào)、花育20號(hào)、花育23號(hào)、花育33號(hào)和四粒紅的油亞比變異系數(shù)較大,花育19號(hào)和花育32號(hào)的亞油酸含量變異系數(shù)較大,龍花生的蔗糖含量變異系數(shù)較大。8個(gè)品種(種質(zhì))的含油量變異系數(shù)最小,蛋白質(zhì)含量、棕櫚酸含量次之。

以上結(jié)果表明,花育19號(hào)有4個(gè)品質(zhì)性狀變異系數(shù)最高,魯花6號(hào)有3個(gè)品質(zhì)性狀變異系數(shù)最高。因此它們誘變產(chǎn)生的材料種類更全面,有利于優(yōu)良品種的選擇。油酸變異系數(shù)最高的為花育19號(hào),可作為高油酸花生培育與發(fā)展的優(yōu)質(zhì)資源。

2.2 花生品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

由表4可看出,亞油酸含量與油酸含量、油亞比間均呈極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.987和-0.802；亞油酸含量與棕櫚酸含量間呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.960。油酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.961,與油亞比呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.775。棕櫚酸含量與油亞比呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.745。

2.3 花生品質(zhì)性狀的主成分分析

對(duì)7個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行主成分分析(表5),依據(jù)特征根大于1的原則,選取了兩個(gè)主成分因子,這兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.018%,因此這兩大成分包括了這7個(gè)品質(zhì)性狀的大部分信息。第1主成分貢獻(xiàn)率為59.085%,亞油酸、油酸、棕櫚酸擁有較高的載荷數(shù),分別為0.987、0.986、0.988。 這三種品質(zhì)性狀對(duì)于花生品質(zhì)的分析占據(jù)主導(dǎo)地位,花生油品質(zhì)的改良也應(yīng)從此入手。其中亞油酸、棕櫚酸為負(fù)效應(yīng)因子,油酸為正效應(yīng)因子。第2主成分貢獻(xiàn)率為26.933%,載荷數(shù)最高的是正效應(yīng)因子蛋白質(zhì)為0.950,負(fù)效應(yīng)因子蔗糖次之,為0.909。

圖1 花生品質(zhì)性狀的主成分組件圖Fig.1 Principal component diagram of peanut quality traits

從品質(zhì)性狀的主成分分析圖中可看出(圖1),亞油酸與棕櫚酸距離很近,因此它們之間的相關(guān)性很強(qiáng)。油酸與亞油酸和棕櫚酸距離較遠(yuǎn)且位于坐標(biāo)軸的兩側(cè),可推測(cè)出亞油酸和棕櫚酸的含量會(huì)隨著油酸含量的提高而降低。此外蛋白質(zhì)與蔗糖距離較遠(yuǎn)且方向相反,因此可預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)含量越高,蔗糖含量會(huì)有所下降。

2.4 花生品質(zhì)性狀的多元線性回歸分析

以油亞比為因變量,其余6個(gè)品質(zhì)性狀為自變量,進(jìn)行多元線性回歸分析,自動(dòng)剔除統(tǒng)計(jì)性不顯著的變量,篩選出與油亞比關(guān)系密切的重要性狀。得到回歸方程:Y2=79.87+0.84a1-1.32a2+1.64a3-1.10a4-9.32a5(其中Y2:油亞比；a1:油酸含量；a2:含油量；a3:棕櫚酸含量；a4:蛋白質(zhì)含量；a5:蔗糖含量)。

2.5 花生品質(zhì)性狀的通徑分析

油亞比是篩選高油酸花生品種的重要指標(biāo)。對(duì)油亞比與5個(gè)品質(zhì)性狀進(jìn)行通徑分析,根據(jù)正負(fù)效應(yīng)相互抵消的原則,品質(zhì)性狀對(duì)油亞比的影響:油酸含量(1.522)＞棕櫚酸含量(0.387)＞含油量(-0.271)＞蛋白質(zhì)含量(-0.273)＞蔗糖含量(-0.698)。

2.6 不同誘變方法對(duì)8個(gè)花生品種(種質(zhì))的影響

與對(duì)照相比,花育19號(hào)的含油量經(jīng)過EMS和60Co-γ誘變后均下降?；ㄓ?3號(hào)和四粒紅的含油量經(jīng)過快中子輻照后有所下降。其余品種(種質(zhì))含油量經(jīng)過誘變后都有所升高。誘變后,含油量提高到56%以上的材料總共有337份,其中魯花6號(hào)9份,花育19號(hào)46份,花育20號(hào)239份,花育23號(hào)26份,花育32號(hào)4份,花育33號(hào)13份。含油量提高到58%以上的材料總共有27份,其中魯花6號(hào)1份,花育19號(hào)2份,花育20號(hào)22份,花育23號(hào)1份,花育33號(hào)1份。其中突變體T26(FSHY20-9)的含油量最高,達(dá)到59.2%(表6)。

魯花6號(hào)的蛋白質(zhì)含量經(jīng)過EMS誘變后有所下降,其余品種(種質(zhì))蛋白質(zhì)含量經(jīng)過誘變后都有所升高。誘變后,蛋白質(zhì)含量提高到28%以上的材料共192份,其中魯花6號(hào)21份,花育19號(hào)4份,花育20號(hào)34份,花育23號(hào)2份,花育32號(hào)2份,龍花生7份,四粒紅122份。蛋白質(zhì)含量提高到30%以上的材料共41份,其中花育20號(hào)2份,龍花生39份。其中突變體T1622(FSSLH-53)的蛋白質(zhì)含量最高,達(dá)到32.49%(表6)。

魯花6號(hào)的油酸含量經(jīng)EMS誘變和60Co-γ誘變后保持穩(wěn)定,其余品種(種質(zhì))油酸含量經(jīng)誘變后都有所提高。誘變后,油酸含量提高到70%以上的材料總共有161份,其中魯花6號(hào)1份,花育19號(hào)154份,花育20號(hào)2份,花育33號(hào)3份,四粒紅1份。龍花生的亞油酸含量經(jīng)快中子輻照后略有升高,其余品種(種質(zhì))亞油酸含量經(jīng)過誘變后都有所降低?；ㄓ?2號(hào)的油亞比經(jīng)過EMS誘變后有所降低。龍花生和四粒紅的油亞比經(jīng)快中子輻照后表現(xiàn)穩(wěn)定。其余品種(種質(zhì))的油亞比經(jīng)誘變后都有所提高。誘變后,油亞比提高到10以上的材料總共有93份,其中魯花6號(hào)1份,花育19號(hào)86份,花育20號(hào)2份,花育33號(hào)3份,四粒紅1份。

魯花6號(hào)的棕櫚酸含量經(jīng)EMS誘變和60Co-γ誘變后都有所提升。其余品種(種質(zhì))的棕櫚酸含量誘變后有所下降。誘變后,棕櫚酸含量降到8%以下的材料有170份,其中魯花6號(hào)2份,花育19號(hào)154份,花育20號(hào)3份,花育32號(hào)8份(≤5%),花育33號(hào)3份。T64(EMSHY32-1)和T65(EMSHY32-2)棕櫚酸含量最低,為4.45%(表6)。

圖2 不同誘變方法對(duì)不同品種(種質(zhì))品質(zhì)性狀的影響Fig.2 Mutagenic effects of quality traits of peanut varieties(germplasms)

表6 篩選出的部分花生突變體的品質(zhì)性狀Table 6 Quality traits of part of peanut mutants

花育19號(hào)的蔗糖含量經(jīng)EMS誘變后有所升高。其余品種(種質(zhì))的蔗糖含量經(jīng)過誘變后都有所下降。誘變后,蔗糖含量提高到5%以上的材料共222份,其中魯花6號(hào)38份,花育19號(hào)152份,花育20號(hào)12份,花育23號(hào)4份,花育33號(hào)7份,龍花生8份,四粒紅1份。蔗糖含量提高到6%以上的僅有15份花育19號(hào)突變體。T662(EMSHY19-60)的蔗糖含量最高,為6.61%(表6)。

2.7 Ah FAD 2等位基因的檢測(cè)(KASP法)

應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive

Allele-Specific PCR,KASP)技術(shù)對(duì)花育19號(hào)的油酸含量提高突變體進(jìn)行SNP的等位差異檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)花育19號(hào)的Ah FAD2A基因本身已發(fā)生突變,第448bp位點(diǎn)發(fā)生由“G”到“A”的轉(zhuǎn)換,是并沒有引起油酸性狀的顯著變化(表7)。經(jīng)檢測(cè),154份花育19號(hào)的油酸含量提高突變體Ah FAD2B基因的442bp位點(diǎn)插入一個(gè)“A”。突變體油酸變幅66.46%～80.30%,亞油酸變幅1.29%～13.34%,油亞比變幅4.98～62.31。說明兩個(gè)等位基因均突變的個(gè)體比一個(gè)基因突變的個(gè)體更能顯著增加花生中的油酸含量和油亞比。

此外,根據(jù)高油酸評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)(油酸含量≥75%和O/L比值≥10),其中有64個(gè)突變體符合高油酸花生標(biāo)準(zhǔn)。花育19號(hào)經(jīng)過EMS誘變處理獲得突變體8個(gè),60Co-γ射線輻照處理獲得突變體146個(gè),說明60Co-γ射線輻照處理效果更顯著。此外,與Ah FAD2A基因相比,Ah FAD2B基因活性對(duì)O/L比值的影響更大(表7)。

表7 部分突變體Ah FAD 2等位基因與油酸和亞油酸含量的關(guān)系Table 7 Relationship between AhFAD 2 alleles and contents of oleic acid and linoleic acid in part of peanut mutants

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源的創(chuàng)制與開拓一直是生物育種的關(guān)鍵點(diǎn)[17]。有研究表明,群體性狀的變異程度對(duì)于種質(zhì)變異和創(chuàng)新貢獻(xiàn)率起到顯著的推動(dòng)作用[18]。本研究采用三種誘變方法對(duì)8個(gè)花生品種(質(zhì))分別進(jìn)行處理,誘變產(chǎn)生了一個(gè)含有1600余份種質(zhì)的突變體庫(kù),其中花生主要品質(zhì)性狀表現(xiàn)了不同程度的變異,極大地豐富了花生的種質(zhì)資源。利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,根據(jù)相關(guān)性分析、主成分分析、通徑分析等一系列方法來探尋突變體的總體特性,發(fā)現(xiàn)了品質(zhì)性狀主要受兩個(gè)主成分的影響,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到86.018%。油酸含量為品質(zhì)性狀最重要的直接影響因素。

根據(jù)各誘變方法對(duì)不同品質(zhì)指標(biāo)的影響,研究各誘變方法對(duì)不同品質(zhì)性狀的誘變效果,以此尋找最佳的誘變手段。本研究發(fā)現(xiàn)誘變能使油亞比顯著提高,極大地改善花生油的品質(zhì)。高油酸含量是與人類健康相關(guān)的理想特征[19],普通花生油酸含量通常約為50%左右,高油酸花生品種的油酸含量高達(dá)70%以上。據(jù)報(bào)道,花生基因組中含有兩個(gè)AhFAD2基因,分別是Ah FAD2A和Ah-FAD2B,分別來自A和B基因組[20]。高油酸是AhFAD2A基因中448bp G→A堿基取代和Ah-FAD2B基因功能喪失的共同作用結(jié)果[21]。利用KASP技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè),分析Ah FAD2基因的突變位點(diǎn)與高油酸性狀的相關(guān)性,對(duì)前人的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。該研究為探索今后花生育種研究提供了優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)材料與重要的理論參考。