斑葉蘭的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究

摘要：應(yīng)用組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)對(duì)斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）芽的誘導(dǎo)和叢生芽的增殖復(fù)壯進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的提高，斑葉蘭芽增殖率上升，以6-BA 4.0 mg/L處理的增殖率最高;添加6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L可將斑葉蘭增殖控制在叢生芽階段;添加100.0 g/L椰汁和0.5 g/L活性炭有利于提高斑葉蘭增殖率與叢生芽的生長(zhǎng)勢(shì)，降低褐化;添加IBA 0.5 mg/L+NAA ? 0.5 mg/L+活性炭 0.5 g/L的1/2 MS基本培養(yǎng)基有助于斑葉蘭生根且根系生長(zhǎng)健壯。

關(guān)鍵詞：斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）;組織培養(yǎng);增殖;生根

中圖分類號(hào)：Q943.1;S682.31 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）15-0155-04

Abstract： Rapid multiplication and tissure culture were used to study the induction of buds and the proliferation and rejuvenation of cluster buds of Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.. The results showed that with the increase of 6-BA concentration， the shoot proliferation rate increased， and a maximum of proliferation was obtained at 4.0 mg/L 6-BA， and multiplication of shoots could be achieved and controlled by combination of 6-BA 4.0 mg/L and NAA 0.2 mg/L. The rate of muhiplieation and growth could be improved in media supplemented 100.0 g/L coconut juice（CJ） and 0.5 g/L activated charcoal（AC）. Rooting of shoots were developed in 1/2 MS media with 0.5 mg/L IBA， 0.5 mg/L NAA and 0.5 g/LAC.

Key words： Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.; tissue culture; multiplication; rooting

斑葉蘭（Goodyera schlechtendaliana Rchh. f.）又名小葉青、銀線蓮，蘭科斑葉蘭屬（Goodyera），多年生草本植物，高20 cm左右，生于海拔500～2 800 m的山坡或溝谷常綠闊葉林下，喜陰蔽濕潤(rùn)環(huán)境[1]。斑葉蘭具有較高的藥用價(jià)值，以全草入藥，性寒，味淡;清肺止咳，解毒消腫，活血止痛，軟堅(jiān)散結(jié);在臨床用于治療肺結(jié)核、咳嗽、支氣管炎、毒蛇咬傷、癰癤瘡瘍、鼻癤等疾病[2]。另外，斑葉蘭葉片十分精美，有寶石蘭之稱，可小盆栽植放于案上，或做假山、園林的點(diǎn)綴陪襯植物[3]。斑葉蘭植物用途廣泛，藥效顯著，藥農(nóng)大肆采掘，使之處于瀕危境地。斑葉蘭的繁殖一般采用分株法，在自然條件下其繁殖系數(shù)極低，一般年繁殖系數(shù)在2左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。國(guó)內(nèi)外對(duì)斑葉蘭的組織培養(yǎng)報(bào)道較少[4-8]，均處于試驗(yàn)階段。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖斑葉蘭，并運(yùn)用無(wú)土栽培等農(nóng)業(yè)新技術(shù)，使野生斑葉蘭變家種，有效保護(hù)野生資源，解決中藥材來(lái)源匱乏的問(wèn)題，滿足人們用藥需要，對(duì)發(fā)展中國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料斑葉蘭為野生馴化種，取自湖北鶴峰木林子自然保護(hù)區(qū)。

以Monnier、1/2MS、White[9]為基本培養(yǎng)基，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用細(xì)胞分裂素6-BA（6 -benzylaminopurine）、激動(dòng)素KT（6-Furfurylamino-purine）、吲哚-3-乙酸IAA（indole-3-acetic acid）、3-吲哚丁酸IBA（3-indolebutyric acid）、萘乙酸NAA（1-naphthlcetic acid），添加物蔗糖、香蕉泥（BJ）、椰子汁（CJ）、活性炭（AC）均為市售，瓊脂購(gòu)自海南省瓊海市長(zhǎng)青瓊脂廠，pH為5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

取當(dāng)年生5～6 cm斑葉蘭幼苗，流水沖洗1 h，剝?nèi)ド喜咳~片，洗凈，切成1～2 cm長(zhǎng)的莖段，用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒8 min，用無(wú)菌水沖洗4～5次，將消毒好的莖段接入配制好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃，每日光照12 h，光照度2 000 lx，每30 d繼代1次[6]。比較基本培養(yǎng)基、附加有機(jī)成份、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其配比對(duì)斑葉蘭叢生芽的誘導(dǎo)、增殖和植株生根率的影響。其中，基本培養(yǎng)基分別為Monnier、1/2MS和White[9]，在3種基本培養(yǎng)基中均添加1.0 mg/L ?6-BA、0.2 mg/L NAA、30.0 g/L蔗糖、6.5 g/L（pH 5.8）瓊脂;增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，分別附加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、香蕉汁（BJ）、椰汁（CJ）和活性炭（AC）等處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)斑葉蘭芽誘導(dǎo)的影響

將相同數(shù)量的斑葉蘭莖段分別接種在不同的基本培養(yǎng)基上，觀察不同時(shí)間點(diǎn)的褐化數(shù)及出芽數(shù)，結(jié)果表明，離體幼芽在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)發(fā)育情況存在很大差異，其中1/2MS基本培養(yǎng)基對(duì)幼芽的誘導(dǎo)最好。由表1可見(jiàn)，在Monnier培養(yǎng)基中培養(yǎng) ? 15 d，40%幼芽褐化死亡，培養(yǎng)30 d，90%幼芽褐化死亡，10%幼芽萌發(fā)1～2個(gè)側(cè)芽;在White培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，50%的幼芽褐化死亡，培養(yǎng)30 d，幼芽全部褐化死亡，出芽率為0;在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，15%的幼芽褐化死亡，25%的幼芽萌發(fā)側(cè)芽，培養(yǎng)30 d時(shí)，50%的幼芽萌發(fā)側(cè)芽，其余幼芽基本不生長(zhǎng)。

2.2 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)斑葉蘭芽增殖的影響

將相同數(shù)量的斑葉蘭幼芽分別接種在不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2 MS+0.5 g/L活性炭基本培養(yǎng)基上，觀察其對(duì)斑葉蘭芽增殖及生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)果表明，在添加不同濃度的6-BA、KT和NAA、IAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d均能生成叢生芽，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)叢生芽不斷增殖，但增殖率和叢生芽生長(zhǎng)狀況有顯著差異。由表2可見(jiàn)，8個(gè)處理中，保持NAA濃度為0.2 mg/L，調(diào)整6-BA和KT的濃度，當(dāng)6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，斑葉蘭增殖率最高，培養(yǎng)20 d增殖率達(dá)370%，30 d即達(dá)445%，叢生芽生長(zhǎng)較粗壯，顏色呈濃綠色;當(dāng)KT濃度為4.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)30d增殖率達(dá)220%，但叢生芽較細(xì)弱，顏色黃綠，不如添加6-BA的效果好。而在保持IAA濃度為0.2 mg/L的基礎(chǔ)上添加不同濃度的6-BA和KT時(shí)，同樣是6-BA對(duì)斑葉蘭叢生芽增殖及生長(zhǎng)勢(shì)影響較好。

2.3 培養(yǎng)基中添加香蕉汁和椰汁對(duì)斑葉蘭叢生芽增殖的影響

將相同數(shù)量的斑葉蘭叢生芽分別接種在添加活性炭（AC）、香蕉汁（BJ）和椰汁（CJ）的1/2MS增殖培養(yǎng)基上[10]，觀察其對(duì)斑葉蘭增殖及生長(zhǎng)勢(shì)的影響。由表3可知，在只添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑而不加有機(jī)添加物的1/2MS培養(yǎng)基上，繼代5次后斑葉蘭叢生芽逐漸發(fā)黃且細(xì)弱，甚至部分斑葉蘭叢生芽逐漸發(fā)黑壞死，并且培養(yǎng)基變紅，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重;在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L活性炭（AC），培養(yǎng)30 d后可以適當(dāng)改善叢生芽細(xì)弱的狀況及降低褐化現(xiàn)象，但斑葉蘭增殖率有所下降，緣于活性炭有吸附作用，在吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)也吸附了部分植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;在培養(yǎng)基中添加100.0 g/L 椰汁（CJ），斑葉蘭叢生芽逐漸轉(zhuǎn)綠且增殖率提高，達(dá)450%，但培養(yǎng)基仍然變紅;而當(dāng)在培養(yǎng)基中同時(shí)添加100.0 g/L椰汁（CJ）和0.5 g/L活性炭（AC）時(shí)，苗色恢復(fù)正常且逐漸復(fù)壯，叢生芽增殖率達(dá)470%，培養(yǎng)基不再發(fā)紅，褐化現(xiàn)象得到解決，添加香蕉汁的效果不如椰汁。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)斑葉蘭試管苗生根的影響

將2 cm左右生長(zhǎng)粗壯的斑葉蘭叢生芽分切成單株接種到添加不同濃度NAA、IBA、活性炭配比的1/2 MS+椰汁100.0 g/L基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，斑葉蘭試管苗生根結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，單株苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后開(kāi)始生根，同時(shí)植株也在長(zhǎng)高，培養(yǎng)30 d后可長(zhǎng)成完整植株。結(jié)果表明，單株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培養(yǎng)基上斑葉蘭試管苗生根率最高，且每株苗上的生根數(shù)量最多，根也比較粗壯，易移栽成活。在添加NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培養(yǎng)基上，斑葉蘭試管苗生根情況與生長(zhǎng)狀況無(wú)顯著差異，而在僅添加IBA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上斑葉蘭試管苗生根率只有50%，并且根細(xì)弱。

2.5 生根苗的移栽技術(shù)

生根苗的移栽需要選擇通氣性好、保濕性好的栽培基質(zhì)，可選細(xì)砂∶腐葉土∶珍珠巖=1∶1∶1作為栽培基質(zhì)。在移栽時(shí)，將已生根的組培苗移出培養(yǎng)室置于遮陽(yáng)網(wǎng)下揭蓋煉苗，使其適應(yīng)外界環(huán)境，2 d后將小苗取出，洗凈根部瓊脂，水苔需進(jìn)行消毒，小苗移栽后，澆透水，蓋膜及遮陽(yáng)網(wǎng)保濕1周，后3 d每天將膜揭開(kāi)一半通風(fēng)1 h，移栽成活率達(dá)90%以上[11]。15～30 ℃是斑葉蘭生長(zhǎng)的適宜溫度，夏季高溫要加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，35 ℃以上會(huì)生長(zhǎng)不良，可用濕簾風(fēng)機(jī)進(jìn)行降溫，冬季5 ℃以下的低溫會(huì)影響植株正常越冬，因此，在冬季溫度低于5 ℃的地區(qū)栽植斑葉蘭必須采取加溫和保溫措施。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)組織培養(yǎng)建立無(wú)菌繁殖體系是蘭科植物快速繁殖常用的方法，但前人對(duì)斑葉蘭屬植物的組織培養(yǎng)技術(shù)研究較少，均處于試驗(yàn)階段，肖波等[5]的大花斑葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)研究主要利用種子萌發(fā)建立無(wú)菌性，本研究更測(cè)重于對(duì)斑葉蘭工廠化快速繁殖技術(shù)的研究。選取斑葉蘭莖段作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)能保證母株性狀，研究了3種不同基本培養(yǎng)基對(duì)斑葉蘭芽誘導(dǎo)的褐化情況及誘導(dǎo)率，在1/2 MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d斑葉蘭芽誘導(dǎo)率可達(dá)50%，褐化率也最低。在1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加濃度為4.0 mg/L的6-BA與0.2 mg/L的NAA既能取得最佳增殖效果，也能使小苗生長(zhǎng)最健壯，葉色最正常。運(yùn)用KT會(huì)導(dǎo)致苗基部產(chǎn)生無(wú)效愈傷，從而降低增殖率。

在斑葉蘭芽增殖繼代多次后，對(duì)出現(xiàn)的叢生芽細(xì)弱問(wèn)題進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)超過(guò)5次后叢生芽變細(xì)弱，需要在增殖培養(yǎng)基中增加100.0 g/L椰汁以促使幼芽復(fù)壯，有利于改善工廠化大量繁殖時(shí)苗細(xì)弱導(dǎo)致移植室外成活率低的問(wèn)題?；钚蕴繉?duì)于改善斑葉蘭離體培養(yǎng)褐化有效果，以 0.5 g/L的濃度為佳。

單株苗在添加NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L的1/2MS基本培養(yǎng)基上斑葉蘭生根率最高，且每株苗上生的根數(shù)量最多，根也比較粗壯，易移載成活，這與高麗等[8]的高斑葉蘭生根試驗(yàn)結(jié)果相似。試管苗煉苗移栽是解決斑葉蘭從異養(yǎng)到自養(yǎng)過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)，操作要規(guī)范且仔細(xì)，出瓶進(jìn)入基質(zhì)前必須洗凈苗基部的殘余培養(yǎng)基，以防爛苗，煉苗過(guò)程中要注意保濕、保溫和適當(dāng)光照。

利用離體快繁珍稀瀕危植物，解決了斑葉蘭自然繁殖率低、市場(chǎng)供不應(yīng)求的局面，降低了用藥成本，同時(shí)也保護(hù)了野生資源，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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