青稞旗葉距與小孢子發(fā)育時期的相關性研究

朱天地 陳琛 王煒 陳子萱 李靜雯

摘要：選用3個青稞品種（系）0841-6、T09-401、昆侖3號為試驗材料，采用改良苯酚品紅溶液對小孢子染色，在光學顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育情況，分析青稞小孢子發(fā)育時期與旗葉距（旗葉與倒二葉的葉耳間距離）之間的相關性。結果表明，旗葉距為 0～3 cm 時，小孢子發(fā)育處于二分體時期;3～8 cm 時，大部分小孢子細胞處于四分體階段;8～13 cm 時，單核中期為主;13～18 cm時，花藥中存在各種發(fā)育時期的小孢子，但以單核靠邊期為主;當旗葉距>18 cm 時，小孢子開始大量成熟，直至發(fā)育為成熟花粉。供試青稞小孢子品種（系）的發(fā)育時期均與旗葉距有一定的相關性，旗葉距可作為青稞花藥和小孢子培養(yǎng)幼穗取材的重要形態(tài)學指標。

關鍵詞：青稞;旗葉距;小孢子;發(fā)育時期;花藥培養(yǎng);染色

中圖分類號：S512.3? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）09-0036-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.09.010

Abstract：Three highland barley cultivars including 0841-6， T09-401 and Kunlun 3 were used as experiment materials，staining highland barley microspores with modified phenol magenta solution， the development of microspore was observed under optical microscope， and the relationship between the microspore developmental stage of highland barley and the flag leaf spacing was analyzed. The results showed that when the flag leaf spacing was 0～3 cm， the microspore development was basically in dyad; At 3～8 cm， the microspore development was basically in tetrad; At 8～13 cm，the microspores developed into mid-uninucleate; At 13～18 cm，various kinds of developmental stages of microspores could be observed，but most of them were late-uninucleate microspores; When the flag leaf spacing exceeded 18 cm， a big scale of microspores entered mature period and developed into mature pollens. The development stages of the three kinds of highland barley microspores all have a certain correlation with the flag leaf spacing， the flag leaf spacing can be used as a morphological indicator on sampling of young spikes in the highland barley anther and isolated microspore culture.

Key words：Highland barley;Flag leaf spacing;Microspore;Developmental stage;Anther culture; Staining

青稞（Hordeum vulgare L. var nudum Hook.f.）是我國的原產物種之一，為禾本科大麥屬的一種谷類作物[1 - 3 ]。因其內外穎與穎果分離，籽粒裸露在外面，故而得名裸大麥、米大麥或元麥[4 ]，主要種植在青海、甘肅、西藏等高海拔地區(qū)，已有4 000多年種植歷史[5 ]。青稞根據其棱數的不同，分為二棱青稞、四棱青稞和六棱青稞;按其顏色，又可被分為紫青稞、花青稞、白青稞、黑青稞等[6 ]。青稞不同于其他谷類，具有“三高兩低” 的特點，即高纖維、高蛋白質、高維生素、低脂和低糖等，有預防糖尿病、降低膽固醇等作用，是現代健康文明生活的理想保健食品[7 ]。隨著青稞營養(yǎng)價值不斷地被挖掘，人們對其關注日漸增多，青稞已廣泛涉及釀酒工業(yè)、功能食品、糧食工業(yè)、飲料工業(yè)等領域[8 ]。

青稞新品種的選育工作已經開展約70 a，且培育了大量的優(yōu)良品種，但傳統(tǒng)育種方法耗時耗力。由于長期對產量、抗性和品質的要求，很可能造成青稞遺傳多樣性的下降，對青稞新品種的選育不利[9 - 10 ]。單倍體育種在植物育種研究中具有重要應用價值，花藥和小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑，能夠誘導產生胚狀體，快速獲得純合育種材料，大大縮短育種年限，提高選擇效率，加快育種進程。小孢子發(fā)育階段與花藥離體培養(yǎng)效果的相關性，是花藥離體培養(yǎng)取材的關鍵，發(fā)育到一定階段的花粉對離體刺激最敏感，并最終發(fā)育成完整植株[11 ]。例如，紅花槐的花粉發(fā)育階段與花冠與花萼的長度比、花蕾縱徑等有直接關系[12 ];在大麥花30中，小孢子發(fā)育時期與旗葉距存在相關性[13 ];水稻中，旗葉距為7～11 cm時為小孢子離體培養(yǎng)的最佳時期[14 ];在秈稻中，小孢子處于單核靠邊期時葉枕距為4～6 cm，為最佳誘導培養(yǎng)時期[15 ]。為了解小孢子發(fā)育時期與旗葉距的相關性，幼穗的取材需要建立更為精細的形態(tài)學指標，以獲得更多處于適宜時期的花藥和小孢子進行培養(yǎng)。我們以3個青稞品種（系）0841-6、T09-401和昆侖3號為試驗材料，對其不同旗葉距的花藥染色壓片，用顯微鏡觀察計數并拍照統(tǒng)計，探討旗葉距、花藥大小及顏色與小孢子發(fā)育時期的相關性，為青稞花藥和小孢子培養(yǎng)的相關研究提供方法參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

供試青稞品種（系）為0841-6、T09-401、昆侖3號，均由甘肅省農業(yè)科學院生物技術研究所提供。這3個青稞材料均種植于甘肅省農業(yè)科學院生物技術研究所溫室內，管理同常規(guī)大田。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 取樣與測量? ? 2019年10 月中旬將供試青稞種子播種于溫室，2020年2月中下旬青稞現幼穗后取樣，每天9：00 — 10：00時采集健康且長勢較好植株上的不同旗葉距的幼穗，做好標記并放入自封口塑料袋中帶回實驗室。用游標卡尺測量旗葉距，并分為五個區(qū)間：0～3 cm、 3～8 cm、8～13 cm、13～18 cm、 18～23 cm。每個區(qū)間取10個幼穗測定，重復3次。將幼穗從葉鞘中抽出，用鑷子輕輕剝去穎殼，取出花藥并用游標卡尺測量長度，記錄數據并拍照。

1.2.2? ? 壓片? ? 用鑷子取不同旗葉距幼穗中部的3枚花藥，置于載玻片上，滴1滴染色液使其完全浸沒，用玻璃棒擠壓花藥使小孢子游離出來，去掉花藥殘渣，染色 1～2 min 后蓋上蓋玻片，吸去多余染液，用奧林巴斯 BX-51顯微鏡觀察小孢子發(fā)育狀況并拍照記錄。分別用改良苯酚品紅和醋酸洋紅染液染色，以選擇效果最好的染色液。

2? ?結果與分析

2.1? ?染色液選擇及染色時間

制片能否成功主要受染色液和染色時間的影響，同時也影響小孢子的鏡檢結果。由圖1看出，改良苯酚品紅染色液更適合青稞游離小孢子的染色觀察，而經醋酸洋紅染色的青稞游離小孢子背景比較混雜，不易觀察小孢子的各發(fā)育時期。染色時間不宜過短也不宜過長，過短則達不到染色效果，過長會將細胞染色太深不利于觀察，最佳染色時間為1.5～2.0 min。

2.2? ?青稞小孢子各發(fā)育時期的特征

通過對青稞小孢子各發(fā)育時期的觀察，表明小孢子的發(fā)育是連續(xù)的，1個花藥通常包含著不同發(fā)育時期的小孢子。如圖2所示，小孢子母細胞經過第一次減數分裂形成的二分體（圖2 a），再進一步進行第二次減數分裂形成呈“田”字形的小孢子四分體。由圖2 b可見，光學顯微鏡下可以看到一層厚的胼胝質將小孢子包裹著，不同發(fā)育時期小孢子呈不同形狀，規(guī)則的為圓形;之后胼胝質酶將胼胝質壁催化水解，小孢子從胼胝質中分離出來被釋放至花粉囊中，此時小孢子具有不規(guī)則的外形輪廓，呈圓球形或紡錘形，細胞核較大，居中，也有稍偏離中央的，即單核居中期（圖2 c）。隨著小孢子從四周汲取養(yǎng)料，細胞體積逐漸增大，液泡也隨之增大，將細胞核推向細胞壁邊緣，即單核靠邊期（圖2 d）;隨后小孢子核進行2次有絲分裂，最終發(fā)育成為成熟花粉粒，光學顯微鏡下可見花粉粒顏色變深但看不到細胞器，細胞膨大呈球形（圖2 e）。

2.3? ?青稞小孢子各發(fā)育時期與旗葉距的關系

通過觀察，將小孢子的發(fā)育時期分為二分體時期、四分體時期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期和三核期等 6個時期。由于試驗條件受限，雙核期和三核期難以區(qū)分，內部特征觀察不明顯，將這 2 個時期合并為發(fā)育后期?；ㄋ庨L度和花藥顏色也隨小孢子發(fā)育各個時期而有所變化。

在光學顯微鏡下對青稞品系0841-6不同時期小孢子進行觀察的結果（表1）可以看出，當旗葉距在 3～8 cm 時，主要以小孢子四分體時期為主，也有少量散落分布的二分體和單核早中期的小孢子，此時細胞質顏色淺，細胞核易見。旗葉距增加到8～13 cm時，四分體小孢子逐漸減少，單核早中期小孢子數量居多，同時可觀察到單核靠邊期和成熟期小孢子。當旗葉距在13～18 cm 時，單核靠邊期小孢子數量急劇增加達到峰值，四分體小孢子幾乎消失，單核早中期小孢子數量減少，同時出現成熟期小孢子。旗葉距>18 cm 時，單核早中期和靠邊期的小孢子減少甚至消失，視野內以成熟期小孢子為主。

從表 2 和表3分別可以看出， T09-401和昆侖3號的小孢子發(fā)育時期與旗葉距的關系趨勢與0841-6基本一致。當旗葉距在 3～8 cm 時，主要以小孢子四分體時期為主，旗葉距增加到8～13 cm時單核早中期小孢子數量居多，當旗葉距為13～18 cm時單核靠邊期小孢子數量急劇增加并達到峰值，旗葉距>18 cm時視野內以成熟期小孢子為主。細微的差別是T09-401旗葉距在18～23 cm時可觀察到單核早中期的小孢子，昆侖3號在旗葉距8～13 cm時未觀察到四分體時期的小孢子。

從圖 3 可以看出，0841-6、T09-401和昆侖3號各個時期的小孢子數量峰值都分別對應不同的旗葉距區(qū)間。

3? ?結論與討論

單倍體育種在植物育種研究中具有重要應用價值，花藥或花粉的離體培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑，選擇適宜的小孢子發(fā)育時期是花藥或花粉離體培養(yǎng)取得成功的重要因素之一，小孢子發(fā)育時期的細微差別對花藥培養(yǎng)的產率將產生重大的影響[16 - 17 ]。不同物種最佳取材時期有差異，例如，在黃瓜小孢子培養(yǎng)中，以單核中后期的花粉培養(yǎng)效果最佳[18 ];Duijs[19 ]和Takahata等[20 ]的研究表明，甘藍花藥培養(yǎng)中小孢子最佳培養(yǎng)時期為單核中后期至雙核期，且雙核期小孢子占比對甘藍游離小孢子培養(yǎng)影響重大;張德雙等[21 ]的研究認為，綠菜花游離小孢子培養(yǎng)的最佳時期也是單核靠邊期至雙核期;王亦菲等[22 ]選取小孢子發(fā)育時期處于單核期的青稞花藥進行離體培養(yǎng)，成功獲得了小孢子再生植株。

在大量的花藥和小孢子離體培養(yǎng)過程中，采用顯微鏡逐個觀察很困難并且易污染，所以確定與小孢子發(fā)育時期相對應的旗葉距大小形態(tài)指標至關重要。由于其直觀性，利用旗葉距的大小來判斷小孢子發(fā)育時期在小孢子的離體培養(yǎng)中得到廣泛應用。Mayakaduwa等[14 ]認為水稻旗葉距為7～11 cm時為小孢子離體培養(yǎng)的最佳時期;在秈稻中，小孢子處于單核靠邊期時葉枕距為4～6 cm，為最佳誘導培養(yǎng)時期[15 ];在大麥中，旗葉距在1.7～5.1 cm時，分離的小孢子數量最多[23 ];燕麥中旗葉距小于4 cm的圓錐花序能夠形成胚狀體[24 ]。試驗取樣過程中，旗葉距是一個比較直觀的形態(tài)學指標，旗葉距的大小與小孢子發(fā)育時期有一定的相關性。以旗葉距為基本標準，同時結合顯微鏡觀察，來判斷最佳小孢子培養(yǎng)時期，可以降低實驗誤差。

本研究表明，當旗葉距在 0～3 cm 時，青稞主要以小孢子二分體時期為主，但由于試驗條件受限，未對二分體時期小孢子進行計數。當旗葉距為3～8 cm時，主要以小孢子四分體時期為主，也有少量散落分布的二分體和單核早中期小孢子，此時細胞質顏色淺，細胞核易見。旗葉距增加到8～13 cm時，四分體小孢子逐漸減少，單核早中期小孢子數量居多，同時觀察到單核靠邊期和成熟期小孢子。當旗葉距在13～18 cm 時，單核靠邊期小孢子數量急劇增加達到峰值，四分體小孢子幾乎消失，單核早中期小孢子數量減少，同時出現成熟期小孢子。旗葉距>18 cm 時，單核早中期和靠邊期小孢子減少至消失，視野內以成熟期小孢子為主?；ㄋ庨L度和顏色也隨小孢子發(fā)育而產生變化，3 個供試青稞材料的總體趨勢一致。該結果有助于提高青稞花藥和小孢子離體培養(yǎng)時小孢子取材的準確性和效率。

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（本文責編：鄭立龍）