基于葉綠體matK基因序列的兩份安康野生桑遺傳特征分析

王瑞嫻 楚渠 彭云武

摘要：對陜西省安康市黃石灘、八仙鎮(zhèn)2份野生桑葉綠體基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得matK編碼基因及其側(cè)翼序列，擴(kuò)增長度為1 715 bp，ORF長度為1 518 bp，2份序列僅存在1處單堿基差異。利用matK序列分析7份桑樹（Morus alba L.）之間的遺傳多樣性，結(jié)果表明，不同品種桑樹matK序列相似度較高，僅存在6個(gè)單位點(diǎn)堿基差異，定義3種單倍體，單倍型多樣度為0.714，核苷酸多樣度為0.001 32，平均核苷酸差異為2.000。遺傳距離分析表明，八仙鎮(zhèn)桑樹與印度桑（M. indica）、魯桑（M. multicaulis）的遺傳距離最近，黃石灘桑樹與蒙桑（M. mongolica）、華桑（M. cathayana）的遺傳距離最近。聚類分析將7份桑樹聚為1支，且桑樹品種之間的進(jìn)化支長要明顯短于其他科屬之間的長度，表明桑樹品種間的遺傳多樣性較低，經(jīng)歷較少進(jìn)化事件。

關(guān)鍵詞：桑樹（Morus alba L.）;進(jìn)化分析;遺傳多樣性;葉綠體;matK

中圖分類號：S888.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0151-04

Abstract： The matK gene sequences of two wild mulberry that collected form Huangshitan and Baxian town （Ankang city， Shaanxi province） have been obtained by PCR. The length of amplified sequences is 1 715 bp while the ORF is 1 518 bp. Only one base difference when compared with each other. The genetic variations of 7 mulberry have been analyzed with the matK genes. The results showed that 6 variable sites were detected， which defined 3 haplotypes in Morus alba， and the haplotype diversity was 0.714. The nucleotide diversity was 0.001 32 and the average nucleotide difference was 2.000 respectively. As for the genetic distances， Baxian was closer to M. indica and M. multicaulis， while Huangshitan was closer to M. mongolica and M. cathayana. Cluster analysis demonstrated that the seven mulberries were grouped together， and the branch was shorter than other species， implied lower genetic diversity and fewer evolutionary events proceeded.

Key words： Morus alba L.; phylogenetic analysis; genetic diversity; chloroplast; matK

桑樹（Morus alba L.）是?？粕伲∕orus）的一種多年生落葉喬木或灌木。桑樹可作為某些菌類培養(yǎng)的良好代料，亦可防風(fēng)固沙，作為綠化和石漠化治理樹種，有很高的生態(tài)價(jià)值。桑葉是家蠶（Bombyx mori L.）惟一的飼料來源，可作為兔、羊、牛、豬等禽畜飼料添加物，同時(shí)也被開發(fā)成為諸多食品。中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的首批“藥食同源”食品中，桑葉名列其中[1-3]。中國是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一，目前保存桑樹種質(zhì)3 000余份，分屬15個(gè)種及4個(gè)變種，其中栽培種5個(gè)，野生種10個(gè)，是世界上桑種最多的國家[4]。對桑樹不同品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性進(jìn)行研究，對桑樹種質(zhì)資源收集、核心種質(zhì)保存及新品種選育均具有重要意義。

葉綠體是大多數(shù)高等植物必不可少的細(xì)胞器，葉綠體基因組（cpDNA）編碼110～130個(gè)基因[5]，其中matK（maturase kinase）編碼一種RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子剪切的成熟酶，是葉綠體基因組中進(jìn)化最快的編碼基因之一[6，7]。相對于cpDNA中其他基因序列，matK具有較多的A-T堿基對，3′端相對保守，5′端則變異較快，可進(jìn)行植物科屬水平的系統(tǒng)發(fā)育研究，在植物屬及屬以下單位水平上為植物類群系統(tǒng)重建等工作提供較高的支持率[8，9]，在2009年被生命條形碼聯(lián)盟（CBOL）植物工作組人員列為DNA條形碼鑒定的核心序列之一[10]。滕艷芬等[11]通過分析屬間及5種藥典收載石斛種間的葉綠體matK基因序列，將不同屬及不同種間的正品與混淆品區(qū)分開，因此，matK基因序列可用于地道藥材的鑒別;劉靜等[12]分析了12種藥用石斛及密花石豆蘭的matK序列，比較其遺傳距離和堿基差異，認(rèn)為matK基因可以在分子水平對石斛不同種及變種進(jìn)行鑒別，可作為石斛屬植物的分子標(biāo)記。

桑樹matK基因研究已有報(bào)道，趙衛(wèi)國等[13]通過對2份桑品種的葉綠體trnL-trnF基因間隔區(qū)序列進(jìn)行研究，得出兩者的同源性很高，且與菊科、薔薇科等都具有同源性;汪偉等[14]對關(guān)于桑樹 ?trnL內(nèi)含子序列的分子系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究，得出桑樹為單系的結(jié)論;王暉等[15]對桑樹 matK基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;Kong等[16，17]利用葉綠體基因組對蒙桑（M. mongolica）、華桑（M. cathayana）和魯桑（M. multicaulis）等品種進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。

本研究從2份安康市野生桑葉中提取全基因組，擴(kuò)增測序獲得葉綠體matK序列，分析其序列特征，并分析桑樹遺傳聚類關(guān)系，從DNA水平上對桑樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行鑒定，為桑樹品種重要農(nóng)藝性狀的基因發(fā)掘與利用提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桑樹

2份野生桑分別采集自陜西省安康市八仙鎮(zhèn)（8xian）和黃石灘（HST）。新鮮桑葉表面用乙醇消毒后置于硅膠上快速干燥，超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

采用SDS-CTAB法提取總DNA。稱取0.50 g干燥葉片，液氮研磨成粉末后，迅速加入DNA提取液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，pH 8.0），混勻，65 ℃孵育45 min;冷卻至室溫，加入苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）的混合液500 μL，混勻;4 ℃，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌離心管中，加2倍體積沉淀液，室溫下孵育60 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min;-20 ℃放置15 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min;用350 μL NaCl （1.2 mol/L）溶液溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，加350 μL氯仿，混勻;4 ℃， ? 12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌離心管，加0.6倍體積異戊醇，充分混勻;4 ℃， ? 13 000 r/min離心15 min，棄上清液;70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫干燥后，將DNA溶解在100 μL去離子水中;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 序列擴(kuò)增和測序

根據(jù)GenBank中桑樹葉綠體基因組序列（登錄號NC_025772.2）設(shè)計(jì)引物。上游引物序列為5′-TGGTGCAGGAACAGGATGAAC-3′，下游引物序列為5′-GAGACCADTACTTGCTTTCAG-3′。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系總體積50 μL，含20 ng/μL總DNA模板1.0 μL，10×PCR緩沖液5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，2 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL高保真聚合酶1.0 μL，ddH2O 35.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性 40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切取目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒（OMEGA Gel Extraction Kit，美國）回收和純化核酸片段，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行?；厥斋@得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格目的條帶應(yīng)表現(xiàn)單一、清晰。檢測合格之后的PCR回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從GenBank中獲得蒙桑、川桑（M. notabilis）、魯桑等桑樹葉綠體matK基因序列。利用MUSLE軟件包進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列的同源性比對和相似性分析;采用DNAsp統(tǒng)計(jì)單倍型，計(jì)算單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性、平均核苷酸差異、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等群體遺傳學(xué)參數(shù);采用MEGA6.0軟件以鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，參數(shù)為Bootstrap=1 000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉形態(tài)和序列擴(kuò)增

八仙鎮(zhèn)同株桑葉有全葉和裂葉之分，葉尖呈長尾狀，葉基為深心形，葉緣銳鋸齒，葉面粗糙有毛。黃石灘桑葉多裂，葉尖呈尾狀，葉基為深心形，葉緣銳鋸齒，葉面平滑有光澤（圖1）。利用所設(shè)計(jì)的引物，以桑葉基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過克隆和測序分析，擴(kuò)增序列長1 715 bp，其中包含長度為1 518 bp的ORF框，ORF的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖2），ORF框編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析表明其中含有1個(gè)名為matK的保守結(jié)構(gòu)域，表明擴(kuò)增序列為桑樹葉綠體matK基因的開放閱讀框及其側(cè)翼序列。

2.2 序列比對

編碼序列比對表明，黃石灘和八仙鎮(zhèn)桑樹matK擴(kuò)增序列僅在ORF框內(nèi)660 bp處存在1個(gè)單核苷酸位點(diǎn)差異，其中黃石灘桑樹為胞嘧啶堿基，八仙鎮(zhèn)桑樹為胸腺嘧啶堿基。將擴(kuò)增獲得的matK基因編碼序列與其他5份桑樹的同源序列進(jìn)行聯(lián)配比對和遺傳多樣性分析（圖2），結(jié)果表明，matK基因在不同桑樹之間表現(xiàn)出高度一致性，僅在558、660、716、795、1 188、1 294等6個(gè)單堿基位點(diǎn)上出現(xiàn)差異，未出現(xiàn)插入或缺失等變異，核苷酸多樣度π為0.001 32，平均核苷酸差異k為2.000，7份桑樹matK基因共定義3種單倍型，單倍型多樣度為0.714，其中川桑定義1種單倍型，蒙桑、華桑和黃石灘桑樹種共享1種單倍型，印度桑（M. indica）、魯桑和八仙鎮(zhèn)桑樹種共享另一種單倍型。

2.3 遺傳距離和進(jìn)化分析

從數(shù)據(jù)庫中下載不同種屬的代表性matK序列，與桑樹matK序列一起計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，不同桑樹品種間的遺傳距離為0.000 00～0.003 96。八仙鎮(zhèn)桑樹與印度桑、魯桑的遺傳距離最近，與川桑遺傳距離較遠(yuǎn)，黃石灘桑樹與蒙桑、華桑的遺傳距離最近，與川桑遺傳距離較遠(yuǎn)（表1）。進(jìn)化樹聚類表明，不同科屬植物分別聚類，其中本研究中2份桑樹與其他5份桑樹聚為一支，同時(shí)桑樹品種間的進(jìn)化支長要明顯短于其他科屬間的長度，表明桑樹品種間的遺傳多樣性較低，經(jīng)歷較少進(jìn)化事件（圖3）。

3 小結(jié)

本研究在2份安康野生桑樹葉綠體中擴(kuò)增得到matK編碼基因及其兩側(cè)部分序列，2份桑樹matK序列僅存在1處堿基差異，并利用該序列分析桑樹間的遺傳多樣性。結(jié)果表明，不同品種桑樹的matK序列僅在6個(gè)位點(diǎn)上存在單堿基差異，品種間的序列相似性水平較高，進(jìn)化和遺傳距離分析表明2份桑樹獲得的序列與其他5份桑樹聚為一支，分別與印度桑、華桑等親緣關(guān)系最為接近，表明本研究中采用的桑樹可能是眾多桑樹資源中新的桑樹品種。進(jìn)化分析還表明，桑樹品種間較其他科屬植物經(jīng)歷了較少的進(jìn)化時(shí)間。考慮到不同桑樹品種間matK序列的高度相似性，matK序列并不能很好地區(qū)分桑樹品種之間的進(jìn)化關(guān)系，因此在后續(xù)研究中采用葉綠體全基因組的分析，可能更有利于分析桑樹的遺傳多樣性、分類及進(jìn)化關(guān)系。

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